基于體外發(fā)酵模型研究膳食多糖對腸道菌群色氨酸代謝的影響

何袁,高文玉,王心怡,陸文偉,2,王鴻超,2*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(國家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

過敏是全球日益嚴(yán)重的公共問題,據(jù)世界過敏組織(World Allergy Organization,WAO)報(bào)道,過敏性疾病已成為全球第六大疾病,給全世界30%～40%的人群造成了生活上的困擾。近年來,我國的過敏發(fā)病率也在不斷升高,估計(jì)患病人數(shù)超過2億。對于過敏癥狀,積極預(yù)防和治療是關(guān)鍵。然而目前治療過敏最有效的方法之一是嚴(yán)格避免接觸過敏源。治療過敏的藥物也存在個(gè)體差異性,更不利的是長期使用藥物會產(chǎn)生一定副作用。因此,尋找安全的、能夠降低患者敏感性的天然抗過敏物質(zhì),開發(fā)預(yù)防性或治療性干預(yù)方法,對于降低過敏發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),提高過敏患者生活質(zhì)量至關(guān)重要。

越來越多的證據(jù)證明,腸道菌群的健康狀態(tài)影響宿主的健康狀況,并且眾多疾病的發(fā)生都能從腸道菌群中找到答案[1]。腸道菌群及其代謝物可作為緩解甚至治療過敏的靶點(diǎn)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)過敏兒童的腸道菌群失調(diào)、促炎潛力升高、降解纖維能力減弱[4]。然而將碳源從糖類轉(zhuǎn)為色氨酸(tryptophan,Trp),腸道中高度適應(yīng)性的乳酸桿菌會加速生長并產(chǎn)生芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)的配體吲哚-3-乙醛(indole-3-aldehyde, IAId),促進(jìn)白介素22(interleukin,IL-22)轉(zhuǎn)錄[5],針對色氨酸—菌群—芳香烴受體配體—免疫調(diào)節(jié)這一通路,又發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚-3-乙酸(indole acetic acid, IAA),促進(jìn)腸上皮T細(xì)胞增殖[6]。一項(xiàng)哮喘小鼠實(shí)驗(yàn)表明色氨酸代謝物犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)通過調(diào)控Th17、Treg比例,有利于形成免疫耐受或者逆轉(zhuǎn)免疫耐受缺陷達(dá)到防治哮喘的目的[7]。這明確說明腸道菌群代謝色氨酸產(chǎn)生的某些物質(zhì),影響機(jī)體免疫平衡,這使菌群代謝飲食中色氨酸改善機(jī)體過敏癥狀成為可能。天然來源的多糖、寡糖等物質(zhì)具有抗過敏的功能,其能夠與過敏原結(jié)合,修飾或者包埋過敏表位;調(diào)節(jié)過敏原的呈遞過程,改變T細(xì)胞的分化方向;提升腸上皮細(xì)胞的緊密連接性或阻礙肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的脫顆粒現(xiàn)象,減少促炎因子產(chǎn)生[8]。同時(shí)多糖可改變腸道微生物組成,影響基于腸道菌群作用下的色氨酸代謝通路。本研究通過體外發(fā)酵模型探究多種膳食多糖對菌群的影響,檢測糞便中腸道微生物結(jié)構(gòu)組成及色氨酸代謝產(chǎn)物的變化,篩選潛在適合過敏人群的膳食因子。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

PB3002-N型電子天平,梅特勒托多儀器(上海)公司;厭氧工作站400TG,英國Eletrotek公司;ZHJH-C1115B型超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司;高溫高壓滅菌鍋,SANYO公司(日本);高速冷凍離心機(jī),Eppendorf 公司;FE-20精密pH計(jì),梅特勒-托利儀器(上海)有限公司;振蕩器,德國IKA集團(tuán);Vanquish Q Exactive Plus超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國賽默飛世爾科技公司;llumina miseq pe300高通量測序儀,美國llumina公司。

表1 膳食多糖分組信息

1.2 體外發(fā)酵模型

體外發(fā)酵模型參考文獻(xiàn)[10-11]的方法并做調(diào)整,最終發(fā)酵體積2 mL,24孔板加入0.4 mL糞便勻漿液和1.6 mL培養(yǎng)基。將孔板放入?yún)捬跸鋄V(N2)∶V(CO2)∶V(H2)=8∶1∶1]中發(fā)酵24 h,膳食多糖添加量為0.5%,設(shè)置2種不同的對照組(陽性對照采用可溶性淀粉,空白組不添加碳源)。所有膳食多糖平行發(fā)酵3次。發(fā)酵結(jié)束后放于4 ℃冰箱過夜以停止微生物活動。并將發(fā)酵液于8 000×g,4 ℃離心10 min,收集上清液于-20 ℃冰箱等待代謝組檢測,下部沉淀菌泥等待提取DNA。

1.3 糞便收集及處理

采集7份(年齡在14～25歲,女,無特殊飲食習(xí)慣及生活方式不發(fā)生變化)新鮮糞便,要求在近6個(gè)月未患有便秘、腸炎等消化性疾病以及未長時(shí)間服用益生菌等,同時(shí)在近3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素等藥物。所有人群的糞便立即收集于采集管中,并放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋,盡快進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在厭氧工作箱中稱取糞便樣品重量,按1∶10(體積比)加入滅菌的pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS)稀釋糞便,渦旋混勻。

1.4 16S rRNA測序

按試劑盒要求提取發(fā)酵后糞便的DNA及其膠回收,即針對微生物rRNA V3～V4區(qū)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR時(shí)正向引物5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和反向引物5′-GGACTACNNGGGTATCT-AAT-3′。對瓊脂糖凝膠電泳后的膠塊進(jìn)行切膠和DNA純化。在MiSeq PE300 (Illumina)平臺測序。菌群測序結(jié)果經(jīng)過合并雙端及質(zhì)控,利用QIIME2(https://view.qiime2.org/)平臺分析。利用最新的Silva 16 s rRNA v132數(shù)據(jù)庫對物種進(jìn)行注釋。本研究選取相對豐度在一個(gè)樣本中至少大于千分之一的屬進(jìn)行分析?；诤Y選后的屬水平物種豐度表作為原始數(shù)據(jù)集。產(chǎn)生的代表性序列操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)通過總和縮放進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,采用Mann-Whitney/Kruskal-Wallis檢驗(yàn)(非參數(shù))比較兩組間α多樣性。通過基于Bray-Curtis index的非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)計(jì)算菌群β多樣性,使用相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),計(jì)算顯著性。

1.5 色氨酸靶向代謝檢測

吸取離心后的發(fā)酵上清液至無酶EP管中,加入混合液[V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(異丙醇)=8∶1∶1]后置于冰上以沉淀蛋白,隨后真空濃縮直至水分蒸發(fā),加入10%甲醇水重懸離心過膜等待上機(jī)檢測。采用ACQUITY UPLC?BEH C18 1.7 μm (100 mm×2.10 mm)色譜柱,柱溫36.5 ℃,自動進(jìn)樣溫度為4 ℃。流動相A為乙腈,流動相B為0.1%甲酸水。梯度洗脫時(shí)采用先A液再B液洗脫,最后平衡至20 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

色氨酸代謝物數(shù)據(jù)分析,使用 GraphPad Prism version 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(one-way variance analysis,ANOVA)比較多組間的差異,然后采用Duncan’s new multiple range檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。色氨酸代謝物和菌群屬水平的相關(guān)指數(shù)和P值使用雙端檢測的spearman計(jì)算。當(dāng)P<0.05時(shí),用*表示;當(dāng)P<0.01,用**表示;當(dāng)P<0.001,用***表示,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 膳食多糖改變腸道菌群α多樣性

腸道微生物能夠通過分泌碳水化合物活性酶(carbohydrate active enzyme,CAZyme)分解多糖[12],而多糖反過來又能增加腸道中的益生菌比例,調(diào)節(jié)微生物組成,從而維持宿主健康[13]。研究發(fā)現(xiàn),與免疫功能相關(guān)的膳食多糖種類集中在菌菇類多糖,除此之外還有藥食同源類植物多糖,本研究篩選了24種多糖(表1),探究了其對菌群的調(diào)節(jié)作用。菌菇的營養(yǎng)保健功能很大程度上歸功于其含有的生物活性物質(zhì),像靈芝多糖、香菇多糖、牛樟芝多糖、猴頭菇多糖等菌菇多糖,是具有藥理活性的“活性多糖”,化學(xué)結(jié)構(gòu)為三維螺旋狀的β型多糖,可激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等,促進(jìn)細(xì)胞因子生成,對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調(diào)節(jié)作用,同時(shí)它們被腸道微生物利用,產(chǎn)生短鏈脂肪酸等有利代謝產(chǎn)物,起到免疫調(diào)節(jié)作用(相關(guān)數(shù)據(jù)請見增強(qiáng)出版附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034677)。為了驗(yàn)證這些多糖對人類腸道菌群的調(diào)節(jié)作用,將其加到人類新鮮糞便中進(jìn)行體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。采用Evenness、Observed OTUs和Shannon三種α多樣性指數(shù)探究膳食多糖對腸道菌群的豐富度和均勻度的影響。Evenness 指數(shù)是最常用的均勻度指數(shù),Observed OTUs指數(shù)主要表示某一群落中的物種豐富度,Shannon指數(shù)則反映群落中物種的豐富度、均勻度及穩(wěn)定性。如圖1所示,對比加入的可溶性淀粉的對照組,黃芪多糖、褐藻多糖、大棗多糖、山藥多糖、銀耳多糖、牛樟芝多糖和黃精多糖顯著提升Evenness指數(shù)(P<0.05),姬松茸多糖、樹舌靈芝多糖、猴頭菇多糖、香菇多糖、山藥多糖、白耙齒菌多糖、木耳多糖和黃精多糖顯著提升Observed_OTUs指數(shù)(P<0.05),大棗多糖、牛樟芝多糖和黃精多糖顯著提升Shannon指數(shù)(P<0.05)。表明大棗多糖、牛樟芝多糖、黃精多糖顯著提高了腸道微生物的豐富度和均勻度,改善腸道菌群組成,而其他多糖對菌群多樣性調(diào)節(jié)不顯著。

a-Evenness;b-Observed_OTUs;c-Shannon

2.2 膳食多糖改變腸道菌群β多樣性

基于Bray-Curtis相似性的NMDS對膳食多糖發(fā)酵后腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,不同的膳食多糖對菌群整體組成結(jié)構(gòu)影響不同。NMDS結(jié)果的評估標(biāo)準(zhǔn)是Stress值,為樣品在降維后形成的空間距離與其在原始多維空間距離的差值,越小越好,說明在低維空間更完整地捕獲了高維空間的信息。通過比較2個(gè)群落微生物組成上的差異,發(fā)現(xiàn)靈芝多糖、蛹蟲草多糖、褐藻多糖、金針菇多糖和茯苓多糖的Stress值<0.2,顯著改變菌群β多樣性(P<0.05)(表2,圖2)。腸道中的共生菌能利用多糖,同時(shí)多糖含量及化學(xué)組成的變化也影響著腸道微生物,他們共同塑造了一個(gè)動態(tài)的、變化的腸道環(huán)境。靈芝多糖對特異性免疫和非特異性免疫都有一定作用,并且研究人員證實(shí)靈芝多糖及其水解物可以改善菌群結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物,從而增強(qiáng)腸黏膜免疫[14]。褐藻多糖在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中都不被消化酶降解,其可作為腸道菌群的碳源,通過調(diào)節(jié)腸道菌群,產(chǎn)生短鏈脂肪酸,直接與免疫細(xì)胞toll樣受體作用并產(chǎn)生黏蛋白增強(qiáng)免疫應(yīng)答[15]。喂食靈芝多糖及茯苓多糖后,降低小鼠腸道菌群OTU多樣性并顯著重塑腸道菌群的組成,糞便中可抗肥胖、產(chǎn)短鏈脂肪酸、降解多糖/木聚糖、產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的豐度顯著增加[16]。

a-靈芝多糖;b-黃芪多糖;c-蛹蟲草多糖;d-白樺茸多糖;e-褐藻多糖;f-金針菇多糖;g-猴頭菇多糖;h-茯苓多糖

表2 膳食多糖發(fā)酵后菌群結(jié)構(gòu)差異值

2.3 膳食多糖影響腸道菌群物種組成

對膳食多糖干預(yù)后的腸道菌群門、屬水平進(jìn)行物種組成分析,計(jì)算厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的比值(F/B)。在門水平上,腸道菌群主要是由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)構(gòu)成(圖3)。對比空白組,灰樹花多糖、金針菇多糖和猴頭菇多糖可顯著提高F/B值(P<0.05,圖4)。從屬水平上發(fā)現(xiàn)靈芝多糖、黃芪多糖、蛹蟲草多糖、白樺茸多糖、褐藻多糖、金針菇多糖、猴頭菇多糖和茯苓多糖的攝入促進(jìn)Lactobacillus和Bifidobacterium的相對豐度(圖5)。研究表明調(diào)節(jié)整體腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的靈芝多糖不僅可以減少胰島素抵抗,逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖、高脂血癥、脂肪積累等,還改善小鼠的腸道屏障功能,更為重要的是Lactobacillus在小鼠腸道內(nèi)得到富集[17]。最近研究表明,白樺茸抗病毒和消炎的作用非常顯著,在體外或許能夠抑制RNA和DNA病毒。該研究強(qiáng)調(diào)了白樺茸具有強(qiáng)大的酶系統(tǒng)和防御系統(tǒng),被證明可以抑制與 COVID-19 相關(guān)的促炎細(xì)胞因子,并幫助防止“細(xì)胞因子風(fēng)暴”壓倒免疫系統(tǒng)[18],這是因?yàn)閺陌讟迦鬃訉?shí)體中提取的多糖是一種關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)和信號分子,有助于支持免疫系統(tǒng)的恢復(fù)。金針菇多糖促進(jìn)小鼠擬桿菌門豐度,降低結(jié)腸中的致病菌[19],對于免疫系統(tǒng),其抑制了造模引起的血清IgA、IL-6、TNF-α升高,并且促進(jìn)了抗炎因子IL-10產(chǎn)生[20]。

圖3 腸道菌群的門水平組成

圖4 腸道菌群的F/B值

圖5 膳食多糖對腸道菌群屬水平組成的影響

2.4 膳食多糖改變腸道菌群色氨酸代謝

多種色氨酸代謝物是有利于機(jī)體的小分子物質(zhì),其已被證實(shí)有與細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的抗炎作用,促進(jìn)Th1細(xì)胞的免疫反應(yīng),抑制Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)的發(fā)展和過敏抗體(IgE)產(chǎn)生,從機(jī)制上緩解過敏反應(yīng)。通過糞便發(fā)酵液的靶向代謝組學(xué)檢測色氨酸代謝物,發(fā)現(xiàn)前述顯著改變腸道菌群β多樣性的靈芝多糖、蛹蟲草多糖、褐藻多糖、金針菇多糖和茯苓多糖不能增加糞便中色氨酸代謝物KYN、IPA和IAA的含量(圖6-a～圖6-c),但I(xiàn)LA和I3C含量增加(圖6-d,圖6-e),尤其是褐藻多糖和茯苓多糖。事實(shí)證明,增加腸道多糖的可用性可以促進(jìn)微生物色氨酸降解,從而導(dǎo)致大腸和血清中色氨酸及其代謝物水平的改變[20-21],影響體內(nèi)循環(huán)色氨酸。據(jù)報(bào)道ILA在雙歧桿菌占優(yōu)勢的嬰兒糞便中濃度很高[22],另一項(xiàng)研究證實(shí)雙歧桿菌表達(dá)的人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)代謝基因激活了色氨酸代謝通路,增加ILA,維護(hù)腸道及外周免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài),抑制過度免疫反應(yīng)的發(fā)生從而減少母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道炎癥[18]。本研究通過菌群和色氨酸代謝物關(guān)聯(lián)分析,同樣發(fā)現(xiàn)ILA與Lactobacillus和Bifidobacterium呈正相關(guān)(圖7)。由此可見,腸道微生物可利用諸如褐藻多糖、茯苓多糖等物質(zhì)產(chǎn)生有利的代謝產(chǎn)物,以此達(dá)到改善機(jī)體免疫促進(jìn)健康的作用。

a-犬尿氨酸(Kyn);b-吲哚丙酸(IPA);c-吲哚-3-乙酸(IAA);d-吲哚乳酸(ILA);e-吲哚-3-甲醛(I3C)

圖7 腸道菌群與色氨酸代謝物的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

全球范圍內(nèi)過敏發(fā)生率逐年增加,某些過敏性疾病已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的公共衛(wèi)生問題,這給社會、家庭和個(gè)人帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。隨著人們對過敏的發(fā)生發(fā)展研究的加深,發(fā)現(xiàn)腸道微生物在過敏中的作用不可忽視,多項(xiàng)研究也探討了腸道微生物群落與過敏性疾病之間的聯(lián)系,確定了不同過敏癥的微生物特征,盡管結(jié)論不能夠統(tǒng)一[23],但它們確定了過敏人群的α多樣性指數(shù)(Chao1和Shannon)低于正常人群,過敏患者色氨酸代謝能力下降及代謝物含量降低[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)在體外發(fā)酵模型中,膳食多糖不僅改變糞便菌群也促進(jìn)了色氨酸代謝過程,這為改善過敏體質(zhì)及開發(fā)適合過敏人群功能食品提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。腸道微生物顯著變化尤其是Lactobacillus和Bifidobacterium相對豐度增加,在褐藻多糖和茯苓多糖干預(yù)下菌群色氨酸代謝能力強(qiáng),ILA、I3C含量增加。此外ILA與糞便中Lactobacillus和Bifidobacterium呈正相關(guān)。據(jù)報(bào)道,Lactobacillus和Bifidobacterium能夠緩解食物過敏性腹瀉或其他過敏癥狀[25-26],例如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌能夠在結(jié)腸中產(chǎn)生I3C和ILA,激活A(yù)hR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[24,27]。由此看來褐藻多糖和茯苓多糖或許可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群,增加Lactobacillus和Bifidobacterium豐度進(jìn)而改善色氨酸代謝過程,提高ILA和I3C含量,從而改善機(jī)體過敏癥狀。膳食多糖到達(dá)人體結(jié)腸并被腸道菌群發(fā)酵利用,從而可能通過依賴菌群的機(jī)制影響腸道健康,后續(xù)需進(jìn)行膳食多糖在口腔及胃腸道的連續(xù)消化環(huán)節(jié),除此之外還需關(guān)注糞便菌群發(fā)酵后的多糖結(jié)構(gòu)組成變化及除色氨酸代謝物以外的其他菌群代謝物含量變化,同時(shí)體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能完全代表人們食用膳食多糖的體內(nèi)情況,還需進(jìn)一步開展動物實(shí)驗(yàn)或者人群實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該2種多糖物質(zhì)對過敏的作用。