基于UPLC-QTOF-MS 的NFC 與FC 楊梅汁差異性代謝產(chǎn)物分析

孫瑞洋，宣曉婷，崔 燕，林旭東，邵興鋒，鄧文藝，凌建剛,

（1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江寧波 315000；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，浙江寧波 315000；3.國(guó)家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，浙江寧波 315000；4.湖南一品東方生物科技有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410000）

楊梅（Myrica rubraSieb.et Zucc）是中國(guó)江南地區(qū)的珍貴水果之一，其營(yíng)養(yǎng)功效豐富、品質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特，含有多種對(duì)人體有益的生物活性成分[1]。但其成熟于江南梅雨季節(jié)，采后極不耐儲(chǔ)，通常被加工成楊梅干和楊梅汁等[2]。非濃縮還原果汁（NFC）是鮮榨果汁經(jīng)巴氏殺菌后直接灌裝而成的，既能保持果實(shí)原有風(fēng)味，又能最大限度的保留果實(shí)中的各種功能性成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但價(jià)格偏高[3?4]。而濃縮還原果汁（FC）是由NFC 果汁經(jīng)濃縮、還原和殺菌等復(fù)雜過程制備而成且價(jià)格偏低，但該過程易導(dǎo)致品質(zhì)風(fēng)味物質(zhì)劣變[5]。對(duì)于NFC 與FC 果汁成分的差異，研究學(xué)者針對(duì)化合物、同位素比例等做了一定的研究。Sun等[6]通過HS-SPME-GC-MS 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)NFC與FC 橙汁鑒別，篩選出25 種差異化合物。有研究學(xué)者對(duì)NFC 與FC 橙汁中穩(wěn)定同位素比率δD、δ18O 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NFC 橙汁的同位素含量明顯高于FC 橙汁[7]。但由于檢測(cè)限、檢測(cè)準(zhǔn)確性等問題限制了上述技術(shù)在果汁行業(yè)的廣泛應(yīng)用。

代謝組學(xué)技術(shù)作為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)后的新興組學(xué)，因其靈敏度、分辨率高等優(yōu)勢(shì)，在食品的品質(zhì)評(píng)估與溯源中得到廣泛應(yīng)用[8?9]。楊天銘等[10]基于UPLC-QTOF-MS 技術(shù)在黃龍病臍橙與正常臍橙中鑒定出28 個(gè)差異化合物。屠燕等[11]基于UPLC-QTOF-MS 技術(shù)在不同產(chǎn)地丹參藥材中鑒定出22 個(gè)差異化學(xué)成分。劉晗璐等[12]基于代謝組學(xué)技術(shù)在NFC 和FC 橙汁中篩選并鑒定出16 種差異化合物。Xu 等[13]利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)NFC橙汁和FC 橙汁進(jìn)行了鑒別，鑒定出13 個(gè)潛在標(biāo)記物，其中7 個(gè)三肽標(biāo)記物首次被報(bào)道。目前對(duì)于NFC/FC果汁的鑒別主要以橙汁為主，對(duì)于楊梅汁的研究主要集中在不同品種、貯藏期間的品質(zhì)及風(fēng)味變化，而對(duì)NFC/FC 楊梅汁的差異性成分研究較少。因此本研究借助UPLC-QTOF-MS 代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析等方法，根據(jù)代謝通路途徑從植物代謝組學(xué)角度初步揭示NFC 楊梅汁和FC 楊梅汁差異代謝產(chǎn)物，旨在為NFC 與FC 楊梅汁成分差異分析提供理論和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)原料為八成熟的仙居?xùn)|魁楊梅（Myrica rubraSieb.et Zucc）采集自中國(guó)浙江省臺(tái)州市。由于楊梅果實(shí)的收獲季節(jié)為5 月至7 月，本研究以每半月取一批次樣品，并將采摘后挑選新鮮無傷害的置于?80 ℃冰箱保存，直至使用；甲醇、乙腈、甲酸質(zhì)譜級(jí)，購(gòu)自Sigma-Aldrich。

MJ-JS2018A 榨汁機(jī) 廣東美的集團(tuán)股份有限公司；DK-S12 電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ExionLC AD 型超高效液相色譜 日本島津公司；QTrap 6500 型四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex 公司；Heraeus Fresco17 離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；MS 3 digital 渦旋振蕩器 德國(guó)IKA 公司；ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm 2.1 mm×100 mm）色譜柱 上海拜力生物科技有限公司；R3088真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國(guó)Senco 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 楊梅汁的制備 參照劉晗璐等[12]的方法并略作修改。NFC 楊梅汁的制備：將冷凍的楊梅果在室溫下解凍后榨汁，使用4 層紗布過濾除去果渣，將過濾的果汁置于耐高壓聚乙烯塑料瓶中進(jìn)行巴氏殺菌（80 ℃，10 min），冷卻至室溫置于?l80 ℃儲(chǔ)存。

FC 楊梅汁的制備：將NFC 楊梅汁置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60 ℃水浴下濃縮1 h 左右直至糖度為60±1oBrix，再使用純凈水復(fù)配至原始糖度值，置于耐高壓聚乙烯塑料瓶中并進(jìn)行巴氏殺菌（80 ℃，10 min），殺菌后迅速冷卻至室溫并置于?80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 樣品前處理 將NFC 和FC 楊梅汁樣品在4 ℃條件下以12000 r/min 離心15 min，取上清液，使用提取液（甲醇：水=3:1）稀釋5 倍，渦旋30 s 將其充分混合，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 進(jìn)樣小瓶中，等待上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣品進(jìn)行6 次平行測(cè)定。

1.2.3 UPLC-QTOF-MS 分析條件 參照Yang 等[14]的方法并略作修改。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH（150 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters Co），柱溫箱溫度為40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL，流動(dòng)相A 為含0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈，洗脫梯度：0.0～0.5 min，98% A、2% B；0.5～10.0 min，98%～50% A、2%～50% B；10.0～13.0 min，5% A、95% B；13.0～15.0 min，98% A、2% B。

質(zhì)譜條件：使用裝備IonDrive Turbo V ESI 離子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質(zhì)譜儀，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）進(jìn)行海量數(shù)據(jù)采集，操作參數(shù)如下：離子噴霧電壓：+5500/?4500 V，簾式氣體：35 psi，溫度：400 ℃，離子源氣體1：60 psi，離子源氣體2：60 psi，DP：±100 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 進(jìn)行整理，結(jié)果用平均數(shù)表示，通過SCIEX 分析軟件（1.6.3 版）進(jìn)行MRM 數(shù)據(jù)的采集和處理。采用SIMCA 16.0 軟件，進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析，利用Origin 2021 軟件繪制代謝物的柱狀圖，同時(shí)利用差異代謝物的KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）進(jìn)行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 NFC 和FC 楊梅汁的代謝產(chǎn)物總體分析

生物代謝組易受外界因素干擾，尤其是在物質(zhì)提取、檢測(cè)分析過程中存在誤差，從而導(dǎo)致樣品間產(chǎn)生差異，如果差異越小說明整個(gè)方法穩(wěn)定性越好數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。為了考察數(shù)據(jù)的質(zhì)量性，數(shù)據(jù)質(zhì)量控制（Quality control，QC）是獲得可重復(fù)性和準(zhǔn)確性代謝組結(jié)果的必要步驟，因此對(duì)QC 樣本的相關(guān)性及內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。QC 樣本相關(guān)性越接近于1（至少應(yīng)≥0.7），說明整個(gè)方法穩(wěn)定性越好數(shù)據(jù)質(zhì)量越高；內(nèi)標(biāo)為外源引入的物質(zhì)，QC 樣本內(nèi)標(biāo)濃度相同，所以內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)差異越小（RSD≤20%），說明系統(tǒng)越穩(wěn)定，數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。從圖1 可以看出，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)分析過程中QC 樣本相關(guān)性達(dá)0.95，RSD 為5.66%，說明本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量很高?；谶~維自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB 及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，在NFC 和FC 楊梅汁中共鑒定出208 個(gè)代謝產(chǎn)物，其中主要包括24 個(gè)黃酮類物質(zhì)、23 個(gè)生物堿類物質(zhì)、17 個(gè)氨基酸及其衍生物、17 個(gè)酚類物質(zhì)等，雖然黃酮和生物堿類物質(zhì)數(shù)量較多，但是氨基酸中脯氨酸的相對(duì)含量最高，氨基酸是果汁中重要的生物活性物質(zhì)之一，對(duì)果汁的口感、氣味和色澤具有重要影響[15]。所以根據(jù)這些代謝物的性質(zhì)進(jìn)一步說明楊梅汁具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味。

圖1 QC 樣本相關(guān)性分析Fig.1 QC sample correlation analysis

2.2 NFC 和FC 楊梅汁的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

為了解NFC 和FC 楊梅汁中代謝物的積累情況，對(duì)兩種楊梅汁進(jìn)行主成分分析（PCA）。代謝組學(xué)分析中，PCA 主要用于觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械慕M間分離是否有異常點(diǎn)出現(xiàn)，以及反映組間和組內(nèi)變異度的分析技術(shù)。主成分分析結(jié)果表明，R2X 代表模型的擬合能力，累積為0.839 大于0.5，Q2代表了模型的預(yù)測(cè)能力為0.451，結(jié)果表明PCA 的模型擬合度較好。從得分圖可以看出，樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)，NFC 楊梅汁樣品點(diǎn)和FC 楊梅汁樣品點(diǎn)分布離散，分別位于PC1 的正負(fù)半軸，說明兩者的代謝成分存在一定差異。PCA 作為一種反映原始數(shù)據(jù)狀態(tài)的無監(jiān)督方法，環(huán)境等其他因素以及系統(tǒng)錯(cuò)誤都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從圖2 中可以看出前兩個(gè)主成分分析的貢獻(xiàn)率分別為15.3%和10.3%，總貢獻(xiàn)率之和較低，無法反應(yīng)整體分散程度。為排除因與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的某些因素引起的代謝變化，應(yīng)用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）進(jìn)一步區(qū)分兩組之間代謝物的差異數(shù)據(jù)，并依據(jù)該模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而準(zhǔn)確地鑒別出具有差異的代謝物[16]。

圖2 NFC 和FC 楊梅汁樣品的PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot of NFC and FC bayberry juice samples

圖3a 為OPLS-DA 得分圖，從圖中可以看出兩組樣本區(qū)分非常顯著，說明兩種果汁樣品的代謝物組成差異較大。為了避免數(shù)據(jù)出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，從而確保模型的有效性，對(duì)模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2，以此評(píng)估OPLS-DA 得分圖是否存在過擬合現(xiàn)象。圖3b 為OPLS-DA 置換檢驗(yàn)圖，橫坐標(biāo)表示置換保留度，縱坐標(biāo)表示R2Y 或Q2值，綠色圓點(diǎn)表示R2Y 值，藍(lán)色方點(diǎn)表示Q2值，兩條虛線分別表示R2Y 和Q2的回歸線。一般認(rèn)為，當(dāng)R2Y 和Q2參數(shù)值越接近于1，說明模型解釋或預(yù)測(cè)的能力越強(qiáng)，而該OPLS-DA 模型的R2Y 為1，Q2為0.744，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況。且從圖中可以看出Q2值均小于R2Y 值，Q2的回歸線與縱坐標(biāo)的截距小于零，一般認(rèn)為截距為負(fù)值時(shí)，說明統(tǒng)計(jì)模型有效，沒有出現(xiàn)過擬合[17]，另外隨著置換保留度的降低，隨機(jī)模型Q2值逐漸減小，說明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過擬合現(xiàn)象。

圖3 NFC 和FC 楊梅汁樣品的OPLS-DA 得分圖（a）和置換模型（b）Fig.3 OPLS-DA score map of NFC and FC bayberry juice samples (a) and displacement model (b)

2.3 差異代謝物的篩選及分析

變量投影重要度（Variable Importance in the Projection，VIP）是OPLS-DA 模型變量的權(quán)重值，可用于衡量各組分積累差異對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度，通常認(rèn)為數(shù)值大于1 時(shí)，變量對(duì)組間分離具有顯著貢獻(xiàn)作用[18]。為了進(jìn)一步確定二者產(chǎn)生差異的代謝物，本研究以差異倍數(shù)（Fold-Change）小于0.5 或大于2，同時(shí)OPLS-DA 模型第一主成分的VIP 大于1為標(biāo)準(zhǔn)，一共篩選到40 個(gè)差異代謝物（如表1），其中主要以黃酮類物質(zhì)為主。

表1 NFC 和FC 楊梅汁差異代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of the number of different metabolites in NFC and FC bayberry juice

為了更清楚的了解楊梅汁濃縮還原前后代謝物差異倍數(shù)的變化情況，制作了如圖4 所示的代謝物差異倍數(shù)柱狀圖，并將排名靠前（上調(diào)和下調(diào)）的20 位代謝物進(jìn)行展示，一般認(rèn)為，當(dāng)Fold-Change>2 時(shí)，值越大差異越明顯；當(dāng)Fold-Change<0.5 時(shí)，值越小差異越明顯，所以結(jié)合Fold-Change 大小篩選出9 個(gè)差異最大的物質(zhì)，分別是下調(diào)物質(zhì)中的5-甲基四氫葉酸、矢車菊素、異黃蝶呤、西瑞香素、對(duì)磺基苯甲酸和花椒毒酚，上調(diào)物質(zhì)中的新橙皮苷、橙皮苷、槲皮素-3-O-新橙皮苷。而它們所對(duì)應(yīng)的Log-Fold change 分別為?4.7980、?3.9503、?3.1808、?1.8727、?1.2862、?1.0272、2.8801、2.5899、2.3240。

圖4 NFC 和FC 楊梅汁代謝物差異倍數(shù)柱狀圖Fig.4 Histogram of the metabolite fold difference between NFC and FC bayberry juice

箱形圖可以直觀表達(dá)每種化合物在NFC 和FC楊梅汁中的含量變化（圖5）。從圖中可以看出，與NFC 楊梅汁相比，F(xiàn)C 楊梅汁中的對(duì)磺基苯甲酸、5-甲基四氫葉酸、矢車菊素、西瑞香素、花椒毒酚和異黃蝶呤物質(zhì)的含量相對(duì)較低，而新橙皮苷、橙皮苷和槲皮素-3-O-新橙皮苷物質(zhì)的含量相對(duì)較高。西瑞香素、花椒毒酚屬于香豆素類化合物，是生藥中的一類重要的活性成分，具有抗菌、抗氧化等多種生物活性功能[19]，但其不溶于冷水，易溶于熱水，濃縮過程中隨著溫度的升高，水分不斷蒸發(fā)，導(dǎo)致其含量有所損失。5-甲基四氫葉酸是合成葉酸活性化代謝的關(guān)鍵產(chǎn)物，在天然葉酸中活性最強(qiáng)，且在人體生命活動(dòng)中起重要作用[20]，但其穩(wěn)定性較差，受溫度、pH 等因素影響，Islam[21]研究發(fā)現(xiàn)蒸煮和微波加熱都使葉酸含量有所損失，與本研究結(jié)果類似，說明濃縮過程中的熱處理會(huì)造成FC 楊梅汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生損失。矢車菊色素是花色苷中常見的一種化合物，而花色苷是黃酮物質(zhì)中呈現(xiàn)紅色的一族化合物，廣泛存在于果蔬、花卉的根莖、花、果實(shí)中，能有效去除自由基，顯示強(qiáng)烈的抗氧化性[22]。花色苷的穩(wěn)定性受多種因素的影響，其中溫度就是一個(gè)及其重要的因素，它對(duì)花色苷的降解具有顯著影響作用，加熱或高溫都可加變色反應(yīng)，尤其是在加熱至沸騰時(shí)極易氧化褪色[23]。張燕等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紅莓的受熱溫度在45～75℃時(shí)，花色苷會(huì)發(fā)生降解，導(dǎo)致其含量及紅值均發(fā)生顯著下降。FC 楊梅汁中這些物質(zhì)含量減少，可能就是由于濃縮過程中水分的蒸發(fā)及加熱處理。

圖5 NFC 和FC 楊梅汁的差異標(biāo)記化合物比較Fig.5 Comparison of differentially labeled compounds in NFC and FC bayberry juice

新橙皮苷、橙皮苷和槲皮素-3-O-新橙皮苷屬于黃酮物質(zhì)，作為水果中主要的生物活性成分之一，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但受溫度影響較大[25]。槲皮素-3-O-新橙皮苷是槲皮素和一種天然類黃酮的代謝產(chǎn)物，而槲皮素是大量存在的一種類黃酮化合物，常以苷類形式存在[26]。但橙皮苷、新橙皮苷、檸檬苦素等是柑橘類水果中常見的苦味代謝產(chǎn)物[27]，其含量的高低對(duì)水果及果汁的感官品質(zhì)具有較大影響[28]。橙皮苷是柑橘類水果白色內(nèi)果皮中發(fā)現(xiàn)的主要的水溶性苦味成分[29]，在加熱過程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸被析出，導(dǎo)致果汁的苦味增加。丁勝華等研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理導(dǎo)致橙皮中橙皮苷、沒食子酸等類黃酮物質(zhì)含量顯著增加[30]。所以綜上，濃縮過程的水分蒸發(fā)和加熱可能就是導(dǎo)致NFC/FC 楊梅汁代謝物產(chǎn)生差異的主要原因。

2.4 差異代謝物代謝通路富集分析

不同的代謝產(chǎn)物在生物體中相互作用，形成不同的代謝通路[31]。為深入了解差異代謝物涉及的代謝路徑，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步對(duì)差異代謝物進(jìn)行顯著性富集分析，從而篩選出二者的差異代謝途徑，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析[32]。根據(jù)鑒定出的代謝物共篩選出48 條代謝通路，將其繪制成氣泡圖，如圖6所示。圖中每一個(gè)氣泡代表一個(gè)代謝通路，而橫坐標(biāo)和氣泡大小表示該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃哟笮。↖mpact 值），Impact 值越大氣泡越大，Impact 值越小氣泡越??；另外縱坐標(biāo)和氣泡顏色表示富集分析的P值（取負(fù)自然對(duì)數(shù)，即-ln（p）），紅色越深代表-ln（p）的值越大，藍(lán)色越深表示-ln（p）的值越小，而顏色越深表示富集程度越顯著。

圖6 NFC 和FC 楊梅汁差異代謝物富集通路氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of differential metabolite enrichment pathways in NFC and FC bayberry juice

通過Impact 值和-ln（p）值綜合分析得到與代謝物差異相關(guān)的代謝途徑，從圖6 中可以看到，NFC 與FC 楊梅汁中的代謝物共參與48 條代謝途徑，其中富集程度較高的代謝通路共有5 條，分別為苯丙氨酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成、單萜生物合成、異喹啉生物堿生物合成和β-丙氨酸代謝。其中苯丙氨酸代謝通路最為顯著，P值為0.19867，-ln（p）為1.6161，富集在此通路上的L-苯丙氨酸在苯丙氨酸脫氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）的作用下生成苯丙素類代謝物（香豆素、萜類、木質(zhì)素、花青素等）[33]，而在苯丙氨酸羥化酶（Phenylalanine hydroxylase，PAH）的催化作用下則會(huì)生成L-酪氨酸。但L-苯丙氨酸穩(wěn)定性受到溫度的影響，受熱時(shí)會(huì)發(fā)生部分降解[34]，導(dǎo)致FC 楊梅汁中香豆素（西瑞香素、花椒毒酚）、矢車菊素、L-酪氨酸含量減少。另外，黃酮和黃酮醇的生物合成這條代謝途徑，P值為0.23889，-ln（p）為1.6161，被檢測(cè)到的代謝物為槲皮素和蘆丁。槲皮素是楊梅中含量較豐富的黃酮醇化合物，其在二氫黃酮醇4-還原酶（Dihydroflavonol 4-reductase，DFR）作用下生成矢車菊素[35]。由于溫度對(duì)黃酮類物質(zhì)穩(wěn)定性有較大影響[36]，所以導(dǎo)致FC 楊梅汁中由槲皮素轉(zhuǎn)化生成的矢車菊素含量降低。所以綜上說明苯丙氨酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成是NFC 與FC 楊梅汁的關(guān)鍵差異代謝途徑。

3 結(jié)論

本研究借助代謝組學(xué)技術(shù)，利用PCA 和OPLSDA 分析了NFC 和FC 楊梅汁代謝產(chǎn)物的差異，并進(jìn)一步識(shí)別潛在的標(biāo)記化合物，為分析NFC 與FC 楊梅汁間差異成分提供了一種有效方法。根據(jù)VIP>1 和Fold-Change>2 或Fold-Change<0.5 篩選出40 個(gè)差異代謝物，基于差異倍數(shù)大小從40 種代謝物中篩選出9 個(gè)差異較大的代謝物。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C 楊梅汁中對(duì)磺基苯甲酸、5-甲基四氫葉酸、矢車菊素、西瑞香素、花椒毒酚和異黃蝶呤等抗氧化活性成分的含量相對(duì)較低，而苦味代謝物（新橙皮苷、橙皮苷和槲皮素-3-O-新橙皮苷）的含量相對(duì)較高。通過對(duì)代謝通路分析，篩選出5 條差異較大的代謝途徑，分別為苯丙氨酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成、單萜生物合成、異喹啉生物堿生物合成和β-丙氨酸代謝。NFC 與FC楊梅汁中篩選出的9 個(gè)差異代謝物是以富集在通路上的L-苯丙氨酸和槲皮素在不同酶的作用轉(zhuǎn)化生成，由于兩種物質(zhì)受溫度的影響，使得轉(zhuǎn)化生成的代謝物含量減少，而L-苯丙氨酸和槲皮素富集所在的通路為苯丙氨酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成。所以綜上結(jié)果顯示，9 個(gè)代謝產(chǎn)物和苯丙氨酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成是NFC 與FC 楊梅汁形成差異的主要代謝物和代謝途徑。本研究說明代謝組學(xué)可用于闡明NFC 和FC 楊梅汁間的成分差異，為二者差異代謝物富集的代謝通路提供研究方向。