微生物干預(yù)降低醬香型白酒釀造中的乳酸

羅寒,曾祥煉,陳良強(qiáng),楊帆,杜海,黃旭

(貴州茅臺酒股份有限公司,貴州 仁懷,564500)

乳酸菌是白酒發(fā)酵過程中的主要微生物[1],大量乳酸菌的生長使白酒釀造過程中乳酸大量積累,酒醅酸度過高[2],影響其他產(chǎn)酒酵母的生長與產(chǎn)酒,其中食果糖乳桿菌在發(fā)酵產(chǎn)醇階段,通過異型乳酸發(fā)酵主導(dǎo)的乙醇代謝模式引起發(fā)酵體系乳酸過度積累, 造成“乳酸高酒精不低”的現(xiàn)象,影響后續(xù)輪次發(fā)酵[3]。因此,通過控制發(fā)酵體系生物因素來抑制酸敗菌的生長尤為重要。研究證明,當(dāng)乳酸含量6 g/100 g時(shí)會顯著抑制酵母菌的生長與代謝[4-5]。

目前,降低酒醅中乳酸主要有2種途徑:一是物理除酸,例如,濃香型酒廠通過蒸餾后期,“大氣沖酸”[6],但乳酸為不易揮發(fā)性酸,效果不理想;另一種途徑是生物途徑,篩選能利用乳酸的微生物進(jìn)行降酸,該方法能耗小、無污染且效率高,是當(dāng)前的主要研究方向[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前的研究主要選育具有較強(qiáng)乳酸耐受性的酵母菌菌株來提高白酒發(fā)酵高酸條件下的產(chǎn)酒力[8]。但是中國白酒的釀造屬于典型的多菌種自然發(fā)酵,依靠自然富集獲得的微生物發(fā)酵,產(chǎn)生不同特征風(fēng)味的物質(zhì)。在此過程中,通過釀造菌群自身降低酒醅中乳酸含量可以緩解乳酸對產(chǎn)酒酵母的抑制作用。畢赤酵母是白酒發(fā)酵中最常用的產(chǎn)酒功能菌株之一,在汾酒酒醅發(fā)酵前期畢赤酵母占真菌群落的60%以上[9],白云邊出入窖酒醅中,畢赤酵母屬占比約為40%[10],醬香型白酒釀造酒醅中畢赤酵母在前期輪次中占比大于80%[11]。畢赤酵母具有生長周期短、發(fā)酵能力強(qiáng)、容易進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)以及含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、生物活性物質(zhì)等豐富營養(yǎng)成分的優(yōu)點(diǎn),是基礎(chǔ)研究及應(yīng)用研究的主要對象,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[12]。

研究發(fā)現(xiàn),畢赤酵母有一定的降解乳酸功能[13-14]。然而,傳統(tǒng)釀造微生物自然富集過程存在較大的波動性。不同發(fā)酵系統(tǒng),甚至不同香型白酒釀造中,產(chǎn)乳酸的菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異[15-16]。畢赤酵母能否有效抑制醬香型白酒釀造過程中普遍存在的乳酸菌,并實(shí)現(xiàn)降解乳酸有待進(jìn)一步驗(yàn)證。因此,需明確畢赤酵母對醬香型白酒中主要乳酸菌株的產(chǎn)乳酸抑制情況。

本研究以從醬香白酒釀造過程中篩選的耐酸畢赤酵母為研究對象,探索其在與不同類型乳酸菌混合發(fā)酵過程中產(chǎn)乳酸抑制效果,并通過酒醅原位發(fā)酵驗(yàn)證其抑制作用。以期進(jìn)一步推動自然發(fā)酵過程中靶向菌群富集方法與策略,通過生物途徑降低白酒發(fā)酵過程乳酸含量,為解決傳統(tǒng)發(fā)酵體系中乳酸過度積累共性問題提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基

高粱汁培養(yǎng)基:將高粱與水按料液比1∶4(g∶mL)混合,按1 μL/g 高粱的添加量加入淀粉酶(20 000 U/mL)蒸煮液化,按5 μL/g 高粱的添加量在60 ℃時(shí)加入糖化酶(100 000 U/mL)糖化,4層紗布過濾,10 000 r/min離心10 min,上清液調(diào)節(jié)糖度至7°Bx。

富集培養(yǎng)基(g/L):乳酸40,葡萄糖50,蛋白胨20,酵母膏10,K2HPO42,NaCl 1,MgSO40.1,MnSO40.05。

篩選培養(yǎng)基(g/L):乳酸40,葡萄糖50,蛋白胨20,酵母膏10。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extracts peptone dextrose,YPD)液態(tài)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母膏10;固態(tài)培養(yǎng)基加入20 g/L瓊脂。

上述培養(yǎng)基pH自然,115 ℃滅菌15～20 min。

1.1.2 檢測方法

乳酸:取1 mL發(fā)酵液于2 mL離心管,12 000 r/min、4 ℃離心10 min,取一定量的上清液,超純水稀釋30倍,經(jīng)0.2 μm濾膜過濾,濾液進(jìn)樣液相色譜分析。

乙酸:稱取15 g酒醅于50 mL離心管中,加入30 mL超純水,280 r/min振蕩15 min,超聲波處理5 min,4 ℃、4 000 r/min離心6 min,吸取上清液710 μL置于EP管中,加入790 μL 95%乙醇,-20 ℃冷凍2 h以上,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,離心后上清液(不少于0.5 mL)轉(zhuǎn)移至2 mL樣品瓶中進(jìn)樣分析。

乙醇:取15 g酒醅于50 mL離心管中,加入30 mL超純水,280 r/min振蕩15 min,超聲波處理5 min,4 ℃、4 000 r/min離心6 min,吸取4 mL上清液于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

菌株:庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)JP-Y08,來源于茅臺酒發(fā)酵過程酒;乳酸菌:植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、橋乳桿菌(Lactobacilluspontis)、面包乳桿菌(Lactobacilluspanis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans),茅臺酒發(fā)酵過程酒醅;畢赤酵母模式菌株(ATCC 6258),購買的模式菌株。

1.3 菌株篩選

稱取樣品10 g于90 mL帶玻璃珠的無菌水中,振蕩均勻,吸取0.1 mL上清液于100 mL富集培養(yǎng)基中,分別在有氧/無氧、30 ℃/37 ℃條件下靜置培養(yǎng)2～4 d,觀察培養(yǎng)液是否渾濁;若培養(yǎng)液已明顯渾濁時(shí),吸取0.1 mL富集培養(yǎng)液于新的100 mL液態(tài)篩選培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)2 d,培養(yǎng)3～4次后將培養(yǎng)液梯度稀釋于YPD固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3～4 d后,其單菌落即為抗乳酸特性的目標(biāo)菌株。

1.4 菌株鑒定

將篩選得到的耐乳酸特性菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)4 d,觀察菌落形態(tài),將菌落圓形,且表面光滑的菌株多次純化后,進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

分子生物學(xué)鑒定:采用試劑盒法提取基因組[17],以其為模板對目標(biāo)菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測序引物為NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。PCR擴(kuò)增體系(25 μL):Taq-Mix酶12 μL,引物NL1和引物NL4各1 μL,模板1 μL,ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次;72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)合格后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將26S rDNA D1/D2區(qū)測序結(jié)果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析,待鑒定菌株和與其親緣關(guān)系最近的模式菌株的同源率大于99%,初步判定兩者為同一種。

1.5 畢赤酵母對4種乳酸菌的產(chǎn)酸抑制

將畢赤酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中,于30 ℃預(yù)培養(yǎng)至菌體濃度OD600值為0.3,獲得畢赤酵母種子液。將從酒醅中原位篩選的植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌、面包乳桿菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃預(yù)培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.3。

將7.5 μL畢赤酵母種子液、畢赤酵母模式菌株(ATCC 6258)種子液分別與7.5 μL植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌、面包乳桿菌種子液混合接種于1.5 mL高粱汁培養(yǎng)基中,37 ℃下靜置培養(yǎng)72 h,測定發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液中乳酸含量及乳酸菌菌體量。試驗(yàn)分組見表1。

表1 試驗(yàn)分組

1.6 畢赤酵母與同型、異型乳酸菌混合發(fā)酵

將鑒定后所得的庫氏畢赤酵母菌株JP-Y08接種于YPD液體培養(yǎng)基中,于30 ℃預(yù)培養(yǎng)至菌體濃度約為109CFU/mL,獲得畢赤酵母種子液。制備食果糖乳桿菌(異型乳酸菌)、發(fā)酵乳桿菌(同型乳酸菌)種子液菌體濃度約為109CFU/mL。

(a)純種發(fā)酵:將畢赤酵母以2%接種量接種于液體培養(yǎng)基(終濃度約為106CFU/mL),按流程進(jìn)行發(fā)酵。

(b)混合發(fā)酵將畢赤酵母和乳酸菌以:①10∶1(2%∶0.2%);②10∶10(2%∶2%);③1∶10(0.2%∶2%)接種于液體培養(yǎng)基,按流程進(jìn)行發(fā)酵(圖1)。

圖1 試驗(yàn)流程

1.7 畢赤酵母在白酒發(fā)酵過程中的降乳酸應(yīng)用

為了驗(yàn)證庫氏畢赤酵母JP-Y08菌株在發(fā)酵過程中對酒醅高酸、結(jié)塊、霉變等異常發(fā)酵狀態(tài)的改善情況,本試驗(yàn)選擇前期輪次發(fā)酵程度不太理想的窖號進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將畢赤酵母接種于高粱汁液體培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h,將獲得的培養(yǎng)液12 000 r/min離心10 min,棄上清液,獲得畢赤酵母的菌體細(xì)胞沉淀,用無菌水洗滌數(shù)次,并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算酵母菌液的濃度,調(diào)節(jié)菌體量為106CFU/g菌泥,備用。

實(shí)驗(yàn)組:將畢赤酵母CGMCC No:14068菌劑按5%(質(zhì)量百分比)的比例與制酒生產(chǎn)中已丟堆的糟醅(500±10) g混合均勻,疏松地裝于搪瓷缸中,并用紗布封口后,埋于制酒生產(chǎn)輪次堆積發(fā)酵階段酒醅中,于發(fā)酵堆深約50 cm處,設(shè)置3個(gè)平行。

對照組:將制酒生產(chǎn)中已丟堆的糟醅(500±10)g,疏松地裝于搪瓷缸中,并用紗布封口后,與實(shí)驗(yàn)組同埋于制酒生產(chǎn)輪次堆積發(fā)酵階段酒醅中,于發(fā)酵堆子深約50 cm處,共設(shè)置3個(gè)平行。

窖內(nèi)發(fā)酵階段,將上述實(shí)驗(yàn)組和對照組同時(shí)轉(zhuǎn)移至窖內(nèi)酒醅距窖面深約1.5 m處,窖內(nèi)發(fā)酵結(jié)束,對酒醅的乳酸含量進(jìn)行檢測,并觀察發(fā)酵感官情況。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 20.0分析不同組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

從醬香型酒醅中通過5次富集、篩選,初步分離得到具有乳酸耐受性,且穩(wěn)定性較強(qiáng)的目標(biāo)菌株45株,菌株編號分別為JP-Y01～JP-Y45。45株菌株的測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn),與庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)NRRL Y-5396的26S rDNA基因序列相似度大于99%的菌株有21株,從中選擇抑制產(chǎn)乳酸效果最好的菌株JP-Y08進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 畢赤酵母對乳酸菌的產(chǎn)酸抑制

由表2可知,畢赤酵母菌株JP-Y08與植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌或面包乳桿菌混合發(fā)酵,可使混合發(fā)酵體系的乳酸含量下降64.0%～94.1%,而畢赤酵母模式菌株ATCC 6258的混合發(fā)酵體系乳酸含量僅下降25%～50%,產(chǎn)乳酸抑制效果遠(yuǎn)低于本研究的菌株,且純?nèi)樗峋l(fā)酵和與畢赤酵母混合發(fā)酵組別、添加JP-Y08與ATCC 6258組別之間乳酸含量差異均極顯著(P<0.01)。

表2 不同培養(yǎng)體系發(fā)酵終點(diǎn)的乳酸含量

2.3 畢赤酵母與同型乳酸菌、異型乳酸菌混合發(fā)酵

由圖2可知,畢赤酵母與同型、異型乳酸菌混合發(fā)酵時(shí),乳酸變化趨勢大致相同。

a-異型乳酸發(fā)酵;b-同型乳酸發(fā)酵

厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)(圖2-a),異型乳酸菌純種發(fā)酵乳酸含量為1.27%,當(dāng)與畢赤酵母混合發(fā)酵時(shí),培養(yǎng)基中的乳酸含量為0.18%～0.68%;厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí),同型乳酸菌純種發(fā)酵的乳酸含量為1.50%(圖2-b),與畢赤酵母混合發(fā)酵時(shí),乳酸含量為0.37%～0.73%。整個(gè)發(fā)酵過程乳酸菌純種發(fā)酵乳酸含量在1.2%～1.5%,添加畢赤酵母的組別乳酸含量為0.04%～0.73%,混合發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸明顯低于乳酸菌純種單獨(dú)發(fā)酵組別,且畢赤酵母接種量越高,乳酸含量越低;厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí),同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸大于異型乳酸發(fā)酵,該結(jié)果表明畢赤酵母對異型乳酸發(fā)酵的產(chǎn)乳酸抑制作用強(qiáng)于同型乳酸發(fā)酵。

厭氧發(fā)酵結(jié)束時(shí),(圖3)異型乳酸菌純種發(fā)酵總醇含量峰面積1 g處理后為7.08,同型乳酸菌純種發(fā)酵為6.29,異型乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)醇能力大于同型乳酸菌;添加畢赤酵母組別總醇含量均大于乳酸菌純種發(fā)酵。

a-異型乳酸發(fā)酵;b-同型乳酸發(fā)酵

2.4 畢赤酵母在白酒發(fā)酵過程中的降乳酸應(yīng)用

在搪瓷缸中添加畢赤酵母的實(shí)驗(yàn)組酒醅疏松、滋潤、色澤正常,而未添加畢赤酵母的原位對照組酒醅結(jié)塊、呈灰白色,有霉變跡象。因此,添加畢赤酵母能顯著改善酒醅的發(fā)酵狀態(tài)。

由表3可知,對照組酒醅中的乳酸含量為9.32 g/kg酒醅,乙酸含量為1.61 g/kg酒醅,添加畢赤酵母酒醅中的乳酸含量為3.26 g/kg酒醅,乙酸含量為0.78 g/kg酒醅,乳酸的下降率為64.9%,乙酸下降率為51.3%,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組的乳酸和乙酸含量差異極顯著(P<0.05)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)組酒醅中的乙醇含量為17.47 g/kg酒醅,與對照組相比,乙醇增加量約0.5 g/kg酒醅。因此,添加畢赤酵母不僅能降低發(fā)酵過程有機(jī)酸含量,且對乙醇產(chǎn)量無顯著影響。

表3 原位發(fā)酵組、PK添加組及乳酸和乙酸下降率

通過高通量測序進(jìn)一步分析發(fā)酵酒醅的微生物結(jié)構(gòu),如圖4所示,添加畢赤酵母后的實(shí)驗(yàn)組酒醅真菌群落以畢赤酵母(Pichia)、嗜熱子囊菌(Thermoascus)、釀酒酵母(Saccharomyces)和嗜熱真菌屬(Thermomyces)為主,與正常發(fā)酵班組酒醅的微生物結(jié)構(gòu)是類似的。而未添加畢赤酵母及原位酒醅的真菌群落則以紅曲霉(Monascus)和接合酵母(Zygosaccharomyces)為主。由此可見,在醬香型白酒生產(chǎn)過程中,添加畢赤酵母微生態(tài)制劑可以顯著抑制絲狀真菌的過度繁殖。結(jié)合理化指標(biāo)分析可知,添加畢赤酵母的組別與對照組的乙醇含量無顯著性差異,同時(shí)可以顯著減低乙酸和乳酸的含量,這對于維持白酒發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)具有重要意義。

圖4 添加畢赤酵母(實(shí)驗(yàn)組)、原位酒醅(對照組)酒醅微生物結(jié)構(gòu)分析

3 結(jié)論與討論

本研究的畢赤酵母菌株與植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌或面包乳桿菌混合發(fā)酵,可使混合發(fā)酵體系的乳酸含量下降64.0%～94.1%,而畢赤酵母模式菌株ATCC 6258的混合發(fā)酵體系乳酸含量僅下降25%～50%,產(chǎn)乳酸抑制效果遠(yuǎn)低于本研究的菌株。畢赤酵母與同型、異型乳酸菌混合發(fā)酵時(shí),產(chǎn)生的乳酸明顯低于乳酸菌純種單獨(dú)發(fā)酵組別,且畢赤酵母接種量越高,乳酸含量越低,畢赤酵母對異型乳酸發(fā)酵的產(chǎn)乳酸抑制作用強(qiáng)于同型乳酸發(fā)酵。畢赤酵母對發(fā)酵體系產(chǎn)乳酸抑制作用的原位驗(yàn)證試驗(yàn)表明,添加畢赤酵母可以顯著改善酒醅的發(fā)酵狀態(tài),降低酒醅中有機(jī)酸的含量而不影響乙醇產(chǎn)量,這對于維持白酒發(fā)酵釀酒酵母菌群的增殖和穩(wěn)定白酒產(chǎn)量具有重要意義,但畢赤酵母對發(fā)酵體系產(chǎn)乳酸抑制作用的機(jī)理尚不清楚,需后續(xù)進(jìn)行更全面的文獻(xiàn)查閱,設(shè)計(jì)相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行更深入的研究。

因此,本研究的畢赤酵母菌株對發(fā)酵體系具有較強(qiáng)的產(chǎn)乳酸抑制作用,具備作為生物途徑降低發(fā)酵乳酸含量微生物菌種的潛力。若通過更大規(guī)模的生產(chǎn)試驗(yàn)驗(yàn)證,則可作為降乳酸強(qiáng)化菌劑的菌種資源應(yīng)用于白酒生產(chǎn),也為通過主動菌群干預(yù)解決白酒釀造過程中乳酸的過度積累導(dǎo)致產(chǎn)酒酵母菌群失調(diào)和產(chǎn)酒率低下等行業(yè)共性難題提供了研究基礎(chǔ)。