異常威克漢遜酵母與釀酒酵母不同接種方式對鴨梨酒品質(zhì)的影響

吳堯,鄧杰,2,張芮,鄧星成,黃治國,2,衛(wèi)春會,2*

1(四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)2(中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點實驗室,四川 宜賓,644000)

我國是世界第一產(chǎn)梨大國,梨是我國僅次于蘋果、柑橘的第三大水果[1-2]。鴨梨味美多汁,肉質(zhì)細膩,營養(yǎng)豐富,是釀造果酒的優(yōu)質(zhì)原料[3-4]。目前已有鴨梨酒產(chǎn)品投入市場,但由于產(chǎn)品存在易褐變、口味寡淡、香味不足等問題,以至于消費者認可度有待提高。因此,如何豐富鴨梨酒的風(fēng)味,提高鴨梨酒品質(zhì)是亟待解決的問題[5]。

近年來,多菌種混合發(fā)酵果酒受到研究人員的關(guān)注。非釀酒酵母在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種胞外酶,能代謝某些香味前體物質(zhì)產(chǎn)生酯類、酸類、醇類、萜烯類物質(zhì)等,對果酒增香、品質(zhì)提升有重要作用[6]。有學(xué)者[7-9]通過對鴨梨酒的發(fā)酵方式進行優(yōu)化來提升鴨梨酒質(zhì)量,目前有所成效。有學(xué)者[10-14]從梨酒及梨園土壤中分離出產(chǎn)香力強的釀酒酵母用于梨酒發(fā)酵,使得鴨梨酒風(fēng)味提升。梁麗紅等[15]為探討優(yōu)選非釀酒酵母混合發(fā)酵對干紅葡萄酒品質(zhì)的影響,采用耐熱克魯維酵母(Lachanceathermotolerans)與粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)進行混菌發(fā)酵,研究發(fā)現(xiàn)使用2種酵母進行接種發(fā)酵后酒中蘋果酸、乳酸含量顯著降低,中鏈脂肪酸乙酯、乳酸乙酯等的含量有所提高,能有效增加酒樣的花香與果香。但2種不同的菌株在發(fā)酵過程中可能會發(fā)生競爭營養(yǎng)或產(chǎn)生具有毒性的代謝產(chǎn)物抑制細胞生長等[16]。趙劍雷等[17]為研究異常威克漢遜酵母(Wickerhamomycesanomalus)與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的相互作用機制,將2種酵母進行混合發(fā)酵,結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵24 h后異常威克漢遜酵母的生長受到嚴重影響并出現(xiàn)自融和凋亡的現(xiàn)象,釀酒酵母生長未受影響。

因此,本試驗采用異常威克漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵鴨梨酒,通過分析2種酵母不同接種方式在鴨梨酒發(fā)酵過程中菌體數(shù)量的變化,并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)檢測不同酵母發(fā)酵的鴨梨酒揮發(fā)性成分,結(jié)合主成分分析及感官品評探究單菌發(fā)酵與混菌發(fā)酵對鴨梨酒品質(zhì)的影響,以期解決鴨梨酒香味寡淡等問題,為鴨梨酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:新鮮鴨梨(Yali),市售。菌種:威克漢遜酵母和釀酒酵母,釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室。

試劑:NaCl、葡萄糖、偏重亞硫酸鉀、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水揚酸、NaOH、苯酚,均為分析純,成都市科龍化工試劑廠。

儀器:HR1833飛利浦榨汁機,中國飛利浦公司;DH4000BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱,天津市泰斯特公司;Super Alcomat高精度數(shù)顯酒精濃度計,上海點將精密儀器有限公司;7890A-5975B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國 Agilent 公司;1500酶標儀,美國 Thermo 公司;WYT-ⅡA手持式糖量計折射儀,成都格納絲商貿(mào)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鴨梨酒釀造工藝流程

新鮮鴨梨→清洗、浸泡→去皮、去芯、去梗、切塊→榨汁→護色殺菌→調(diào)糖→接種→發(fā)酵→倒罐→陳釀→澄清、過濾→調(diào)整成分→精濾→灌裝→成品

操作要點:按85 mg/L加入偏重亞硫酸鉀作抑菌劑;用白砂糖調(diào)節(jié)初始糖度至22%;酵母接種量2%(體積分數(shù),下同);混合密封于26 ℃發(fā)酵8 d。

異常威克漢遜酵母活化:挑取平板上單菌落至酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,裝液量100 mL/250 mL,于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h(此時菌體數(shù)達到1×108CFU/mL)備用。

釀酒酵母活化:將活性干酵母接種至10倍體積的鴨梨汁中于30 ℃靜置培養(yǎng)30 min,再接種至10倍體積的鴨梨汁中靜置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度28 ℃,培養(yǎng)時間12 h(此時菌體數(shù)達到1×108CFU/mL)備用。

鴨梨酒混菌發(fā)酵是將釀酒酵母與異常威克漢遜酵母分別以2%的接種量接入處理過的鴨梨汁中進行混合發(fā)酵;以釀酒酵母和異常威克漢遜酵母純種發(fā)酵鴨梨汁作為對照。

1.2.2 酵母接種時間對鴨梨酒發(fā)酵的影響

釀酒酵母按2%的接種量接種于新鮮鴨梨汁中,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵0、24、48、72 h后分別加入2%異常威克漢遜酵母,分別檢測發(fā)酵液中2種酵母數(shù)量、總糖與酒精度,檢測方法參照張文文等[18]的檢測方法。

1.2.3 不同接種方式發(fā)酵鴨梨酒揮發(fā)性成分分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)頂空固相微萃取(head space solid phase microextraction,HS-SPME):取5 mL鴨梨酒于頂空瓶中,按0.15 g/mL加入NaCl,再加入50 μL乙酸正丁酯(8.4 g/L)作為內(nèi)標混勻,置于55 ℃的固相微萃取儀中平衡15 min,將老化后的固相微萃取針頭插入平衡后的樣品頂空萃取30 min。

色譜條件:色譜柱 DB WAX(60 m×0.25 mm,0.25 μm):載氣為高純He,流速1 mL/min,進樣口溫度230 ℃;采用不分流進樣模式;程序升溫:初始溫度為60 ℃保持2 min,然后以5 ℃/min的升溫速率升至90 ℃保持2 min,再以20 ℃/min的速率升至230 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:70 eV電子能量,全掃描質(zhì)量范圍(20～550) amu,離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃。

定量分析:計算如公式(1)所示:

Wi=fi×Ai/As×Ws

(1)

式中:Wi,揮發(fā)性風(fēng)味化合物質(zhì)量濃度,mg/L;Ws,加入內(nèi)標物質(zhì)質(zhì)量,μg;Ai,待測組分的峰面積;As,內(nèi)標物質(zhì)的峰面積;fi,待測組分對內(nèi)標物的質(zhì)量相對校正因子。

1.2.4 感官分析

鴨梨酒感官評分標準參照尹雪林等[19]的方法并稍作修改,評價小組由15位經(jīng)驗豐富的感官品評員組成(8名女性和7名男性,年齡25～40歲),鴨梨酒香氣描述詞匯為發(fā)酵香、果香、花香、甜香、清香,評分方式采用10分制,0分代表沒有聞到該香氣,9分表示該香氣強度很大。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 19.0軟件對所得的數(shù)據(jù)進行方差分析,并將所得的數(shù)據(jù)在OriginPro 2021中進行主成分分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母不同接種方式對鴨梨酒發(fā)酵的影響

在混菌發(fā)酵過程中,不同的微生物間會發(fā)生爭奪營養(yǎng)物質(zhì)的行為或產(chǎn)生具有毒性的代謝物,抑制或殺害非同類微生物,同時,微生物不同時期主要代謝產(chǎn)物不同,對發(fā)酵體系中其余微生物的影響均不同,因此在多菌混合發(fā)酵體系中,適當(dāng)?shù)慕臃N時間對酵母菌的生長繁殖與發(fā)酵活動至關(guān)重要[20]。試驗分別考察釀酒酵母、異常威克漢遜酵母單菌發(fā)酵在接種釀酒酵母后分別間隔0、24、48、72 h接種異常威克漢遜酵母后發(fā)酵液中酵母菌數(shù)量與發(fā)酵過程中鴨梨酒的理化指標變化,探究不同方式對鴨梨酒發(fā)酵的影響。如圖1-a所示,在單菌發(fā)酵體系中,按相同比例分別接種2種酵母進行發(fā)酵,釀酒酵母生物量顯著高于異常威克漢遜酵母,并且穩(wěn)定期較長,在發(fā)酵12 d后菌體數(shù)量才低于108CFU/mL,而異常威克漢遜酵母發(fā)酵9 d后菌體數(shù)量便低于108CFU/mL,這可能是由于隨著發(fā)酵的進行,鴨梨酒乙醇含量上升,異常威克漢遜酵母不耐受高乙醇含量而提前消亡,釀酒酵母由于能耐受較高濃度的乙醇,因此存活時間較長,菌體數(shù)可以較長時間保持較高水平;由圖1-b可知,釀酒酵母在發(fā)酵前期迅速消耗發(fā)酵體系中的可利用碳源,并迅速轉(zhuǎn)換為乙醇,較異常威克漢遜酵母產(chǎn)酒速度快,在發(fā)酵8 d后乙醇含量基本維持穩(wěn)定,乙醇體積分數(shù)達到11%,而異常威克漢遜酵母發(fā)酵較為緩慢,同樣在發(fā)酵8 d后酒精度基本維持穩(wěn)定,但此時乙醇體積分數(shù)僅為9.5%,與釀酒酵母存在較大差異,原因可能是異常威克漢遜酵母產(chǎn)酒效率低,同時不能耐受高乙醇濃度的環(huán)境,導(dǎo)致發(fā)酵提前終止并且不能發(fā)酵完全。在混菌發(fā)酵體系中,如圖1-c～圖1-f所示,當(dāng)同時等量接種釀酒酵母與異常威克漢遜酵母時,釀酒酵母的生長繁殖受到較大影響,在發(fā)酵前2 d,異常威克漢遜酵母能正常生長,發(fā)酵進行到第4天時菌體數(shù)量開始減少,到第5天時異常威克漢遜酵母菌體數(shù)便低于108CFU/mL,同時發(fā)酵液乙醇體積分數(shù)趨于穩(wěn)定,達到10.85%,釀酒酵母菌體數(shù)在發(fā)酵8 d后開始呈下降趨勢;當(dāng)接種時間相差24 h時,異常威克漢遜酵母的生長受到釀酒酵母的影響較大,菌體數(shù)遠低于釀酒酵母菌體數(shù),并且接種72 h后即呈下降趨勢,而釀酒酵母受異常威克漢遜酵母的影響較小,對產(chǎn)品乙醇含量影響不大;當(dāng)接種間隔為48與72 h時,異常威克漢遜酵母受釀酒酵母影響較大,僅能短暫存活2 d,隨即呈下降趨勢,接種異常威克漢遜酵母對釀酒酵母的生長與鴨梨酒乙醇含量沒有影響;考慮到鴨梨酒發(fā)酵需要足夠的釀酒酵母產(chǎn)酒,同時應(yīng)讓異常威克漢遜酵母存活較長時間,綜合選擇釀酒酵母發(fā)酵24 h后接入異常威克漢遜酵母。

a-單菌發(fā)酵鴨梨酒菌體數(shù)變化;b-單菌發(fā)酵鴨梨酒總糖與乙醇體積分數(shù)變化;c-接種間隔時間0 h菌體數(shù)、總糖與乙醇體積分數(shù)變化;d-接種間隔時間24 h菌體數(shù)、總糖與乙醇體積分數(shù)變化;e-接種間隔時間48 h菌體數(shù)、總糖與乙醇體積分數(shù)變化;f-接種間隔時間72 h菌體數(shù)、總糖與乙醇體積分數(shù)變化

2.2 不同酵母發(fā)酵對鴨梨酒風(fēng)味的影響

如表1所示,發(fā)酵結(jié)束后,在3種發(fā)酵方式釀造的鴨梨酒中共檢測出43種揮發(fā)性成分,包括16種酯類物質(zhì)、13種醇類物質(zhì)、3種酸類物質(zhì)、6種醛類物質(zhì)以及5種其他物質(zhì)。與釀酒酵母(33種)、異常威克漢遜酵母(36種)單菌發(fā)酵相比,混菌發(fā)酵(39種)獲得的香氣成分更多,說明混菌發(fā)酵能對鴨梨酒的風(fēng)味多樣性起到積極的作用。3種發(fā)酵接種方式發(fā)酵出的鴨梨酒共檢測出23種相同的香氣成分,分別為乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、異丁醇、異戊醇、正戊醇、10-壬醇、苯乙醇、山梨醇、乙酸、己酸、辛酸、苯甲醛、糠醛、壬醛、苯乙醛、丁香酚。

表1 鴨梨酒樣中揮發(fā)性組分含量

酯類物質(zhì)是果酒特征香氣成分的主要貢獻者,主要是通過發(fā)酵過程中酸類與醇類物質(zhì)的酯化作用生成,當(dāng)酯類物質(zhì)含量達到一定濃度時能夠增加果酒香氣的復(fù)雜性,賦予果酒一定的花香、果香等復(fù)合香氣[21-23]。由表1可知,在3種接種方式中,異常威克漢遜酵母單菌發(fā)酵的鴨梨酒酯類物質(zhì)含量最高,以乙酸乙酯為主,占總酯類物質(zhì)含量的82.48%,其次為辛酸乙酯與乙酸苯乙酯,分別占總酯類物質(zhì)含量的6.88%與6.81%,3種物質(zhì)占酯類物質(zhì)的90%以上,為鴨梨酒帶來較為強烈的梨香、荔枝香、花香等[24];釀酒酵母單菌發(fā)酵的鴨梨酒酯類物質(zhì)種類最少,共計12種,同時酯類物質(zhì)含量也最低,僅為86.13 mg/L,較異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒少97.39 mg/L,較混菌發(fā)酵的鴨梨酒少70.96 mg/L?；炀l(fā)酵的鴨梨酒酯類物質(zhì)種類最多,總計14種,其中含量較高的分別是乙酸乙酯(99.00 mg/L)、乙酸異戊酯(18.55 mg/L)、辛酸乙酯(17.14 mg/L)、乙酸苯乙酯(17.46 mg/L),其中乙酸乙酯含量與異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒相比減少52.37 mg/L,但比釀酒酵母發(fā)酵的鴨梨酒多40.65 mg/L,乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯含量與2種酵母分別發(fā)酵的鴨梨酒相比有不同程度的增加,此外較釀酒酵母相比,新增異戊酸乙酯、琥珀酸二乙酯、亞油酸乙酯、硝酸異山梨酯。由此可見,將釀酒酵母與異常威克漢遜酵母混合接種到鴨梨汁中進行發(fā)酵能有效改善由釀酒酵母單菌發(fā)酵帶來的風(fēng)味單一且寡淡的問題。

高級醇是酵母在果酒釀造過程中產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物之一,主要是由糖代謝、氨基酸脫氧脫羧作用生成,適量的高級醇不僅能給果酒帶來醇甜的口感,還能與酸類物質(zhì)進行酯化反應(yīng)合成酯類物質(zhì),對果酒風(fēng)味的形成有著重要作用[25-26]。當(dāng)含量超過300 mg/L時會給酒帶來辛辣等不愉快的味道,還可能會使飲用者產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)充血和頭痛的癥狀[27]。如表1所示,3種接種方式發(fā)酵得到的鴨梨酒中共計檢測出13種醇類物質(zhì),高級醇含量均低于300 mg/L,其中3-甲基-1-丁醇、異戊醇、正戊醇、苯乙醇含量較高,占醇類物質(zhì)的90%以上,異常威克漢遜酵母發(fā)酵得到的鴨梨酒醇類物質(zhì)含量最低,僅為164.77 mg/L,釀酒酵母單菌發(fā)酵與2種酵母混菌發(fā)酵中含量較高,分別為233.63與236.05 mg/L。混菌發(fā)酵的鴨梨酒中異戊醇、正戊醇含量顯著高于異常威克漢遜酵母單菌發(fā)酵的鴨梨酒、低于釀酒酵母單菌發(fā)酵的鴨梨酒,而異丁醇、苯乙醇、山梨醇等均低于異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒、高于釀酒酵母發(fā)酵的鴨梨酒。

酸類物質(zhì)、醛類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)等對果酒的呈香呈味有較大的影響,酸類物質(zhì)主要影響果酒的口感與后味,主要是起到助香、減少刺激的輔助作用[28-29]。在3種發(fā)酵方式中均檢測出乙酸、己酸、辛酸3種酸類物質(zhì),異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒中乙酸含量(10.51 mg/L)較釀酒酵母單菌發(fā)酵的鴨梨酒中乙酸含量(2.00 mg/L)高,當(dāng)2種酵母混菌發(fā)酵時,乙酸含量處于中等水平,說明異常威克漢遜酵母對鴨梨酒中乙酸的產(chǎn)量有積極影響,但由于受到釀酒酵母的抑制,產(chǎn)量較單菌發(fā)酵時低。醛酮類化合物性質(zhì)較活潑,屬于中間體化合物,在發(fā)酵及陳釀時極易被氧化還原成相應(yīng)的酸與醇,同時適量的醛酮類物質(zhì)(如苯甲醛、糠醛等)能賦予酒體特殊的杏仁香、焦甜香等,對酒體風(fēng)味有促進作用[30]。

2.3 不同接種方式風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

主成分分析是從多個變量中通過線性變換從中挑選出少數(shù)重要變量的數(shù)據(jù)處理方法。將3種酒樣共有的23種風(fēng)味物質(zhì)進行主成分分析,得到不同主成分的方差貢獻率和主成分載荷圖,主成分特征值、方差貢獻率和累計貢獻率見表2,載荷圖見圖2。如表2可知,以特征值>1為依據(jù),3個樣品中共提取了2個主成分,其中PC1與PC2方差貢獻率分別為57.000%和35.434%,累計貢獻率為92.434%,基本可以解釋原變量的絕大多數(shù)信息。

表2 主成分的特征值及方差貢獻率

圖2 香氣成分主成分分析散點圖

由圖2可知,3種接種方式發(fā)酵得到的鴨梨酒在PCA圖中得到了較好的區(qū)分,2種酵母混菌發(fā)酵的鴨梨酒主要分布在PC1與PC2的正半軸,異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒主要分布在PC1的正半軸與PC2的負半軸,釀酒酵母發(fā)酵的鴨梨酒在PC1與PC2的負半軸。2種酵母混菌發(fā)酵的鴨梨酒處于第一象限,風(fēng)味物質(zhì)較為豐富,有乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、異丁醇、10-壬醇、苯乙醇、山梨醇、己酸、辛酸、苯甲醛、壬醛、苯乙醛共12種物質(zhì),這些物質(zhì)能賦予酒體梨、蘋果、桑葚、玫瑰花、茉莉花等香味。異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒位于第四象限,主要包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、癸酸乙酯及乙酸共5種物質(zhì),能賦予酒體香蕉、草莓、菠蘿、梨等水果香。

2.4 不同接種方發(fā)酵鴨梨酒感官評價

不同酵母由于生長代謝不同,其產(chǎn)物也不盡相同,對鴨梨酒的發(fā)酵及感官都有一定的影響。根據(jù)定量分析的關(guān)鍵詞對不同接種方式發(fā)酵的鴨梨酒進行感官品評,結(jié)果如圖3所示,釀酒酵母發(fā)酵的鴨梨酒具有較好的發(fā)酵香與清香,異雜味少,但甜香、花香、果香較弱,酒體單薄、寡淡,其原因可能是釀酒酵母具有較強的發(fā)酵產(chǎn)酒能力,同時發(fā)酵副產(chǎn)物少;異常威克漢遜酵母發(fā)酵得到的鴨梨酒果香、花香與甜香較為突出,其原因可能是異常威克漢遜酵母具有產(chǎn)酯能力強的特點,例如高產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等,因此能明顯增強果酒的果香、花香與甜香,但異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒發(fā)酵香、酒香較弱,其原因可能是其生長較釀酒酵母慢,且發(fā)酵產(chǎn)酒能力弱,發(fā)酵結(jié)束后酒精度較低;2種酵母混菌發(fā)酵的鴨梨酒具有較好的發(fā)酵香、清香與果香,風(fēng)格典型,優(yōu)于釀酒酵母發(fā)酵的鴨梨酒與異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒,但甜香與花香較異常威克漢遜酵母發(fā)酵的鴨梨酒略低。

圖3 感官分析雷達圖

3 結(jié)論

試驗分析釀酒酵母與異常威克漢遜酵母不同接種方式對鴨梨酒發(fā)酵過程中酵母數(shù)量與鴨梨酒風(fēng)味的影響。結(jié)果表明,在混菌發(fā)酵體系中,釀酒酵母與非釀酒酵母存在相互抑制關(guān)系,先接種釀酒酵母后接種異常威克漢遜酵母,異常威克漢遜酵母生長將受到抑制,并且隨接種間隔時間的加大而增強;混菌發(fā)酵的鴨梨酒風(fēng)味成分較釀酒酵母發(fā)酵的鴨梨酒更豐富,并且能降低正戊醇、異戊醇等部分高級醇的含量;對23種共有揮發(fā)性成分進行主成分分析,共提取到2個主成分,PC1與PC2方差貢獻率分別為57.000%和35.434%;通過感官分析,2種酵母混菌發(fā)酵的鴨梨酒較兩種酵母單菌發(fā)酵的鴨梨酒果香與發(fā)酵香有較大的提升,香味更為豐富。綜上所述,不同接種方式對鴨梨酒中主要發(fā)酵菌種及風(fēng)味成分與感官有較大的影響,采用2種酵母進行混菌發(fā)酵有利于增加酒體風(fēng)味的復(fù)雜性,提高酒的品質(zhì)。