黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料生產(chǎn)工藝研究

衡洋洋,周志磊,3,陳超,宋亞玲,庫(kù)進(jìn)良,姬中偉,3,毛健,3,5*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)3(江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,浙江 紹興,312000)4(北京同仁堂健康藥業(yè)(青海)有限公司,青海 德令哈,817000)5(國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江 紹興,312000)

黑果枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)的具有補(bǔ)益功能的名貴中藏藥材,是青海、新疆、甘肅等省的重要經(jīng)濟(jì)作物,是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的重要途徑。黑果枸杞富含花青素、原花青素、多糖和微量元素,是花青素含量最高的漿果之一,有“花青素之王”的美譽(yù)[1],而花青素是最有效的天然自由基清除劑,易溶于水。此外黑果枸杞還具有一定的保健功能,如:抗氧化、抗疲勞、護(hù)肝和提高免疫力等[2-3]。

近年來(lái),隨著全國(guó)種植熱潮的興起和人工培育技術(shù)的發(fā)展,黑果枸杞種植面積和產(chǎn)量逐年增加,但價(jià)格逐漸下跌,影響了農(nóng)民種植的積極性和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。造成這一問(wèn)題的主要原因可能是黑果枸杞加工鏈條短,以果干等初加工產(chǎn)品為主。目前科研人員已經(jīng)進(jìn)行了一些深加工的探索,如:開(kāi)發(fā)黑果枸杞口服液、餅干、果酒、果醋和酸奶等[4-5],黑果枸杞深加工產(chǎn)品種類和產(chǎn)量逐漸增加,其中乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品受到人們的關(guān)注,原因主要是發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)酸,而花青素在pH<4時(shí)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定[6],所以乳酸菌發(fā)酵是提高花青素穩(wěn)定性的有效途徑之一。目前已有黑果枸杞在果蔬飲料[7]中應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道,其中黑果枸杞主要起到調(diào)節(jié)色澤的作用,有研究人員制備了黑果枸杞發(fā)酵飲料,發(fā)酵后花青素含量顯著增加[8]。但是飲料生產(chǎn)涉及灌裝、殺菌和儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié),過(guò)程中氧氣、光照和溫度等因素可能對(duì)花青素和原花青素含量造成不利影響。目前這方面未受到研究人員的重視,也未見(jiàn)如何避免黑果枸杞果汁加工及儲(chǔ)藏過(guò)程中花青素和原花青素?fù)p失的報(bào)道。

干酪乳桿菌是多種果蔬的自生菌,具有良好的耐酸性,可在pH 3.5左右生存,被廣泛用于食品發(fā)酵[9],其代謝產(chǎn)物(細(xì)菌素、生物活性多肽和短鏈脂肪酸等)可起到促進(jìn)腸道蠕動(dòng),提高腸道功能的作用[10],并且發(fā)酵產(chǎn)生乳酸,使飲料具有柔和的酸味,提高產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì),是黑果枸杞發(fā)酵的理想菌株。在MRS培養(yǎng)基中干酪乳桿菌增長(zhǎng)速度快,由于其成本較高,且容易影響飲料風(fēng)味,不宜用作擴(kuò)培培養(yǎng)基,所以需要開(kāi)發(fā)以食品原料為基礎(chǔ)的菌種擴(kuò)培培養(yǎng)基。本研究以黑果枸杞為原料,以干酪乳桿菌為發(fā)酵菌株,以減少花青素和原花青素在加工過(guò)程中的損失率為主要目標(biāo),重點(diǎn)對(duì)酶解條件、擴(kuò)培培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和殺菌條件進(jìn)行優(yōu)化,以期得到花青素和原花青素保留率高,口感好的黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料生產(chǎn)工藝,為黑果枸杞產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞,北京同仁堂健康藥業(yè)(青海)有限公司提供;干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)MYT,江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源和信息中心(RWBL)保藏;NaOH、冰醋酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、Na2SO3、鹽酸、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙酸鈉、丙酮,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;原花青素(色譜純),合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;4-二甲氨基肉桂醛(色譜純),上海源葉生物科技有限公司,果膠酶(300 000 U/g)、纖維素酶(200 000 U/g)、無(wú)水葡萄糖,睢縣優(yōu)寶嘉食品有限公司;安佳脫脂乳粉,新西蘭恒天然集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC型紫外-可見(jiàn)光分光光度儀,上海美譜達(dá)儀器有限公司;MAX-190型酶標(biāo)儀,美國(guó)分子儀器公司;Vortex-2型渦流器,美國(guó)科學(xué)儀器公司;CF16XR-Ⅱ型離心機(jī),日本日立公司;IS-3型pH計(jì),上?？祪x儀器有限公司;BS-224S型分析天平,賽多利斯儀器設(shè)備制造有限公司;JPBJ-611Y型便攜式溶解氧測(cè)定儀,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,牛肉浸粉8,酵母浸粉4,葡萄糖20,K2HPO42,檸檬酸氫二銨2,乙酸鈉5,MgSO40.2,MnSO40.04,吐溫-80 1.0,pH 5.5～5.9,118 ℃滅菌15 min,固體培養(yǎng)基添加瓊脂15。

擴(kuò)培培養(yǎng)基(g/L):脫脂乳粉30,葡萄糖70,黑果枸杞汁80,調(diào)節(jié)pH 5.5～5.9,118 ℃滅菌15 min,其中黑果枸杞汁由枸杞干果1∶8(g∶mL)充分復(fù)水打漿制得。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

工藝流程如圖1所示。

圖1 黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料制作流程

操作要點(diǎn):

前處理:剔除壞果、雜質(zhì),選取色澤飽滿、無(wú)機(jī)械損傷的干枸杞,并清洗,90 ℃熱燙5 s,枸杞和水按照比例浸泡30 min,將浸泡過(guò)的枸杞打漿,得枸杞汁。

菌株活化:在無(wú)菌環(huán)境下,將保藏的菌種接種于MRS固體培養(yǎng)基上活化后,挑取平板上單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃下培養(yǎng)12 h,傳代2次,直至菌濃度達(dá)到108～1010CFU/mL。

菌株擴(kuò)培:將活化后的菌株以1%(體積分?jǐn)?shù),下同)的比例接種于擴(kuò)培培養(yǎng)基中,培養(yǎng)20～24 h,當(dāng)菌株濃度達(dá)到108～109CFU/mL時(shí),將此培養(yǎng)液以3%的比例接種于枸杞汁中進(jìn)行發(fā)酵。

過(guò)濾:將發(fā)酵液在5 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液,用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

灌裝:將過(guò)濾后的發(fā)酵液裝入容器中并封口。

殺菌、冷卻:將灌裝后的發(fā)酵液于85 ℃滅菌25 min,取出冷卻至常溫即獲得黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料。

1.4.2 酶解條件優(yōu)化

在37 ℃條件下,分別選取果膠酶2 g/L、纖維素酶2 g/L、果膠酶1 g/L+纖維素酶1 g/L,酶解3 h,進(jìn)行酶的種類優(yōu)化;選取果膠酶1 g/L+纖維素酶1 g/L,對(duì)酶解時(shí)間(0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 h)進(jìn)行優(yōu)化,分別考察各因素對(duì)黑果枸杞汁中花青素和原花青素含量的影響。

1.4.3 擴(kuò)培培養(yǎng)基優(yōu)化

氮源選用脫脂乳粉,碳源選用葡萄糖,生長(zhǎng)因子選用黑果枸杞汁(黑果枸杞汁制備方法同1.4節(jié))。在葡萄糖100 g/L+脫脂乳粉(10、30、50、70 g/L),葡萄糖(10、30、50、70、100、120 g/L)+脫脂乳粉100 g/L,葡萄糖100 g/L+脫脂乳粉100 g/L+生長(zhǎng)因子(20、40、60、80、100 g/L)的條件下,分別考察各因素對(duì)培養(yǎng)基中乳酸菌菌落總數(shù)的影響。

1.4.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

在料水比(1∶15、1∶30、1∶50、1∶100)(g∶mL,下同),接種量3%,37 ℃發(fā)酵12 h;料水比1∶30,接種量3%,37 ℃發(fā)酵(3、7、12、15、24、27 h)的條件下,分別考察各因素對(duì)黑果枸杞飲料的總酸、還原糖、花青素、原花青素和感官評(píng)分的影響。

1.4.5 殺菌工藝優(yōu)化

考察不同殺菌條件(75 ℃ 5～40 min、85 ℃ 5～30 min,以每5 min為一個(gè)梯度)[11],對(duì)花青素保留率、原花青素保留率以及色差(ΔΕ*)的影響。

1.4.6 指標(biāo)測(cè)定

總酸含量測(cè)定參照GB/T 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》;還原糖含量測(cè)定參照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測(cè)定 3,5-二硝基水楊酸比色法》;花青素含量測(cè)定采用pH示差法[12];原花青素含量測(cè)定采用4-二甲基氨基肉桂醛法[13];色差采用色差計(jì)測(cè)定[14]。

微生物指標(biāo)測(cè)定參照GB/T 4789.2—2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》、GB/T 4789.3—2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》、GB/T 4789.15—2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》

參考GB/T 7101—2022 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》中感官要求,邀請(qǐng)10名受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)員成立感官品評(píng)小組,從色澤、氣味、滋味和組織狀態(tài)4個(gè)方面對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià),取平均值作為產(chǎn)品的最終得分。感官評(píng)價(jià)細(xì)則如表1所示。

表1 感官評(píng)定表

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,GraphPad 8.0軟件繪圖,每個(gè)樣品測(cè)3次平行,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝優(yōu)化

黑果枸杞中約含有20%的果膠、纖維素等大分子物質(zhì),可能會(huì)影響出汁率和黑果枸杞汁中花青素和原花青素的含量,使用果膠酶和纖維素酶處理可以部分酶解黑果枸杞中的果膠、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)[15-16],不僅有利于促進(jìn)風(fēng)味和功能物質(zhì)的釋放,改善口感[17],還有利于后續(xù)的過(guò)濾和澄清。

2.1.1 酶種類對(duì)花青素和原花青素含量的影響

采用果膠酶和纖維素酶對(duì)黑果枸杞進(jìn)行處理,由圖2可知,酶解3 h后果汁中花青素和原花青素含量均顯著增加,這說(shuō)明果膠酶和纖維素酶均對(duì)功能成分的釋放有顯著的促進(jìn)作用,且果膠酶和纖維素酶共同酶解的效果優(yōu)于單酶,2種酶共同酶解后花青素含量179.75 mg/L,較未酶解提高了12.5%,原花青素含量63.86 mg/L,較未酶解提高了18.3%。這說(shuō)明2種酶共同作用對(duì)黑果枸杞中的大分子物質(zhì)(如果膠和纖維素等)酶解效果更好,有利于花青素和原花青素的溶出[18],所以最終選用果膠酶和纖維素共同酶解黑果枸杞汁。

a-花青素;b-原花青素

2.1.2 酶解時(shí)間

選用果膠酶和纖維素酶進(jìn)行復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3所示,隨著酶解時(shí)間的增加,花青素和原花青素含量均顯著增加,酶解3.5 h后,花青素含量達(dá)到最大值182.10 mg/L,原花青素含量在酶解3 h后沒(méi)有顯著差異(P>0.05),所以最終確定的酶解時(shí)間為3.5 h。

a-花青素;b-原花青素

2.2 擴(kuò)培培養(yǎng)基優(yōu)化

工業(yè)上多用20%～30%的脫脂乳培養(yǎng)基或者降低脫脂乳的含量(3%～5%)加入一定的碳源和生長(zhǎng)因子制備成復(fù)合培養(yǎng)基,相較之下復(fù)合培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富且成本低。因此本研究以脫脂乳粉為氮源,葡萄糖為碳源,枸杞汁為生長(zhǎng)因子,以菌落總數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得菌株生長(zhǎng)情況好、價(jià)格低廉且可以直接應(yīng)用于黑果枸杞飲料中的菌種擴(kuò)培培養(yǎng)基。

由圖4可知,隨著氮源、碳源和生長(zhǎng)因子添加量的增加,菌落總數(shù)呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì),最終確定培養(yǎng)基配方:脫脂乳粉30 g/L、葡萄糖70 g/L、枸杞汁80 g/L,經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在擴(kuò)培培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24 h后,乳酸菌菌落總數(shù)為1.8×109CFU/mL,與在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24 h后的菌落總數(shù)(2.1×109CFU/mL)相當(dāng),說(shuō)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基可以滿足干酪乳桿菌擴(kuò)培的要求。

a-脫脂乳粉;b-葡萄糖;c-枸杞汁

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 料水比

由圖5-a可知隨著水添加量的減少,總酸含量逐漸增加,說(shuō)明乳酸菌能很好的利用枸杞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)酸,但是總酸含量的增加導(dǎo)致pH降低,制約乳酸菌繼續(xù)生長(zhǎng)。雖然料水比1∶30和1∶15時(shí)花青素保留率及原花青素保留率沒(méi)有顯著性差異(圖5-b、圖5-c),但是料水比1∶30時(shí)酸度適宜(圖5-a),具有較好的口感(圖5-d),因此最終選擇的料水比為1∶30,這與閆世芳等[19]的結(jié)果一致,此時(shí)花青素保留率為112.48%,原花青素保留率為83.64%。值得注意的是原花青素的損失量基本與花青素的增加量相同,說(shuō)明有可能在發(fā)酵過(guò)程中有一部分原花青素降解為花青素,彌補(bǔ)了花青素的損失,所以導(dǎo)致花青素含量增加。

a-總酸;b-花青素;c-原花青素;d-感官評(píng)分

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間

由圖6-a可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,總酸含量呈現(xiàn)先增加后不變的趨勢(shì),還原糖含量呈現(xiàn)先降低后不變的趨勢(shì),這可能是由于乳酸菌發(fā)酵利用了枸杞中的還原糖,而乳酸的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致pH降低,從而抑制干酪乳桿菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致總酸含量不變。如圖6所示發(fā)酵過(guò)程中花青素含量先平穩(wěn)后增加,原花青素含量顯著降低,花青素的增加可能是由于發(fā)酵過(guò)程中的溶出以及原花青素在酸性條件下的分解[20]。在發(fā)酵過(guò)程中,總酸含量隨時(shí)間逐漸增長(zhǎng),經(jīng)感官評(píng)價(jià)小組評(píng)估,發(fā)酵15 h時(shí)酸度適宜,口感柔和,感官評(píng)分最高(圖6-c),因此選擇了發(fā)酵時(shí)間為15 h,最終總酸含量3.54 g/L。

a-總酸和還原糖;b-花青素和原花青素保留率;c-感官評(píng)分;d-花青素和原花青素含量

2.4 殺菌工藝優(yōu)化

殺菌是飲料生產(chǎn)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),其工藝參數(shù)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)和貨架期都有重要的影響[21]。殺菌時(shí)花青素和原花青素的損失程度除了受溫度和時(shí)間影響外,還受到光照、氧氣等其他因素的影響,但是這些因素很多時(shí)候沒(méi)有引起重視,所以本文對(duì)殺菌過(guò)程中氧氣和光照對(duì)花青素和原花青素保留率的影響進(jìn)行了研究。

2.4.1 溫度和時(shí)間

本研究制備的飲料pH<4,為酸性飲料,巴氏殺菌可滿足殺菌要求,由表2可知,75 ℃、30 min及85 ℃、25 min時(shí)菌落總數(shù)、霉菌和大腸桿菌均未檢出。隨著殺菌溫度和時(shí)間的增加,花青素和原花青素的保留率均顯著性降低,說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間高溫殺菌對(duì)花青素和原花青素的損傷較大,所以在選擇殺菌條件時(shí)應(yīng)盡量選擇較低的殺菌強(qiáng)度。隨著溫度和時(shí)間的增加,飲料色差增加,但ΔΕ*>3時(shí),肉眼才可以察覺(jué)到差異,即在本研究選擇的殺菌時(shí)間范圍內(nèi),由殺菌造成的色差影響均可接受。綜合以上結(jié)果,最終確定的殺菌參數(shù)為85 ℃加熱25 min,此時(shí)花青素保留率79.20%,原花青素保留率83.71%。

表2 黑果枸杞飲料不同殺菌條件下的理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)

2.4.2 光照強(qiáng)度

在優(yōu)選的殺菌條件下探究光照對(duì)飲料中花青素和原花青素保留率及色差的影響,結(jié)果如圖7所示,光照強(qiáng)度對(duì)原花青素保留率有顯著性影響,對(duì)花青素保留率和產(chǎn)品色差沒(méi)有顯著性影響。避光殺菌后原花青素保留率提高4.5%,說(shuō)明光照主要影響飲料中的原花青素含量,對(duì)花青素和產(chǎn)品色澤的影響較小,這可能是因?yàn)樵ㄇ嗨貙?duì)光照較敏感[22]。所以最終選擇在殺菌時(shí)避光。

a-花青素保留率;b-原花青素保留率;c-色差

2.4.3 氧氣含量

在優(yōu)選的殺菌條件下探究氧氣含量對(duì)飲料中花青素、原花青素和色差的影響,由圖8可知,發(fā)酵液中氧氣含量為6.0 mg/L。進(jìn)行梯度除氧后殺菌,結(jié)果表明,氧氣濃度對(duì)原花青素保留率和色差沒(méi)有顯著性影響,對(duì)花青素保留率有顯著影響,氧氣濃度越低,花青素保留率越高,在料液中氧氣含量低于0.5 mg/L時(shí),花青素保留率基本保持不變,此時(shí)花青素保留率較不除氧時(shí)提高4.8%,說(shuō)明氧氣含量主要影響飲料中的花青素含量,這可能是因?yàn)榛ㄇ嗨匾资苎鯕獾挠绊慬23]。所以在殺菌時(shí)控制料液中氧氣含量小于0.5 mg/L。

a-原花青素保留率;b-花青素保留率;c-色差

2.5 產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1 感官指標(biāo)

色澤:紫黑色,色澤均勻,有光澤;滋味和氣味:擁有黑果枸杞獨(dú)有的風(fēng)味和乳酸菌發(fā)酵的獨(dú)特香氣,酸甜適口,口感細(xì)膩;組織形態(tài):產(chǎn)品澄清透明,流動(dòng)性好,無(wú)肉眼可見(jiàn)的雜質(zhì)和沉淀。

2.5.2 理化指標(biāo)

黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料,離心沉淀率0.078%,產(chǎn)品穩(wěn)定性好。成品總酸含量3.54 g/L,還原糖含量4.73 g/L,花青素含量163.51 mg/L,原花青素含量54.90 mg/L。理化指標(biāo)符合GB/T 7101—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》及GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.3 微生物指標(biāo)

黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料微生物指標(biāo)符合GB/T 7101—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》及GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),致病菌未檢出。

3 總結(jié)與展望

本文主要研究了如何在黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料加工過(guò)程中減少花青素和原花青素的損失,通過(guò)對(duì)酶解條件、擴(kuò)培培養(yǎng)基、發(fā)酵工藝以及殺菌條件進(jìn)行優(yōu)化,得到了黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料的最優(yōu)生產(chǎn)工藝。酶解顯著提高了黑果枸杞汁中的花青素和原花青素含量,發(fā)酵顯著提高了花青素的含量和穩(wěn)定性,但是殺菌會(huì)造成花青素和原花青素的大量損失,通過(guò)優(yōu)化殺菌參數(shù)和控制環(huán)境因子,可以有效減少花青素和原花青素在殺菌過(guò)程中的損失。本研究利用干酪乳桿菌發(fā)酵制備的黑果枸杞飲料不僅口感柔和、風(fēng)味優(yōu)良,花青素和原花青素的保留率也得到了明顯的提高,后續(xù)將繼續(xù)研究黑果枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料儲(chǔ)藏過(guò)程中主要功能成分的含量變化及其保護(hù)技術(shù)。