響應(yīng)面優(yōu)化博愛(ài)赤松茸多糖提取工藝及其抑菌和抗氧化活性研究

魏磊，王 偉，謝曉陽(yáng)，周 雍，劉雨晴，馬艷妮，寧二娟，王 韜，李寧潔，景炳年

（河南省科學(xué)院，河南省納普生物技術(shù)有限公司，河南省植物天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002）

赤松茸（Stropharia rugosoannulata）作為食用菌新秀[1]，因其食味清香，肉質(zhì)滑嫩柄爽脆，且富含18 種氨基酸（包括8 種人體必需氨基酸）、多種礦物質(zhì)與微量元素，以及多糖、甾醇、黃酮等生物活性成分[2?3]，而被冠之“素中之葷”的美稱[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，赤松茸提取物，特別是赤松茸多糖具有抗氧化[5]、抑菌[6]、抑制腫瘤[7]、降血糖[8]及增強(qiáng)小鼠免疫力[9]等諸多藥理作用成為研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)赤松茸多糖的研究主要集中在赤松茸胞外多糖的培養(yǎng)條件優(yōu)化[10?11]、赤松茸多糖或發(fā)酵菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化[12?14]、赤松茸多糖（硒多糖）的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及生物活性評(píng)價(jià)等方面[15?17]。這些研究進(jìn)一步表明赤松茸多糖具有極大研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

本研究室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，博愛(ài)縣赤松茸因其特殊的竹下栽培模式和種植環(huán)境，導(dǎo)致博愛(ài)赤松茸在營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)含量方面與其它栽培模式下的赤松茸存在很大的差異[18]。博愛(ài)赤松茸多糖的含量為（13.18%±0.05%）[2]，要高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的多糖含量（6.3%）[19]，且博愛(ài)赤松茸富含硒（2.57±0.47）mg/kg[2]。目前對(duì)赤松茸的富硒方式主要是通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)，但關(guān)于天然富硒赤松茸的研究較少。硒多糖是硒在食用菌中的主要賦存形式之一，兼具硒和多糖的雙重生物活性，具有比未富硒多糖更高的抗氧化、增強(qiáng)免疫，抗腫瘤等生物活性[20?21]。苗元振的研究也表明赤松茸硒多糖抗氧化能力更優(yōu)于多糖[22]。博愛(ài)赤松茸中的硒是否以硒多糖的形式存在及生物活性是否增強(qiáng)也尚未可知。而研究上述問(wèn)題的前提就是如何高效獲得博愛(ài)赤松茸多糖。

為此，本研究以獲得高效提取博愛(ài)赤松茸多糖工藝為目標(biāo)，采用響應(yīng)曲面方法（response surface methodoloy，RSM）進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，并研究其抑菌和抗氧化活性，旨在為博愛(ài)天然富硒赤松茸和赤松茸多糖的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤松茸 購(gòu)自博愛(ài)縣祥竹種植專業(yè)合作社赤松茸種植基地，采收于2021 年6 月；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）天津市博迪化工有限公司；苯酚 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、鼠傷寒沙門氏 菌（Salmonella typhimurium）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）均由河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)試驗(yàn)室提供；Oxoid 胰蛋白胨 上海艾研生物科技有限公司；牛肉浸膏 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；微量MIC 測(cè)定板 美國(guó)Corning 公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒、ABTS 自由基清除能力檢測(cè)試劑盒 均購(gòu)置索萊寶生化試劑盒事業(yè)部。

ME-204 型電子天平 美國(guó)Mettler 公司；KQ-500E 型超聲波清洗儀（功率500 W，頻率40 kHz）昆山市超聲儀器有限公司；RE100-S-數(shù)顯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；TU-1810 型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；YJ-VS-2 型超凈工作臺(tái) 無(wú)錫一凈凈化設(shè)備有限公司；LDZF-75L-II 立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 博愛(ài)赤松茸多糖提取工藝 采用超聲輔助法提取博愛(ài)赤松茸多糖，具體工藝如下：將干燥至恒重的博愛(ài)赤松茸粉碎過(guò)40 目篩，精密稱取博愛(ài)赤松茸粉末1 g 置于100 mL 錐形瓶中，按不同液料比加入蒸餾水浸泡12 h，在不同溫度和不同時(shí)間下超聲提取3 次，濾液合并后濃縮，定容至50 mL，搖勻備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1 中的方法，在料液比1:25（g/mL）、超聲時(shí)間60 min 的條件下，考察20、30、40、50、60、70 ℃超聲溫度對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率的影響；在最佳超聲溫度、超聲60 min 條件下，考察1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35（g/mL）料液比對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率的影響；在最佳提取料液比、最佳提取超聲溫度的條件下，分別考察20、30、40、50、60、70 min 超聲時(shí)間對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 以多糖得率作為響應(yīng)值，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)，對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

1.2.4 博愛(ài)赤松茸多糖含量及得率的測(cè)定 參考NY/T 1676-2008 的方法進(jìn)行[23]。以葡萄糖（0.1 g/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)品，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，求得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸線方程為：A=0.01027C+0.25195，R2=0.9981。精密吸取1.2.1 中的待測(cè)多糖提取液0.2 mL 于20 mL 具塞試管中，同法操作進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)液中多糖質(zhì)量濃度，并按下式計(jì)算各處理的多糖得率：

式中：c 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；v 為提取液體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為原料重量，g。

1.2.5 博愛(ài)赤松茸多糖提取物抑菌活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[24]的方法測(cè)定博愛(ài)赤松茸多糖提取物的MIC和MBC。利用二倍稀釋法將博愛(ài)赤松茸多糖稀釋成質(zhì)量濃度分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 mg/mL，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.1 mL 稀釋好的博愛(ài)赤松茸多糖和0.1 mL 濃度為 1×106～1×108CFU/mL 的菌懸液，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h 觀察結(jié)果，完全沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)即為 MIC。在MIC 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用平板涂布法測(cè)定MBC。

1.2.6 博愛(ài)赤松茸多糖提取物的抗氧化活性測(cè)定參照ABTS 試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法測(cè)定博愛(ài)赤松茸多糖提取物對(duì)自由基的清除效果，反應(yīng)體系中博愛(ài)赤松茸多糖的質(zhì)量濃度分別為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0 mg/mL，以VC作為對(duì)照組；參照T-OAC 試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法測(cè)定博愛(ài)赤松茸多糖提取物總抗氧化能力，反應(yīng)體系中博愛(ài)赤松茸多糖的質(zhì)量濃度分別為0.008、0.04、0.2、1、5 mg/mL，以VC作為對(duì)照組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 7.5 軟件繪制趨勢(shì)曲線圖；使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)；Design-Expert 8.0.6 對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲溫度對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率的影響 由圖1 可知，在料液比1:25（g/mL）、超聲時(shí)間60 min固定條件下，博愛(ài)赤松茸多糖得率隨超聲溫度的升高呈先升后降趨勢(shì)，在60 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最高，為11.94%，說(shuō)明在60 ℃時(shí)，赤松茸多糖的溶出效果最佳，溫度再升高時(shí)，伴著超聲波的空化作用，可能引起多糖的裂解，導(dǎo)致多糖得率下降[25]。因此，超聲溫度選60 ℃為宜。

圖1 超聲溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield

2.1.2 料液比對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率的影響 由圖2可知，在設(shè)定的料液比水平范圍內(nèi)，博愛(ài)赤松茸多糖得率隨料液比增加呈先升后降趨勢(shì)，在料液比1:10～1:25 g/mL 時(shí)，多糖得率增幅比較大；在1:25～1:30 g/mL 區(qū)間時(shí)，多糖得率趨于平穩(wěn)，表明液料比在此區(qū)間時(shí)，絕大部分多糖已溶出并達(dá)到了平衡，溶劑的增多對(duì)多糖溶出度的影響較小，但再繼續(xù)增加料液比，多糖得率呈明顯下降趨勢(shì)，這可能是由于溶劑用量增大，導(dǎo)致超聲波對(duì)赤松茸粗粉作用力減弱。因此，料液比以1:30 g/mL 為宜。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid on polysaccharide yield

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率的影響 從圖3 中可以看出，在20～50 min 這一區(qū)間內(nèi)，超聲時(shí)間的增加顯著提高了赤松茸多糖的溶出效果（P<0.05）；在50～60 min 這一區(qū)間內(nèi)，赤松茸多糖溶出效率趨于平緩，在超聲時(shí)間60 min，赤松茸多糖已基本溶出，得率最大值為13.55%；之后再增加超聲時(shí)間，多糖得率下降較為顯著（P<0.05），可能是因長(zhǎng)時(shí)間超聲使赤松茸中部分多糖類化合物發(fā)生降解[26?27]，同時(shí)雜質(zhì)溶出也會(huì)增加，導(dǎo)致赤松茸多糖得率不升反降，所以超聲時(shí)間以60 min 為宜。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonication time on polysaccharide yield

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化博愛(ài)赤松茸多糖得率的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and experiments results of response surface methodology

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 采用Design-Expert 12.0 軟件進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=13.25+0.6475A+0.19135B+0.1862C?0.1800AB+0.0550AC?0.0375BC?1.38A2?1.30B2?0.5687C2

由表3 可知，該模型P<0.0001，表明該模型高度顯著，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理可信；失擬項(xiàng)P=0.0546，不顯著，表明其它未知因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小；模型的決定系數(shù)R2=0.9939，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9861，兩者較為接近，表明該模型擬合性良好，可用于分析和預(yù)測(cè)博愛(ài)赤松茸多糖提取工藝；變異系數(shù) CV 為1.19%，遠(yuǎn)小于10%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度和可信度較高，模型擬合度好，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以用來(lái)優(yōu)化博愛(ài)赤松茸多糖超聲提取工藝；該模型的信噪比為34.6104，大于4，表明該模型具有良好的分辨能力，可以用來(lái)預(yù)測(cè)。另外，從F值可以看出，本實(shí)驗(yàn)中3 個(gè)因素對(duì)赤松茸多糖得率的影響程度次序?yàn)椋篈（超聲溫度）>B（料液比）>C（超聲時(shí)間）。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 圖4 為各兩因素交互作用對(duì)赤松茸多糖得率影響的響應(yīng)面與等值線圖，從圖可以看出，3D 響應(yīng)面圖均為開(kāi)口朝下的凸形曲面，表明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在最高點(diǎn)；等高線為橢圓形，表明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在中心點(diǎn)，綜合響應(yīng)面和等高線圖，可知在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)可以獲得赤松茸多糖超聲提取最優(yōu)工藝。實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響力大小可以從響應(yīng)曲面的陡峭程度來(lái)推斷，曲面越陡，影響力越大，反之則越小，因此，本實(shí)驗(yàn)中3 個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率的影響依次為，超聲溫度>料液比>超聲時(shí)間，這與方差分析結(jié)果相一致?？偟膩?lái)看，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)多糖得率響應(yīng)值的影響均不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大的影響，其中超聲溫度和料液比交互項(xiàng)對(duì)多糖得率的影響達(dá)到了顯著水平（P<0.05）。

圖4 各兩因素交互作用對(duì)博愛(ài)赤松茸多糖得率影響的響應(yīng)面與等值線圖Fig.4 Response surface and contour plot of the interaction of each two factors on the yield of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County

通過(guò)分析軟件，求得博愛(ài)赤松茸多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)為超聲溫度62.34 ℃、料液比1:30.275（g/mL）、超聲時(shí)間61.73 min，在此條件下赤松茸多糖的理論預(yù)測(cè)含量為13.35%。

結(jié)合實(shí)際操作，將博愛(ài)赤松茸多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)修正為：超聲溫度62 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時(shí)間62 min，在此條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3 次，測(cè)得博愛(ài)赤松茸多糖的平均得率為13.25%，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.75%，表明由該理論模型得到博愛(ài)赤松茸多糖最優(yōu)提取工藝是可行的，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 為博愛(ài)赤松茸多糖提取物對(duì)5 種供試菌的抑制活性結(jié)果，由表可知博愛(ài)赤松茸多糖提取物僅對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制作用，其MIC 和MBC分別為6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌具有一定的抑制作用，其MIC 和MBC 均在25 mg/mL 以上；對(duì)大腸桿菌和化膿性鏈球菌在供試濃度范圍無(wú)明顯抑制作用。

表4 博愛(ài)赤松茸多糖對(duì)5 種常見(jiàn)致病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of antimicrobial tests for the effects of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County on 5 kinds of common pathogens

2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5 可知，博愛(ài)赤松茸多糖提取物對(duì)ABTS+自由基清除效果隨濃度升高而增加，呈明顯量效關(guān)系，在5 mg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)90.60%，但在檢測(cè)范圍內(nèi)，博愛(ài)赤松茸多糖對(duì)ABTS+自由基清除能力整體低于VC。采用 SPSS22.0 軟件進(jìn)行回歸擬合，計(jì)算得博愛(ài)赤松茸多糖提取物對(duì)ABTS+自由基清除率的IC50為0.54 mg/mL，遠(yuǎn)小于10 mg/mL，一般認(rèn)為，某物質(zhì)的 IC50在10 mg/mL 以下時(shí)，表明其具有較好的抗氧化活性[28]，因此博愛(ài)赤松茸多糖提取物的抗氧化性有潛在的研究?jī)r(jià)值。

圖5 博愛(ài)赤松茸多糖清除ABTS+自由基能力測(cè)定Fig.5 ABTS+ radical scavenging capacity of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County

在593 nm 下，以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：Y=19.569X?0.0344，相關(guān)系數(shù)R2=0.9911。由圖6 可知，在0.008～5 mg/mL 供試濃度范圍內(nèi)，博愛(ài)赤松茸多糖提取物對(duì)Fe3+的還原能力隨濃度的升高而增加，但在相同供試濃度下，博愛(ài)赤松茸多糖的總抗氧化能力要弱于VC。

圖6 博愛(ài)赤松茸多糖的總抗氧化能力Fig.6 The total antioxidant capacity of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County

3 討論與結(jié)論

多糖是赤松茸的主要活性成分，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和前景，因而對(duì)其活性成分的提取分離就顯得尤為重要。杜敏華等[12]采用正交試驗(yàn)也得到了赤松茸多糖的最優(yōu)提取工藝，提取溫度65 ℃、提取時(shí)間1.0 h、超聲波功率600 W、料液比1:35（g/mL），此條件多糖得率為8.16%。該正交試驗(yàn)所得赤松茸多糖最優(yōu)提取工藝條件和本研究所得最優(yōu)提取工藝條件除超聲波功率外，其它條件較為接近，但多糖得率比本研究低38.42%，導(dǎo)致二者多糖得率差異較大的主要原因可能是實(shí)驗(yàn)所用赤松茸樣品不同。此外，赤松茸采摘時(shí)間、超聲功率及工藝優(yōu)化所采用的方法等也會(huì)對(duì)赤松茸多糖得率造成一定的影響。

本研究抑菌實(shí)驗(yàn)表明，博愛(ài)赤松茸多糖提取物的殺菌譜比較窄，其僅對(duì)鼠傷寒沙門氏菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌具有一定的抑制活性，但對(duì)大腸桿菌和化膿性鏈球菌在供試濃度范圍無(wú)明顯抑制作用，這與翁敏劼[29]的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致，但與王瑞瑞[30]的結(jié)果差異較大。王瑞瑞[30]的研究表明，25 mg/mL 的赤松茸胞外多糖對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均在90%以上，導(dǎo)致本研究與王瑞瑞赤松茸多糖抑菌效果差異較大的原因可能是因赤松茸子實(shí)體多糖和菌絲體胞外多糖在結(jié)構(gòu)方面存在較大差異。

本研究結(jié)果表明，博愛(ài)赤松茸多糖具有很強(qiáng)的體外抗氧化活性，且其含量與ABTS+自由基清除率、Fe3+還原能力呈正相關(guān)性。赤松茸多糖的抗氧化活性及免疫活性是其最主要的活性，也是目前多糖研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前的研究顯示，赤松茸多糖具有比香菇、姬松茸等食用菌多糖更強(qiáng)的清除·OH 和·O2?的能力[31]，且能通過(guò)對(duì)自由基的清除、血液和組織抗氧化酶和非酶體系的抗氧化能力的提升，顯著改善對(duì)D-半乳糖致衰小鼠氧化損傷作用[32]。赤松茸多糖還具有預(yù)防急性肝損傷小鼠肝臟和主要臟器的氧化損傷作用、增強(qiáng)小鼠免疫力、恢復(fù)運(yùn)動(dòng)疲勞等活性[17,33]。因此，赤松茸多糖具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。

綜上可知，博愛(ài)赤松茸多糖超聲最優(yōu)提取工藝條件為：超聲溫度62 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時(shí)間62 min，此條件下，多糖的平均得率為13.25%。且博愛(ài)赤松茸多糖提取物具有較強(qiáng)的清除ABTS+自由基能力、還原 Fe3+的能力和抑菌活性，但其抑菌作用具有選擇性。本研究也僅局限于確定了博愛(ài)赤松茸多糖超聲最優(yōu)提取工藝和初步評(píng)價(jià)了博愛(ài)赤松茸多糖的抑菌、抗氧化活性，但對(duì)博愛(ài)赤松茸中硒是否強(qiáng)化多糖的生物活性及是否以硒多糖形式存在尚未研究，這將是本研究室下一步重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。