粗根蕁麻不同部位多糖的提取及其對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

楊倩，何舒婷，孟 東，王重娟 ，吳明一

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671003；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，云南昆明 650051；3.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南昆明 650204）

蕁麻（UrticaL.）為被子植物門、蕁麻科、蕁麻屬一年生或多年生草本植物，具有悠久的食用和藥用歷史，其葉子常作為蔬菜用于烹飪，而風(fēng)干的莖和根則可用于泡茶。早在《本草綱目》、《本草圖經(jīng)》中就有記載，蕁麻具有祛風(fēng)通絡(luò)、平肝定驚、消積通便、解毒等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明蕁麻具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效，能夠用于治療前列腺炎、風(fēng)濕病、扭傷疼痛、蕁麻疹、白癜風(fēng)、皮膚瘙癢等疾病[1?3]。蕁麻屬植物在我國產(chǎn)量充沛，在全世界現(xiàn)今所知的36 種蕁麻屬植物中，有23 種分布在我國各地區(qū)，其中粗根蕁麻（Urtica macrorrhizaHand.-Mazz.）具長而粗的木質(zhì)化根狀莖，產(chǎn)量大，療效確切且毒副作用小，具有較高的研發(fā)價(jià)值。

近年來的多項(xiàng)研究表明，蕁麻屬植物中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括黃酮類、多糖類、木脂素類、氨基酸、類胡蘿卜素和脂肪酸等[4?8]。其中多糖是細(xì)胞組成和生命活動(dòng)中不可或缺的物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等多種生物活性[9?12]。Chen等[13]研究表明，蕁麻多糖能夠有效治療前列腺增生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)口服粗根蕁麻粗多糖對(duì)腸道免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，能夠顯著改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的腸道粘膜損害和免疫低下[14?16]。

然而，由于多糖的生理活性及其他方面的特性取決于其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，多糖分子量大小、單糖組成、單糖的連接方式等均會(huì)影響多糖的活性[17?19]，因此，不同來源的多糖由于其結(jié)構(gòu)不同，活性也存在較大差異，導(dǎo)致許多學(xué)者和消費(fèi)者對(duì)其質(zhì)量和功效心存疑慮[20]。蕁麻屬植物的根、莖、葉均可食用和入藥，F(xiàn)aleri 等[21]研究表明異株蕁麻不同部位多糖的結(jié)構(gòu)或組成存在差異，具有不同的用途及功效。但目前關(guān)于粗根蕁麻不同部位多糖的化學(xué)組成及功效差異尚不明確，這是進(jìn)一步開發(fā)粗根蕁麻多糖類的食品及藥品亟需解決的問題。

本文以粗根蕁麻為研究對(duì)象，采用熱水提取、乙醇分級(jí)沉淀法制備不同部位粗多糖，利用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）、單糖組成、紅外等化學(xué)及光譜方法，對(duì)6 種多糖進(jìn)行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的研究。最后以Raw264.7 細(xì)胞為模型，評(píng)價(jià)不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞毒性、形態(tài)、吞噬功能、細(xì)胞因子分泌水平的調(diào)節(jié)作用，以期為粗根蕁麻多糖的免疫活性研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南粗根蕁麻 2021 年7 月采自云南大理，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所楊文光鑒定為粗根蕁麻（Urtica macrorrhizaHand.-Mazz.）的全草；D-葡萄糖醛酸（D-GlcA）、D-葡萄糖（D-Glc）、D-半乳糖（DGal）、D-半乳糖醛酸（D-GalA）、D-N-乙酰葡糖胺（DGlcNAc）美國Sigma 公司；L-鼠李糖（L-Rha）、D-甘露糖（D-Man）、D-阿拉伯糖（D-Ara）Alfa Aesar公司；右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品D0、D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8 中國藥品生物制品檢定所；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、三氟乙酸（TFA）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%過氧化氫（H2O2）天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇和乙腈為色譜純北京邁瑞達(dá)科技有限公司；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)級(jí)Lipopolysaccharides（LPS）來源于大腸桿菌055:B5 美國Sigma公司；中性紅染色劑、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2（MTT）北京索萊寶生物科技有限公司；青鏈霉素美國Millipore 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國HyClone 公司；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：061322220805）；人腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒 深圳欣博盛生物科技有限公司（批號(hào)：M220906-102a）；95%乙醇為市售食品級(jí)，其他試劑均為分析純；小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7 加拿大ABM 公司，培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2，溫度為37 ℃，濕度為95%。

1260 Infinity 高效液相色譜儀 Agilent Technologies 公司；UV-2600 紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Tensor 27 傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；2500A 粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司；FD-1A-50 低溫冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE 2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SQP 十萬分之一天平 Sartorius 科學(xué)儀器有限公司；Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī) 上海力新儀器有限公司；Model 550 全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國 Bio-Rad 公司；DMi1 倒置顯微鏡 德國Leica。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗根蕁麻不同部位粗多糖的制備 采用熱水提取、乙醇分級(jí)沉淀、H2O2脫色的方法提取純化粗根蕁麻多糖[14,22]。分別稱取粗根蕁麻不同部位（根、莖、葉）粉末300 g 置于回流裝置中，加入95%乙醇1.5 L，攪拌條件下，70 ℃回流3 h，重復(fù)2 次，以除去藥材中脂溶性小分子物質(zhì)，收集藥渣，室溫晾干。將藥渣置于回流裝置中，加入去離子水3 L，攪拌條件下，70 ℃回流提取3 h，重復(fù)提取2 次，合并兩次提取液。依次加入95%乙醇，使其終濃度分別為40%、60%（v/v），攪拌后離心（4000 r/min，15 min），分別收集沉淀。加入3 倍量去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH 至9～10。緩慢加入30% H2O2使其終濃度達(dá)3%，50 ℃水浴攪拌反應(yīng)1.5 h。調(diào)節(jié)pH 至中性后將溶液離心（4000 r/min，15 min），上清液中加入終濃度為70%（v/v）的乙醇，離心收集沉淀，重復(fù)操作2 次，收集沉淀。真空干燥箱干燥，即得粗根蕁麻葉粗多糖（UML40、UML60）、莖粗多糖（UMS40、UMS60）、根粗多糖（UMR40、UMR60），提取流程如圖1 所示。不同部位粗多糖產(chǎn)率或占比計(jì)算公式如下：

圖1 粗根蕁麻粗多糖提取分離流程圖Fig.1 Extraction and separation procedure of polysaccharides from Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

1.2.2 多糖分子量的測(cè)定 采用高效凝膠滲透色譜法（High performance gel permeation chromatography，HPGPC）對(duì)多糖分子量分布進(jìn)行測(cè)定[23]。標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的制備：分別稱取粗根蕁麻不同部位多糖（UML40、UML60、UMS40、UMS60、UMR40、UMR60）和右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（180、2700、5250、9750、13050、36800、646500、135350 和2000 kDa）10 mg，加1 mL 去離子水溶解，0.22 μm 濾膜過濾。色譜分析條件：Agilent 1260 HPLC 系統(tǒng)，Agilent 示差檢測(cè)器，Shodex Ohpak SB-806HQ 凝膠色譜柱，流動(dòng)相：0.1 mol/L NaCl，流速：0.5 mL/min，柱溫：35 ℃，示差檢測(cè)器溫度：40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。應(yīng)用GPC 軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：lgMw=10.96?0.501Rt+0.006049Rt2?4.485e?5Rt3（Mw：重均分子量，Rt ：保留時(shí)間），R2=0.9999。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的相對(duì)分子量。

1.2.3 單糖組成分析

1.2.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的制備 分別取D-Man、L-Rha、D-Glc、D-Gal 和D-Ara 單糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg 和D-GlcNAc、D-GlcA、D-GalA 單糖標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg，分別加水定容至10 mL。精密量取各對(duì)照品溶液100 μL，加水定容至1 mL，混勻，即得混合單糖對(duì)照品溶液。各粗根蕁麻粗多糖供試品以去離子水配制成4 mg/mL 溶液。

1.2.3.2 多糖水解和衍生化產(chǎn)物的制備 精密量取各單糖標(biāo)準(zhǔn)制品、單糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液制品和粗根蕁麻粗多糖樣品1 mL，加4 mol/L 的TFA 1 mL，110 ℃水解4 h；蒸干，加200 μL 去離子水溶解，加入200 μL 0.6 mol/L 的NaOH 溶液和400 μL 0.5 mol/L 的PMP甲醇溶液，充分混合；70 ℃衍生化反應(yīng)1 h，HCl 溶液中和后，加入CHCl3萃取3 次，水相經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾后供液相色譜分析。

1.2.3.3 色譜分析條件 色譜柱：Hadesil C18-BIO（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）緩沖液-乙腈（82:18）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：3 μL；DAD 檢測(cè)器，檢測(cè)波長：250 nm，進(jìn)樣時(shí)間：75 min。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程如表1 所示。計(jì)算樣品中各單糖的濃度，將D-Man 的摩爾數(shù)定為1，計(jì)算其它單糖與D-Man 的摩爾比。

表1 各單糖PMP 衍生物的回歸方程和線性范圍Table 1 Regression equations and linear ranges of PMP derivatives of each monosaccharides

1.2.4 光譜分析

1.2.4.1 全波長分析 將UML40、UML60、UMS40、UMS60、UMR40、UMR60 加水溶解至0.25 mg/mL，在190～800 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)掃描。

1.2.4.2 紅外光譜分析 根據(jù)2020 版《中國藥典》第四部的固體壓片法[24]：分別稱取粗根蕁麻不同部位粗多糖各1 mg，加適量KBr 壓片，利用傅里葉變換紅外光譜在4000～400 cm?1波長下掃描。

機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)課程除了由經(jīng)典教學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容歸納的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)以及由“三理”學(xué)科實(shí)驗(yàn)有機(jī)整合的綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目外，還依托學(xué)校的本科生科研訓(xùn)練計(jì)劃（Student Research Training Program，SRTP），展開了面向本科生的開放實(shí)驗(yàn)。SRTP項(xiàng)目的重點(diǎn)在于由學(xué)生自主查閱文獻(xiàn)、立項(xiàng)開題、書寫設(shè)計(jì)報(bào)告，最后完成實(shí)驗(yàn)，具有一定的技術(shù)含量與難度。機(jī)能實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員應(yīng)該視其為教學(xué)相長的過程，積極配合指導(dǎo)教師，協(xié)同指導(dǎo)，高效高質(zhì)量完成開放實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)計(jì)劃[7]。不斷鞏固相關(guān)理論知識(shí)和儀器操作能力，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)儀器使用的統(tǒng)籌安排能力，把機(jī)能實(shí)驗(yàn)開放工作當(dāng)做全新挑戰(zhàn)，豐富教學(xué)科研經(jīng)驗(yàn)。

1.2.5 MTT 法考察粗根蕁麻多糖的細(xì)胞毒性 將Raw264.7 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪入96 孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入含有各濃度粗根蕁麻粗多糖的新鮮培養(yǎng)基（低濃度：0.1 μg/mL、中濃度：1 μg/mL、高濃度：10 μg/mL），每孔150 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO 溶液，振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm 處吸光度A 值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

1.2.6 中性紅實(shí)驗(yàn)考察粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響 將Raw264.7 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪入96 孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入含有各濃度粗根蕁麻粗多糖的新鮮培養(yǎng)基（低濃度：0.1 μg/mL、中濃度：1 μg/mL、高濃度：10 μg/mL），每孔150 μL。以1 μg/mL LPS 為陽性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。棄去培養(yǎng)基，各孔分別加入含有中性紅1 mg/mL 的PBS 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄去上清液，用預(yù)冷的PBS 洗3 遍，每孔加入細(xì)胞裂解液（乙醇:冰醋酸=1:1）100 μL，室溫下放置2 h，待細(xì)胞溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定540 nm處吸光度A 值。吞噬率計(jì)算公式如下：

1.2.7 Griess 和ELISA 法檢測(cè)粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響 Raw264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔鋪入24 孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入含有各濃度粗根蕁麻粗多糖的新鮮培養(yǎng)基（低濃度：0.1 μg/mL、中濃度：1 μg/mL、高濃度：10 μg/mL），每孔500 μL。以1 μg/mL LPS 為陽性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集培養(yǎng)液，?80 ℃保存?zhèn)溆?。分別按照Griess 和ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)培養(yǎng)液中NO 和TNF-α和的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05；采用GraphPad Prism 9 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗根蕁麻不同部位粗多糖產(chǎn)率及性狀

粗根蕁麻葉、莖和根的多糖水提液由深綠色至深棕色，考慮含有色素可能性大，進(jìn)一步脫色，所得粗多糖呈淡黃色，粉末細(xì)膩，具引濕性。粗根蕁麻不同部位粗多糖產(chǎn)率如表2 所示，葉粗多糖產(chǎn)率最高，占總多糖產(chǎn)量的71.74%，莖粗多糖和根粗多糖占比分別為10.71%和17.55%。

表2 粗根蕁麻不同部位粗多糖得率及占比Table 2 The yield and proportion of crude polysaccharide in different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

2.2 粗根蕁麻不同部位粗多糖分子量及分布

由于不同分子量的多糖在低醇中溶解度不同，隨著乙醇量的增加，分子量由大到小的多糖將逐級(jí)沉淀出來，本研究分別采用40%（v/v）和60%（v/v）的乙醇對(duì)各部分粗多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀，不同部位粗多糖的分子量分布曲線如圖2 所示，各部位多糖40%（v/v）乙醇沉淀分子量均大于60%（v/v）乙醇沉淀，這與Gu 等[22]的研究結(jié)果一致。粗根蕁麻葉粗多糖UML40和UML60 的平均重均分子量較小，主要分布在2.11和2.74 kDa；莖粗多糖UMS40 主要分布在68.54 kDa，UMS40 主要分布在61.94 kDa；根粗多糖UMR40分子量較大，主要分布在802.21 kDa，UMR60 主要分布在38.06 kDa。根和莖作為植物能量?jī)?chǔ)存和支撐組織，多為纖維素和果膠等多聚糖構(gòu)成，因而分子量較大，而葉中的多糖主要為光合作用的初級(jí)產(chǎn)物，為低聚多糖，因而分子量較小。

圖2 粗根蕁麻各部位粗多糖的分子量分布曲線Fig.2 Molecular weight distribution curves of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

2.3 單糖組成分析

表3 粗根蕁麻不同部位粗多糖的單糖比例Table 3 Characteristics of monosaccharide composition of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

圖3 經(jīng)PMP 衍生化后的HPLC 圖UML40（A）、UML60（B）、UMS40（C）、UMS60（D）、UMR40（E）、UMR60（F）、標(biāo)準(zhǔn)混合單糖（G）Fig.3 HPLC chromatogram of PMP derivatives of UML40 (A),UML60 (B),UMS40 (C),UMS60 (D),UMR40 (E),UMR60 (F)and standard mixed monosaccharides (G)

2.4 粗根蕁麻不同部位粗多糖的光譜分析

2.4.1 全波長分析 結(jié)果如圖4A 所示，粗根蕁麻葉和根多糖在280 nm 處具有少量吸收，說明樣品中有少量蛋白質(zhì)存在，而莖多糖在260 和280 nm 處均無吸收，說明樣品中不存在核酸和蛋白質(zhì)。

圖4 粗根蕁麻各部位多糖全波長掃描圖（A），紅外光譜圖（B）與二階求導(dǎo)紅外光譜圖（C）Fig.4 Spectroscopic analysis of polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.full wavelength scanning (A),infrared spectrum (B) and second derivative infrared spectrum (C)

2.4.2 紅外光譜分析 粗根蕁麻不同部位粗多糖的紅外光譜見圖4B，6 種多糖的紅外吸收光譜形狀相似，均具有糖類復(fù)合物官能團(tuán)特征吸收峰，3412 cm?1處有較強(qiáng)吸收，這是多糖中O-H 的伸縮振動(dòng)引起的，2932 cm?1處的吸收是C-H 吸收振動(dòng)峰[28]；此外，紅外分析顯示，在1730 cm?1附近未檢測(cè)到明顯的吸收峰，說明粗根蕁麻各部位多糖中的糖醛酸是未酯化的糖醛酸，1644 cm?1處的吸收峰為羧基的C=O 的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[29]。1400～1200 cm?1的吸收峰是CH 鍵的角變振動(dòng)峰；約1000～1200 cm?1顯示為C-OC 和C-O-H 鍵的存在，為吡喃糖的特征峰。920～840 cm?1存在多條吸收帶，提示存在α和β構(gòu)型。紅外光譜結(jié)果表明，各部位粗多糖的特征官能團(tuán)和骨架結(jié)構(gòu)基本一致[30]。二階導(dǎo)數(shù)光譜通過求導(dǎo)使斜率變大峰形狀變尖，能夠更好的分辨紅外光譜圖中重疊的吸收峰。圖4C 為各粗多糖二階求導(dǎo)紅外光譜圖，粗根蕁麻葉、根多糖在1383 cm?1均存在吸收峰，提示其為蛋白結(jié)合多糖；而UMS40和UMS60 在1383 cm?1處無明顯吸收峰，與全波長掃描測(cè)定結(jié)果一致。

2.5 粗根蕁麻不同部位粗多糖的毒性

巨噬細(xì)胞是研究細(xì)胞免疫和分子免疫的重要工具，在機(jī)體免疫應(yīng)答和防御中具有重要作用。因此，本研究選擇小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7 作為細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)粗根蕁麻多糖對(duì)Raw264.7 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。首先通過MTT 法考察了各粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性。結(jié)果如圖5 所示，UML60 具有較大的細(xì)胞毒性，1 μg/mL 的UML60 即可使細(xì)胞存活率降低至80%以下，此外，10 μg/mL 的UMR40 也具有一定的細(xì)胞毒性。其余各多糖在10 μg/mL 濃度以內(nèi)均能使細(xì)胞存活率保持在80%以上。

圖5 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性Fig.5 Toxicity of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.to macrophages

2.6 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

巨噬細(xì)胞的形態(tài)在一定程度上可以反應(yīng)其被激活的程度，本研究考察了不同濃度的粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果如圖6 所示?？瞻讓?duì)照組中巨噬細(xì)胞呈圓形或橢圓形，較少見突起，細(xì)胞內(nèi)未見空泡。采用LPS 處理24 h 后，細(xì)胞體積變大，出現(xiàn)較多偽足和細(xì)胞內(nèi)空泡（白色箭頭所示），細(xì)胞變?yōu)樗笮巍E圓形或不規(guī)則形，呈現(xiàn)激活狀態(tài)。UML40在中濃度和高濃度下能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化，UML60不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化，且中、高濃度下可見巨噬細(xì)胞死亡，說明其具有一定的細(xì)胞毒性，與MTT 檢測(cè)結(jié)果一致。莖多糖UMS40 和UMS60 激活巨噬細(xì)胞的活性均較弱，僅UMS40 在高濃度下能夠促進(jìn)其分化。根多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用最強(qiáng)，各濃度的UMR40 和UMR60 均能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化。

圖6 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.6 Effect of crude polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.on macrophage morphology

2.7 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

通過采中性紅實(shí)驗(yàn)考察粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響，結(jié)果如圖7 所示。低、中濃度的UML40 和各濃度的UMR40 均能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性（P<0.05），且以UMR40 促進(jìn)細(xì)胞吞噬的活性最強(qiáng)，但UMR60 表現(xiàn)出一定的抑制巨噬細(xì)胞吞噬的作用。

圖7 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.7 The phagocytic activity of macrophages of polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.

2.8 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

首先采用Griess 法檢測(cè)了各粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞NO 釋放量的影響，結(jié)果如圖8A 所示，粗根蕁麻根多糖促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO 的活性最強(qiáng)，各濃度的UMR40 和UMR60 均能夠高度顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO（P<0.001），UMR60 的活性隨著濃度的增加而增加，而UMR40 在1 μg/mL 時(shí)活性最強(qiáng)。此外，1 μg/mL 以上的UML40 以及10 μg/mL 的UMS40也能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO（P<0.05）。進(jìn)一步采用ELISA 法檢測(cè)了各粗多糖在高濃度（10 μg/mL）下對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α的影響，結(jié)果與NO 檢測(cè)結(jié)果一致，UMR40 和UMR60 促TNF-α分泌的作用最強(qiáng)（P<0.001），UML60 和UMS60 不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α。

圖8 粗根蕁麻不同部位粗多糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響Fig.8 Effects of polysaccharides from different parts of Urtica macrorrhiza Hand.-Mazz.on cytokine release from macrophages

結(jié)合上述巨噬細(xì)胞活性調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)表明，本研究提取的6 個(gè)粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用存在差異，可能是由各多糖之間的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的。一方面是分子量不同的多糖，其活性可能不同，Zhang等[31]的研究也表明，從云芝中提取的兩種多糖，由于分子量不同，對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用也不同。另一方面單糖組成及其比例不同的多糖活性也不同，如Shen 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，柑橘中的兩種多糖CAVAPI 和CAVAP-II 由相同類型的單糖組成，但D-Ara、D-Man、D-Glc 和D-Gal 的比例存在差異，CAVAPII 表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性。上述研究表明，來自不同部位的6 個(gè)粗根蕁麻多糖在分子量及單糖組成上均存在一定的差異，因此對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用也不同，結(jié)合粗根蕁麻多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的分化、吞噬活性、以及細(xì)胞因子NO、TNF-α分泌的影響這3 個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，粗根蕁麻根多糖具有更強(qiáng)的巨噬細(xì)胞激活作用。

3 結(jié)論

本研究通過熱水提取和乙醇分級(jí)沉淀從粗根蕁麻葉、莖、根中提取得到6 種粗多糖UML40、UML60、UMS40、UMS60、UMR40、UMR60，產(chǎn)率分別為3.60%、1.02%、0.35%、0.34%、0.81%、0.32%；平均重均分子量分別為2.11、2.74、68.54、61.94、802.12、38.06 kDa；6 種粗多糖均為酸性多糖，主要由DGlc、D-Gal、D-Ara 和D-GalA 組成，但不同部位粗多糖的單糖組成摩爾比不同。進(jìn)一步研究了這些多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用，結(jié)果表明，不同部位、不同分子量、不同單糖組成的粗根蕁麻多糖活性存在較大差異，其中UML40、UMS40、UMR40 均能夠顯著活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬活性，并顯著提高巨噬細(xì)胞免疫因子NO、TNF-α分泌水平；UMR60雖然不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬活性但能顯著促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌；UML60 細(xì)胞毒性較大且活性較低；UMS60 在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)不能激活巨噬細(xì)胞?？傮w來說，粗根蕁麻不同部位多糖在組成及免疫調(diào)節(jié)活性上存在一定差異，粗根蕁麻根多糖具有更高的免疫調(diào)節(jié)活性，因此在對(duì)其進(jìn)行研究及開發(fā)利用時(shí)應(yīng)當(dāng)注意質(zhì)量控制并對(duì)根多糖給與更多的關(guān)注。本研究為今后深入研究粗根蕁麻有效成分的結(jié)構(gòu)鑒定及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也可為開發(fā)粗根蕁麻多糖的相關(guān)健康產(chǎn)品提供理論依據(jù)。