牡丹花粉片糖配方優(yōu)化及其消化產(chǎn)物的體外抗氧化活性評價

范彬，彭騰騰，王 信，沈 薇，馬趣環(huán)，王新娣，劉東彥，尹盼盼，李海燕，石曉峰,

（1.甘肅省醫(yī)學科學研究院，甘肅蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅蘭州 730000）

牡丹（Paeonia suffrutcosa）為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect.Moutan）多年生落葉灌木，因其花色艷麗，花朵碩大，被譽為“花中之王”[1?2]。牡丹除具有重要的觀賞價值外，其根、皮、花和籽均具有很高的藥用、營養(yǎng)和食用價值[3]。牡丹花粉營養(yǎng)豐富，含所有人體所需的常量、微量元素，且遠高于牡丹花瓣和牡丹籽油，蛋白含量遠高于其他40 種常見的植物類花粉[4?7]。牡丹花粉雖具有較高的保健價值，目前開發(fā)的相關產(chǎn)品有口服液[8]、酸奶[9]、保健面條[10]等，對其開發(fā)利用仍存在產(chǎn)品形式單一、精深加工滯后等問題[11]。隨著人們消費習慣和健康理念的轉變，無糖食品越來越受到消費者的重視[12]，無糖片糖是近年來市場上出現(xiàn)的一種新型的便攜食品，具有環(huán)保、無糖、保質(zhì)期較長、食用方便并具有功能性等特點[13]。實驗中采用糖醇為輔料，對牙齒具有良好的保健作用[14]，其中異麥芽酮糖醇具有高穩(wěn)定性、低熱量、甜味自然、吸濕性小等特性[15]，更適合于功能性食品的開發(fā)。

本文以牡丹花雄蕊上的孢子、牡丹的繁殖細胞，即牡丹花粉為原料，研制一種機械化生產(chǎn)、成本低、服用攜帶方便，易被特殊人群（如三高、糖尿?。┫M，適合各年齡段的人食用的花粉產(chǎn)品，并對牡丹花粉片糖的體外抗氧化性進行研究，為延伸牡丹的進一步精深加工和開發(fā)提供實驗室依據(jù)，以確保牡丹花粉藥食兩用價值得到充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹花粉 蘭州新區(qū)中川牡丹園基地2022 年6月采收；木糖醇 山東福田藥業(yè)有限公司；異麥芽糖醇 廣西維科特生物技術有限公司；蘋果酸 安徽雪狼生物科技股份有限公司；阿斯巴甜 江蘇漢光甜味劑有限公司；檸檬酸 濰坊英軒實業(yè)有限公司；甘露醇 青島明月海藻有限集團有限公司；以上輔料均為食品級；DPPH 和ABTS 美國Sigma 公司；抗壞血酸（VC）國藥集團化學試劑有限公司。

TDP-1.5 型單沖壓片機 上海綠翊機械造有限公司；YD-20KZ 型片劑硬度儀 天津市天大天發(fā)科技有限公司；SHZ-8 型恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；ZB-ID 型智能崩解儀 天河醫(yī)療儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹花粉片糖的制備 將各原輔料粉碎過80 目篩，取適量牡丹花粉與適量填充劑（木糖醇-甘露醇）、甜味劑（異麥芽糖醇）和矯味劑（阿斯巴甜-檸檬酸-蘋果酸）粉碎混合均勻，加70%乙醇潤濕，混合攪拌，所得軟材過18 目篩制粒，將制粒好的物料于50 ℃烘箱干燥，干燥后的物料經(jīng)30 目篩整粒，整粒后的顆粒加入適量的硬脂酸鎂混合壓片[16]，即得。

1.2.2 單因素實驗 查閱文獻和預實驗基礎上，選擇木糖醇-甘露醇（4:1，g/g），阿斯巴甜-檸檬酸-蘋果酸比例（1:1:1，g/g）用量8%，潤滑劑硬脂酸鎂用量1%，在填充劑、甜味劑、牡丹花粉各用量分別為3.0、0.5、0.5 g 的條件下，按“1.2.1”項下的方法制備牡丹花粉片糖，選擇填充劑用量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g）、甜味劑用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g）、牡丹花粉用量（0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 g）進行單因素實驗。

1.2.3 Box-Behnken 響應面試驗 根據(jù)單因素實驗結果，應用Box-Behnken 試驗設計原理[17]，以牡丹花粉（A）、填充劑（B）、甜味劑（C）用量為自變量，以質(zhì)量評價的綜合評分（R）作為響應值進行響應面優(yōu)化，對牡丹花粉片糖的配方工藝進行優(yōu)化，試驗因素水平表見表1。

表1 響應面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of RSM test

1.2.4 牡丹花粉片糖質(zhì)量評價方法

1.2.4.1 感官指標評分 牡丹花粉片糖的感官指標包括外觀和口感評價[18]，隨機抽取10 名志愿者進行評價，其中裂片、松片或過酸或過甜、花粉味重，記0～3 分；表面粗糙、花片或微酸、微甜，記4～6 分；表面光潔、有光澤或酸甜可口，記7～9 分。

1.2.4.2 硬度評分標準 將牡丹花粉片糖徑向固定于片劑硬度儀兩橫桿之間，活動柱桿自動沿水平方向加壓，當牡丹花粉片糖碎裂，記錄硬度值，每組測6 片，計算平均值。按測得的硬度值的大小范圍給予評分，硬度小于150 N，記1 分；150～200 N 之間，記2 分；大于200 N，記3 分，滿分3 分。

1.2.4.3 崩解時限評分標準 按《中華人民共和國藥典》2020 年版（四部）崩解時限檢查法[19]測定，崩解時限小于5 min 或大于15 min，記1 分；5～8 min 或10～15 min，記2 分；8～10 min，記3 分，滿分3 分。

1.2.4.4 質(zhì)量評價方法的建立 以牡丹花粉片糖的感官評價、硬度、崩解時限為評價指標，綜合評分=感官評價×0.6+硬度×0.2+崩解時限×0.2[20]。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 模擬人體消化液的配制 參考相關文獻[20]，配制體外抗氧化活性所需消化液，其中模擬唾液中α-淀粉酶、模擬胃液中胃蛋白酶和模擬腸液中胰蛋白酶的酶活力分別達到200、2000 和75 U/ mL。

1.2.5.2 模擬人體消化樣品的制備 取適量牡丹花粉片糖于研缽中，研磨成細粉，精密稱定2.0 g，于錐形瓶，加入模擬唾液25 mL，密閉，于搖床（37 ℃、180 r/min）孵育10 min 后，沸水浴滅酶10 min，快速冷卻，加入無水乙醇25 mL，離心（5000 r/min），取上清液于50 mL 容量瓶中，超純水定容至刻度[21]。模擬胃液和腸液的消化樣品制備時，相同條件下孵育2 h，其余制備方法同模擬唾液的消化樣品的制備[21?22]。

1.2.5.3 模擬人體累加消化樣品的制備 取適量牡丹花粉片糖于研缽中，研磨成細粉，精密稱定2.0 g，于錐形瓶，加入模擬唾液25 mL，密閉，于搖床（37 ℃、180 r/min）孵育10 min 后，5 mol/L HCL 溶液調(diào)pH約1.2，加入胃蛋白酶0.08 g，孵育2 h，1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 約6.8，加入胰蛋白酶0.0125 g 和膽酸鈉0.625 g，孵育2 h，待模擬人體消化完畢后，與“1.2.5.2”項下相同條件下滅酶、冷卻和離心，制備累加消化樣品[23?24]。

1.2.5.4 DPPH 自由基清除能力測定 分別吸取一定量的各模擬消化樣品、累加消化樣品及對照品VC溶液，配制成2、6、10、14、18 mg/mL 的溶液[20]，準確吸取上述溶液各1 mL 于10 mL 的比色管中，加入2 mL DPPH（0.2 mmol/L）溶液和2 mL 超純水，避光反應30 min，以無水乙醇為參比，于517 nm 處測定樣品吸光度值（A1）和空白溶液吸光度值（A0）[25?26]，計算牡丹花粉片糖各消化樣品對DPPH 自由基的清除率MDPPH（%），清除率公式為：

1.2.5.5 ABTS+自由基清除能力測定 分別吸取一定量的模擬消化樣品、累加消化樣品及對照品VC溶液，配制成1、2、3、4、5、6 mg/mL 的溶液，準確吸取上述溶液各1 mL 于10 mL 的比色管中，加入2 mL ABTS 工作液（2 份35 mol/L 的ABTS 溶液和1 份25 mol/L 的K2S2O8溶液混勻，避光12 h，臨用前用無水乙醇稀釋，吸光度0.6±0.1）和1 mL 超純水，以超純水為參比，于734 nm 處測定樣品吸光度值（A1）和空白溶液吸光度值（A0）[16]，計算牡丹花粉片糖各消化樣品對ABTS+自由基的清除率MABTS（%），清除率公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert.V 8.0.6 軟件對響應面模型數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合；使用 SPSS 22.0 軟件各項試驗數(shù)據(jù)進行方差分析及顯著性檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 填充劑用量的篩選 結果見圖1。隨填充劑用量的增大，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，所制軟材細粉逐漸增多，顆粒均勻，易于制粒，硬度變小，崩解時間明顯降低；所含的木糖醇成分的增多，片劑酸味逐漸變?nèi)酢．斕畛鋭┯昧窟_到3.0 g 時，制粒和壓片效果較好，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分最高。綜合上述，選擇填充劑用量2.0、3.0、4.0 g 三個水平進行響應面試驗。

圖1 填充劑用量的考察Fig.1 The investigation of filler dosage

2.1.2 甜味劑用量篩選 結果見圖2。固定填充劑用量，隨著甜味劑用量的逐漸增大，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分上升趨勢平緩，軟材的黏性逐漸變小，所制得的顆粒均勻，牡丹花粉片糖的硬度適中，當甜味劑增大至2.0 g 時，軟材的黏性小，細粉較多，牡丹花粉片糖的硬度小，崩解時限變小，使牡丹花粉片糖的酸味逐漸變?nèi)?，甜味增加明顯。綜合上述，選擇甜味劑用量1.0、1.5、2.0 g 三個水平進行響應面試驗。

圖2 甜味劑用量的考察Fig.2 The investigation of sweetening agent dosage

2.1.3 牡丹花粉用量考察 結果見圖3。隨著花粉用量的增加，牡丹花粉片糖的質(zhì)量評價綜合評分下降的趨勢明顯，制得的顆粒細粉多，硬度變小，出現(xiàn)松片或花片現(xiàn)象，牡丹花粉片糖的花粉味加重，澀感逐漸增強，當牡丹花粉用量為0.75 g 時，牡丹花粉片糖的酸甜度適中，口感和硬度適中。綜合上述，選擇牡丹花粉用量0.50、0.75、1.00 三個水平進行響應面實驗。

圖3 牡丹花粉用量的考察Fig.3 The investigation of peony pollen dosage

2.2 響應面法優(yōu)化試驗

2.2.1 方案設計及試驗結果 根據(jù)表1 進行響應面優(yōu)化實驗，研究牡丹花粉、填充劑、甜味劑與牡丹花粉片糖的綜合評分之間的關系，實驗結果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計方案及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert.V 8.0.6 軟件對表2 的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得牡丹花粉片糖對牡丹花粉（A）、填充劑（B）、甜味劑（C）用量的二次多項回歸模型方程為：R=?25.0388+42.99400A+6.98350B+6.65200C?2.07000AB+2.30000 AC+1.106500BC?29.71600A2?1.10725B2?3.54900C2，分析實驗結果見表3。

表3 回歸統(tǒng)計分析結果Table 3 Result of regression statistical analysis

由表3 可知，三個因素中填充劑對牡丹花粉片糖配方工藝影響最小。模型的F=164.37（P<0.0001），表明模型方程具有高度的顯著性；失擬項F=3.50（P>0.05），表明模型擬合合理[27]。模型的決定系數(shù)為R2=0.9953，說明回歸方程擬合度高、誤差小[28]，表明了該模型可用于牡丹花粉片糖配方工藝的優(yōu)化。試驗結果顯示，A（牡丹花粉）、B（填充劑）、C（甜味劑）、AB、BC、A2、B2和C2項具有極其顯著的影響（P<0.05），可以得出各項考察因素對牡丹花粉片糖的工藝影響除具有線性關系外，還存在一定的交互綜合影響，可采用該線性回歸方程對其配方工藝進行分析與預測。

2.2.3 響應面試驗分析與優(yōu)化 圖4 為各兩兩實驗因素對牡丹花粉片糖配方工藝綜合評分的響應面圖和等高線圖。響應面圖均為凸形曲面圖，存在最高點，響應面曲線圖的陡峭程度直觀反映了各因素工藝的影響，坡度越陡，說明實驗因素對綜合評分的影響越大，坡度平緩則影響較小[29]，等高線圖中，兩兩交互因素之間交互作用的強弱表現(xiàn)為圖中橢圓程度和密集程度，等高線較密，趨于橢圓形交互作用越強[30]。由此可見，因素A 和因素C 對牡丹花粉片糖配方工藝感官評分的影響最大；各因素交互作用對牡丹花粉片糖配方工藝感官評分的影響的顯著性，依次為：BC>AB>AC，這與方差分析結果相一致。

圖4 各因素用量交互作用對綜合評分影響的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface maps and contour lines of the influence of various factors on the comprehensive scoring

2.2.4 最佳配方工藝優(yōu)化與驗證 通過回歸模型方程的預測，得出牡丹花粉片糖的最佳配方為：牡丹花粉0.68 g、填充劑3.32 g、甜味劑1.65 g，考慮到實驗條件的可操作性，將其參數(shù)進行修正，確定的最佳配方比為牡丹花粉：牡丹花粉0.7 g，填充劑3.3 g，甜味劑1.7 g。在此最優(yōu)配比條件下進行驗證實驗，平行實驗3 次，結果發(fā)現(xiàn)牡丹花粉片糖的綜合評分為6.39，模型預測值為6.42，兩者吻合良好。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 由圖5 可見，牡丹花粉片糖各模擬消化樣品均對DPPH 自由基有一定的清除力，其清除能力依次為：腸液消化樣品>唾液消化樣品>胃液消化樣品，腸液消化樣品對DPPH 自由基清除率的IC50值最小，表明抗DPPH 自由基活性成分主要在腸液中消化，累加消化樣品的清除率最高值為91.56%，IC50值為5.720±0.478 mg/mL。

圖5 模擬各消化樣品對DPPH 自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of simulated digestion sample to DPPH free radical

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 如圖6 可見，牡丹花粉片糖各模擬消化樣品均對ABTS+自由基有一定的清除力，其清除能力依次為：胃液消化樣品>腸液消化樣品>唾液消化樣品，胃液消化樣品對ABTS+自由基清除率的IC50值最小，表明抗ABTS+自由基活性成分主要在胃液中消化，累加消化樣品的清除率最高值為96.42%，IC50值為1.451±0.114 mg/mL。

圖6 模擬各消化樣品對ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of simulated digestion sample to ABTS+ free radical

3 結論

牡丹花粉片糖的生產(chǎn)受填充劑、潤滑劑和甜味劑用量等諸多因素的影響，在單因素實驗中，選擇填充劑木糖醇-甘露醇比例為4:1，矯味劑用量為8%，潤濕劑為70%乙醇，潤滑劑硬脂酸鎂用量為1%，進行濕法制粒壓片。通過響應面法優(yōu)化得到牡丹花粉片糖配方工藝為：將0.7 g 牡丹花粉，3.3 g 填充劑和1.7 g 甜味劑混合均勻，加入70%乙醇潤濕制軟材，過18 目篩制粒，50 ℃條件下干燥，30 目篩整粒，所得顆粒與1%硬脂酸鎂混合后壓片，得到牡丹花粉片糖，在此配方條件下制作的牡丹花粉片糖片面光滑、硬度適中、口感較好，無明顯澀感，質(zhì)量評價綜合評分較高，符合相關要求。

為評價牡丹花粉片糖抗氧化活性，實驗測定了牡丹花粉片糖模擬人體各消化樣品的DPPH 和ABTS+自由基的清除率。結果顯示，腸液消化樣品對DPPH自由基的清除能力較強，而胃液消化樣品對ABTS+自由基的清除能力較強，其累加消化樣品的最高清除率分別為91.56%和96.42%。