菠蘿加工副產(chǎn)物-乳清蛋白混菌發(fā)酵條件的研究

羅迦蔚,肖珊,胡峣峣,彭雪穎,胡文鋒*

1(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院,廣東 廣州,510000)2(東莞理工學院 化學工程與能源技術學院,廣東 東莞,523808)

菠蘿又名鳳梨,其含有豐富的有機酸、氨基酸、維生素與礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,并且味道清甜、氣味芬芳[1]。菠蘿原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū),我國菠蘿的種植區(qū)域主要在廣東、廣西、福建、臺灣等地區(qū),是我國華南地區(qū)主要的外銷水果[2]。我國的菠蘿加工制品主要有菠蘿罐頭與菠蘿汁,在菠蘿加工過程中會產(chǎn)生大量的加工副產(chǎn)物,約占菠蘿總量的50%[3],其營養(yǎng)成分與菠蘿果肉基本相同[4]。如果菠蘿加工副產(chǎn)物不加以有效利用,不僅會造成資源的浪費,也會成為環(huán)境污染源之一。目前關于菠蘿加工副產(chǎn)物再利用方面的研究,主要集中在以其為原料提取多酚[5]和多糖[6]等活性成分,以及發(fā)酵制備果酒[7]、果醋[8]等發(fā)酵產(chǎn)品。

發(fā)酵是果蔬加工副產(chǎn)物再利用的最常用方法之一。微生物發(fā)酵可使果蔬加工副產(chǎn)物中的總酚、有機酸等活性物質(zhì)增加,并可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等酶的活力,也可賦予發(fā)酵產(chǎn)品更豐富的風味[9]。乳酸菌和酵母菌是果蔬發(fā)酵最常用的菌種,而且很多研究表明混菌發(fā)酵的效果更好[10-11]。在混合發(fā)酵過程中,酵母菌代謝可產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì),而這些營養(yǎng)物質(zhì)對乳酸菌的生長具有促進作用,同時酵母菌也能從乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物中獲得有益于生長繁殖的物質(zhì)與能量[12]。而利用土著菌混合發(fā)酵菠蘿及其加工副產(chǎn)物的研究還鮮有報道。

由于菠蘿加工副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量較低,添加蛋白質(zhì)可以提高發(fā)酵體系的蛋白質(zhì)含量,有利于發(fā)酵的進行。乳清蛋白是奶酪加工的副產(chǎn)物之一,有研究表明其在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種生物活性肽,具有抗氧化、提高機體免疫力等多種保健功能[13]。本實驗利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵添加了乳清蛋白的菠蘿加工副產(chǎn)物,分別以發(fā)酵產(chǎn)品中的總酚含量和SOD酶活力為指標對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,并對發(fā)酵產(chǎn)品中的有機酸含量進行分析,以探究土著菌對果蔬發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿,市售;乳酸菌和酵母菌,實驗室從菠蘿果肉中篩選,經(jīng)鑒定為乳酸乳球菌(LactococcuslactisLA5)和仙人掌有孢漢遜酵母(HanseniasporaopuntiaeSA2);YPD液體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;Folin-Ciocalteu試劑、SOD活性檢測試劑盒、沒食子酸(標準品),北京索萊寶科技有限公司;乳清蛋白,上海源葉生物有限公司;有機酸標準溶液、甲醇(色譜級),上海阿拉丁生化科技有限公司;NaOH、HCl溶液(均為食品級),諾爾化工有限公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Evolution 260分光光度計,美國賽默飛世爾科技公司;Spark 10M多功能酶標儀,瑞士帝肯公司;ZQZY-78BV振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海坤天實驗室儀器有限公司;HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州澳華儀器有限公司;壓力蒸汽滅菌器,上海三申醫(yī)療器械有限公司;1260高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

選取新鮮菠蘿→榨汁→收集菠蘿加工副產(chǎn)物→添加蛋白→調(diào)節(jié)pH→65 ℃水浴15 min→加入酵母菌與乳酸菌→發(fā)酵→得發(fā)酵液→冷凍干燥48 h→菠蘿加工副產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)品

1.3.2 發(fā)酵菌種子液的制備

將乳酸菌與酵母菌分別接入MRS與YPD液體培養(yǎng)基中。應用MRS和YPD液體培養(yǎng)基對乳酸菌和酵母菌進行活化復壯,然后培養(yǎng)14 h作為種子液。

1.3.3 菠蘿預處理

將采購的新鮮菠蘿去皮后榨汁,對榨汁后的殘渣即菠蘿加工副產(chǎn)物進行收集。按一定的質(zhì)量比例加入蒸餾水,與菠蘿加工副產(chǎn)物進行攪拌混合成果漿后,添加乳清蛋白,用1 mol/L NaOH溶液與1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH,之后置于65 ℃熱水中水浴滅菌15 min。冷卻后在無菌條件下接種活化后的乳酸菌與酵母菌,置于培養(yǎng)箱內(nèi)暗處靜置發(fā)酵。發(fā)酵結束后收集發(fā)酵液,冷凍干燥48 h后得到菠蘿加工副產(chǎn)物-乳清蛋白發(fā)酵產(chǎn)品。

1.3.4 發(fā)酵配方與發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗設計

研究不同梯度的菠蘿加工副產(chǎn)物添加量(30%、40%、50%、60%和70%)、乳清蛋白添加量(1.0%、1.4%、1.8%、2.2%和2.6%)、初始pH(3.0、3.5、4.5、5和5.5)對發(fā)酵產(chǎn)品的SOD酶活力與總酚含量的影響,進而對發(fā)酵配方進行優(yōu)化。同時研究不同梯度的發(fā)酵時間(12、18、24、30和36 h)、發(fā)酵溫度(5、30、35、40和45 ℃)、乳酸菌接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)、發(fā)酵菌種接種比例(7∶1、6∶1、5∶1、4∶1和3∶1)對發(fā)酵產(chǎn)品中總酚含量與SOD酶活力的影響,對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。單因素變化時,其他發(fā)酵參數(shù)固定,菠蘿加工副產(chǎn)物添加量設為50%,乳清蛋白添加量設為1.8%,乳酸菌與酵母菌的接種比例設為5∶1,乳酸菌的接種量設為2%(體積分數(shù)),發(fā)酵初始pH設為4.5,發(fā)酵時間設為24 h。

1.3.5 指標測定

SOD酶活力的測定參照試劑盒說明書的步驟進行;總酚含量的測定參照夏國燈等[14]的方法略作修改,結果以每克樣品中所含的沒食子酸的量(gallic acid equivalent, GAE)表示(mg GAE/g);有機酸的測定采用液相色譜法[15],通過高效液相色譜系統(tǒng)與紫外檢測器進行測定,有機酸的含量以mg/g表示。

1.3.6 發(fā)酵配方正交優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素試驗篩選出最佳菠蘿副產(chǎn)物添加量、乳清蛋白添加量、初始pH值,設計三因素三水平的L9(33)正交試驗,根據(jù)總酚含量進一步確定菠蘿加工副產(chǎn)物發(fā)酵的最優(yōu)配方。正交試驗各因素水平如表1所示。

表1 正交試驗設計表

1.3.7 發(fā)酵工藝響應面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果,對菠蘿加工副產(chǎn)物發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、乳酸菌接種量以及發(fā)酵菌接種比例4個因素進行四因素三水平Box-Benhnken Design試驗,以發(fā)酵產(chǎn)品中的SOD活力為響應值,以得到菠蘿加工副產(chǎn)物最優(yōu)發(fā)酵工藝。響應面實驗各因素水平如表2所示。

表2 Box-Behnken實驗因素和水平設計

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次實驗均進行3次重復操作,實驗數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析和圖表繪制采用Excel、Design-Expert11、SPSS 23和Origin軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

菠蘿加工副產(chǎn)物的添加量、乳清蛋白添加量、初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量、接種比例對發(fā)酵產(chǎn)品SOD活性與總酚含量的影響如圖1所示。結果表明,隨著菠蘿加工副產(chǎn)物添加量的增加,總酚含量與SOD活性隨之增加,當菠蘿加工副產(chǎn)物添加量為50%時,總酚含量達到最大值,為0.55 mg GAE/g,SOD活力也達到峰值,為149.84 U/g。當繼續(xù)增大菠蘿加工副產(chǎn)物添加量時,總酚與SOD活性則下降,這可能是由于隨著菠蘿加工副產(chǎn)物的增加,發(fā)酵培養(yǎng)基中糖含量增加,對微生物生長具有抑制作用[16]。

a-菠蘿加工副產(chǎn)物添加量;b-乳清蛋白添加量;c-初始pH;d-發(fā)酵時間;e-發(fā)酵溫度;f-乳酸菌接種量;g-乳酸菌∶酵母菌

隨著乳清蛋白添加量的增加,發(fā)酵體系中的SOD活性與總酚含量呈上升的趨勢。當乳清蛋白添加量為2.2%與2.6%時,發(fā)酵產(chǎn)品中總酚與SOD活力無顯著性差異。乳清蛋白添加量為2.6%時,SOD活性(155.80 U/g)和總酚含量(0.69 mg GAE/mL)達到峰值。綜合考慮,選擇乳清蛋白添加量1.8%～2.6%進行下一步的正交試驗。

如圖1-c所示,隨著初始pH值的增大,SOD活性與總酚含量呈先上升后下降的趨勢,當初始pH為5時,發(fā)酵體系中的SOD活力與總酚含量均達到最大值。當初始pH為5.5時,隨著初始pH的增大,SOD活性與總酚含量呈下降的趨勢。這可能是由于高的pH值抑制了乳酸菌與酵母菌的生長代謝,導致活性物質(zhì)的產(chǎn)量降低。

如圖1-d所示,隨著發(fā)酵時間的延長發(fā)酵液的總酚含量與SOD活力呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢,當發(fā)酵時間為24 h時,SOD活力與總酚含量達到最大值。當發(fā)酵時間大于24 h,總酚含量與SOD活性呈下降趨勢,這可能是由于發(fā)酵基質(zhì)的微生物數(shù)量增加導致的。

發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)物總酚含量及SOD活力的影響如圖1-e所示。隨著發(fā)酵溫度的增加,總酚含量與SOD活力呈先上升后下降的趨勢,當發(fā)酵溫度達到35 ℃時,SOD活力達到最大值為155.39 U/g,總酚含量同樣達到最大值為0.71 mg GAE/g。當發(fā)酵溫度過高時,SOD活力與總酚含量減少,這可能由于過高的發(fā)酵溫度抑制了乳酸菌與酵母菌的生長。

乳酸菌接種量對發(fā)酵產(chǎn)物SOD活力與總酚含量的影響如圖1-f所示。隨著乳酸菌接種量的增加,SOD活力與總酚含量呈先上升后下降的趨勢,當乳酸菌接種量為1.5%時,SOD活力達到最大值為154.74 U/g,總酚含量達到最大值為0.67 mg GAE/g,然而隨著乳酸菌接種量的增加兩者均呈下降的趨勢。這可能是由于接種量過大導致發(fā)酵產(chǎn)物減少。

發(fā)酵菌接種比例對發(fā)酵液SOD活力與總酚含量的影響如圖1-g所示。隨著乳酸菌接種比例的增大,發(fā)酵產(chǎn)品中SOD活力與總酚含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當乳酸菌∶酵母菌為6∶1時,SOD活力與總酚含量達到最大值。當繼續(xù)增大乳酸菌接種比例時,SOD活力與總酚含量呈現(xiàn)下降的趨勢,這可能是由于當接種比例不適宜時,混合菌種間相互競爭生長空間與養(yǎng)分,繼而導致微生物生長不佳,使次級代謝產(chǎn)物減少。

2.2 正交試驗設計及結果

根據(jù)單因素試驗結果設計正交試驗,在不同發(fā)酵配方下測定各組發(fā)酵產(chǎn)品的總酚含量,結果如表3所示。

表3 正交試驗結果

由極差R可知,各因素對混菌發(fā)酵菠蘿加工副產(chǎn)物中總酚含量的影響順序為乳清蛋白添加量(C)>初始pH(B)>加工副產(chǎn)物添加量(A)。根據(jù)k1、k2、k3可知,最優(yōu)發(fā)酵配方水平組合為A3B3C2,其總酚含量如表4所示,較優(yōu)化前提高了2.5倍,三者間存在顯著性差異,可確定最優(yōu)發(fā)酵配方為:菠蘿加工副產(chǎn)物添加量60%、乳清蛋白添加量2.6%、初始pH 5.0。

表4 正交試驗的驗證

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計與結果

根據(jù)單因素結果,進行響應面分析。響應面二次多項式回歸方程的方差分析結果如表5所示?？傻迷撃Ｐ偷腇=17.35,P<0.000 1,表明該模型極顯著;回歸系數(shù)R2=0.945 5,表明該模型能較好地對實驗的真實情況進行擬合,自變量與響應值之間的關系顯著,表明該模型可以用來分析與預測菠蘿加工副產(chǎn)物的最佳發(fā)酵工藝。由4個因素的F值可得出,各因素對菠蘿加工副產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)品中SOD活力的影響程度為:B(發(fā)酵溫度)>A(發(fā)酵時間)>C(乳酸菌接種量)>D(發(fā)酵菌接種比例)。

表5 回歸模型方差分析

2.3.2 響應面交互分析

根據(jù)響應面實驗設計原理,三維曲面彎曲程度越大,表明兩因素交互作用對響應值即SOD活力的影響越顯著。響應面實驗等高線圖為三維曲線在底部的投影,可以反映出因素之間交互相的強弱,為橢圓則表明兩因素之間交互作用顯著,呈圓形則與之相反,結果如圖2所示。

圖2 各因素交互作用對發(fā)酵產(chǎn)品中SOD酶活力影響的響應面圖

采用Design-Expert軟件,根據(jù)所建立的模型進行參數(shù)最優(yōu)化分析,得到最佳的發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間25.83 h,發(fā)酵溫度37.45 ℃,乳酸菌接種量1.6%,發(fā)酵菌接種比例為乳酸菌∶酵母菌=6.15∶1,在此條件下發(fā)酵產(chǎn)物的SOD活力為168.17 U/g。為了驗證實驗結果以便于實際操作,調(diào)整發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間26 h,發(fā)酵溫度37.5 ℃,乳酸菌接種量1.6%,發(fā)酵菌接種比例為乳酸菌∶酵母菌=6.2∶1。在此條件下,發(fā)酵產(chǎn)物的SOD活力為168.03 U/g,與理論值差異不顯著(P>0.05),表明可利用該模型對菠蘿加工副產(chǎn)物的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化,具有實際價值。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)品的理化指標

SOD與總酚是果蔬發(fā)酵產(chǎn)品中主要的活性物質(zhì)。采用最優(yōu)發(fā)酵工藝混菌發(fā)酵菠蘿加工副產(chǎn)物-乳清蛋白,將所得發(fā)酵產(chǎn)物與其他果蔬發(fā)酵產(chǎn)品進行了比較,如表6所示。菠蘿加工副產(chǎn)物-乳清蛋白發(fā)酵產(chǎn)品的SOD活力高于發(fā)酵菠蘿漿與香蕉酵素,較未發(fā)酵菠蘿提高1.95倍,但低于藍莓枸杞發(fā)酵果汁與藍靛果-沙棘發(fā)酵果汁;其總酚含量高于發(fā)酵菠蘿漿與蘋果梨酵素,較未發(fā)酵菠蘿提高了2.53倍,但低于草莓酵素、青梅酵素等發(fā)酵產(chǎn)品。這可能是由于選取的原料、發(fā)酵菌種以及處理方式的不同造成的。

表6 菠蘿加工副產(chǎn)物-乳清蛋白發(fā)酵產(chǎn)品與其他果蔬發(fā)酵類發(fā)酵產(chǎn)品的比較分析

有機酸是發(fā)酵產(chǎn)品的主要風味屬性來源,其組成和含量是影響發(fā)酵產(chǎn)品酸味的重要因素。由于有機酸具有降低腸道pH值和改善腸道菌群的作用,其在世界范圍內(nèi)被廣泛應用。表7顯示了菠蘿加工副產(chǎn)物發(fā)酵前后7種主要有機酸的變化。與發(fā)酵前相比,蘋果酸含量下降了63.49%,這與MENDES 等[21]的研究結果一致,可能是由于蘋果酸在發(fā)酵過程中容易被大多數(shù)微生物利用引起的;檸檬酸含量從2.91 mg/g下降到2.07 mg/g,可能是由于乳酸菌將檸檬酸作為底物,經(jīng)過三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)生乳酸、雙乙?；蚱渌镔|(zhì)而引起的[22]。與發(fā)酵前相比,總酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸和草酸的含量顯著增加,這與蘿卜腌制前后有機酸的變化趨勢一致[23]。如表7所示,乳酸(4.28 mg/g)和琥珀酸(3.51 mg/g)是發(fā)酵產(chǎn)物中的主要有機酸。乳酸通常是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的[24],而琥珀酸是酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種重要代謝產(chǎn)物[25]。

表7 菠蘿加工副產(chǎn)物-乳清蛋白發(fā)酵前后有機酸含量的變化

3 結論

本實驗利用從新鮮菠蘿中篩選的乳酸菌與酵母菌發(fā)酵添加了乳清蛋白的菠蘿加工副產(chǎn)物,對其發(fā)酵配方與發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。得到的最佳發(fā)酵條件為:菠蘿加工副產(chǎn)物添加量為60%,乳清蛋白添加量為2.6%,初始pH為5.0,發(fā)酵時間26 h,發(fā)酵溫度37.5 ℃,乳酸菌添加量1.6%、發(fā)酵菌接種比例為乳酸菌∶酵母菌=6.2∶1。在此發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)品中總酚含量為0.81 mg GAE/g,較未發(fā)酵前提高了2.53倍;發(fā)酵產(chǎn)品中SOD活力為168.02 U/g,較未發(fā)酵前提高了1.95倍;總酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸含量較發(fā)酵前均顯著提高。本研究為提高菠蘿加工副產(chǎn)物的利用率提供了一定的數(shù)據(jù)參考。