乳酸菌發(fā)酵天麻口服液工藝優(yōu)化

陳來(lái)鳳，倪琳鈺，鄧成林，羅亞楠，李海燕，豐貴江，林秋葉

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

天麻（Gastrodia elata）是被子植物綱天麻屬蘭科草本植物干燥塊莖[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，其性辛、溫、無(wú)毒，富含天麻素、香莢蘭素、多糖、氨基酸及微量元素[2]。天麻也是云貴川高原特有的藥食同源中藥材，擁有悠久的應(yīng)用歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云天麻為上品，“久服益氣力，長(zhǎng)陰，肥健，輕身，增年”[3]；《藥性本草》言天麻能“治語(yǔ)多恍惚，善驚失志”[4]；《珍珠囊》記載天麻“治風(fēng)虛眩暈頭痛”，故名定風(fēng)草；清代名醫(yī)張志聰稱贊天麻“功同五芝，力倍五參，為仙家服食上品”。研究發(fā)現(xiàn)，天麻中主要含有酚類、苷類、有機(jī)酸、甾醇類和多糖類等化合物，主要活性化學(xué)成分為天麻素（對(duì)羥基苯甲醇1β-D 葡萄吡喃糖苷），也是含量最高的有效單體成分[2,5]?，F(xiàn)代藥理研究和臨床應(yīng)用表明，天麻具有提高免疫力、鎮(zhèn)靜止痛、提高耐缺氧力、改善記憶、降血壓、抗炎等多種藥理作用，對(duì)血管性神經(jīng)性頭痛[6]、腦震蕩后遺癥等有顯著療效[7]。天麻活性化合物天麻素具有多種生理功能，包括鎮(zhèn)靜催眠[8]、抗驚厥[9]、抗焦慮抑郁[10]、抗炎鎮(zhèn)痛[11]、抗氧化[12]、增強(qiáng)記憶和抗衰老[13]、抗病毒和抗腫瘤作用[14]，還具有保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)[15?16]等功效。

2018 年國(guó)家衛(wèi)健委批準(zhǔn)天麻作為食藥物質(zhì)試生產(chǎn)，其保健作用及特有的藥理特性成為食品領(lǐng)域藥食同源研究的熱點(diǎn)[17]。目前，有關(guān)天麻的研究主要集中在貯藏工藝研究[18]、化學(xué)成分分析[19]和藥理藥效探索[20]等基礎(chǔ)研究方面，新型天麻食品飲料研究鮮見報(bào)道。乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物生成乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，廣泛存在于人體內(nèi)，具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力等多種益生功能[21?22]。近年來(lái)研究表明，乳酸菌發(fā)酵劑可以改善藥食同源中藥材的口感，又能夠提升中藥材的生物學(xué)功效，正日益受到關(guān)注[23]。應(yīng)用乳酸菌發(fā)酵天麻，不僅保留天麻原有功能性成分和活性乳酸菌，發(fā)酵過程中還可能產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的功能性代謝產(chǎn)物，從而增加天麻的保健功能[24]。

植物乳植桿菌屬于同型乳酸菌，普遍存在于泡菜、醬油和發(fā)酵肉制品等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中[25]，植物乳植桿菌位于我國(guó)《可用于食品的菌種名單》[26]之列，可以作為安全菌株添加于食品中。本研究以天麻為研究對(duì)象，采用復(fù)合酶法處理天麻，利用課題組自主篩選、在天麻酶解液中生長(zhǎng)良好的植物乳植桿菌STDA6 作為發(fā)酵菌劑，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研發(fā)乳酸菌發(fā)酵天麻口服液。研究結(jié)果可為深入開發(fā)天麻及藥食同源藥材提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳植桿菌STDA6 來(lái)源于課題組自主分離，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.20878；天麻 購(gòu)買于云南省昆明市新螺螄灣國(guó)際商貿(mào)城中藥材市場(chǎng)；MRS 培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VRBA）廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨 北京蘭杰柯科技有限公司；牛肉膏 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂 廣州賽國(guó)生物科技有限公司；氯化鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硫酸錳 大連美侖生物技術(shù)有限公司；液體石蠟 成都市科隆化學(xué)品有限公司；丁二酸鈉 大連美侖生物技術(shù)有限公司；硼酸 西隴化工股份有限公司；苯酚 天津市化學(xué)試劑一廠；磷酸氫二鉀 廣東光華科技股份有限公司，均為分析純；α-淀粉酶（30000 U/g）、果膠酶（40000 U/g）、纖維素酶（100000 U/g）山東隆科特酶制劑有限公司；單寧酶（300 U/g）南寧龐博生物工程有限公司；碳酸氫鈉 南京甘汁園糖業(yè)有限公司；檸檬酸 濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；蔗糖 昆明多悅多工貿(mào)有限公司，均為食品級(jí)；試驗(yàn)用水為純化水。

BSA224S 精密分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；EPED-E2-20TH 超純水儀 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；DW-86L388J 醫(yī)用低溫保存箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；Vorte-5 渦旋混合器 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；UV-5100 紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Sorvall ST 16R 高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；LDZX-50L 立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，DHP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FE28 pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-6高精度數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液生產(chǎn)工藝流程 參考文獻(xiàn)[27]的方法，乳酸菌發(fā)酵天麻口服液生產(chǎn)工藝流程如圖1。

圖1 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Processing technology of fermented G.elata oral liquid with lactic acid bacteria

1.2.2 天麻發(fā)酵基液的制備

1.2.2.1 酶解單因素實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[27]的方法，以5.0 g 天麻粉為基準(zhǔn)，料液比1:8（g/mL）、單酶添加量0.3%、pH5.0、酶解溫度50 ℃和酶解時(shí)間180 min為基準(zhǔn)條件，以酶解率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化果膠酶、纖維素酶、單寧酶和ɑ-淀粉酶酶解工藝。

果膠酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)：分別考察料液比[1:7、1:8、1:9、1:10、1:11（g/mL）]、果膠酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）和酶解時(shí)間（90、120、150、180、210 min）對(duì)天麻酶解率的影響。

纖維素酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)：分別考察料液比[1:6、1:7、1:8、1:9、1:10（g/mL）]、纖維素酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）和酶解時(shí)間（90、120、150、180、210 min）對(duì)天麻酶解率的影響。

單寧酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)：分別考察料液比[1:7、1:8、1:9、1:10、1:11（g/mL）]、單寧酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、酶解溫度（50、55、60、65、70 ℃）和酶解時(shí)間（60、90、120、150、180 min）對(duì)天麻酶解率的影響。

ɑ-淀粉酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)：分別考察料液比[1:7、1:8、1:9、1:10、1:11（g/mL）]、ɑ-淀粉酶添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃）和酶解時(shí)間（90、120、150、180、210 min）對(duì)天麻酶解率的影響。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶酶解天麻最佳工藝條件 參考文獻(xiàn)[27?29]的方法，復(fù)合酶選用等比例混合酶（果膠酶:纖維素酶:單寧酶:α-淀粉酶=1:1:1:1）對(duì)天麻進(jìn)行酶解反應(yīng)，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)酶解率影響較大的4 個(gè)因素，采用 Design Expert軟件設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)方案，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化天麻酶解條件，酶解正交因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels design of orthogonal test

1.2.2.3 酶解率的確定 參照葉朋飛等[27]方法，稱取天麻粉樣品（5 g）進(jìn)行酶解，酶解液5000 r/min，離心10 min，沉淀80 ℃干燥3 h 后稱重（m2），根據(jù)如下公式計(jì)算酶解條件下酶解率：

式中：m1：天麻樣品質(zhì)量，g ；m2：殘?jiān)馁|(zhì)量，g ；9.67：未添加酶處理天麻的酶解率。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液的工藝優(yōu)化

1.2.3.1 植物乳植桿菌STDA6 發(fā)酵天麻口服液?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn) 確定天麻酶解條件后，以乳酸菌接種量1×105CFU/mL、蔗糖添加量8%、發(fā)酵溫度37 ℃和發(fā)酵時(shí)間16 h 為基準(zhǔn)條件，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察乳酸菌接種量（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107CFU/mL）、發(fā)酵溫度（33、35、37、39、41 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（8、12、16、20、24 h）和蔗糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）對(duì)發(fā)酵天麻口服液的影響。

1.2.3.2 植物乳植桿菌STDA6 發(fā)酵天麻口服液正交試驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和蔗糖添加量四因素，采用Design Expert 軟件設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)方案，進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵天麻的最優(yōu)條件，正交因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels design of orthogonal test

1.2.4 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 由10 名經(jīng)過培訓(xùn)的食品專業(yè)研究生組成感官評(píng)定小組，從顏色與外觀、香氣、滋味與口感及組織形態(tài)四個(gè)方面對(duì)乳酸菌發(fā)酵天麻口服液進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory scoring criteria for fermented G.elata oral liquid with lactic acid bacteria

1.2.5 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 pH 測(cè)定 應(yīng)用pH 計(jì)測(cè)定天麻口服液pH。

1.2.5.2 微生物指標(biāo)測(cè)定 按GB/T 31326-2014 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求檢測(cè)[30]；菌落總數(shù)參照GB 4789.2-2016 進(jìn)行測(cè)定[31]；大腸菌群參照GB 4789.3-2016 進(jìn)行測(cè)定[32]；霉菌和酵母菌參照GB 4789.15-2016 進(jìn)行測(cè)定[33]；金黃色葡萄球菌參照GB 4789.10-2016進(jìn)行測(cè)定[34]；沙門氏菌參照GB4789.4-2016 進(jìn)行測(cè)定[35]；乳酸菌總數(shù)參照GB 4789.35-2016 進(jìn)行測(cè)定[36]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，采用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與制圖，采用One-way ANOVA 進(jìn)行方差分析和Duncan 多重比較進(jìn)行各數(shù)據(jù)之間的顯著性分析。P<0.05 表示各組數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻酶解工藝的確定

2.1.1 天麻酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 果膠酶較佳酶解條件如圖2 所示：料液比（g:mL）1:10、加酶量0.2%、pH4.5、50 ℃酶解180 min。

圖2 果膠酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of single factor experiment on pectinase enzymatic hydrolysis of G.elata

纖維素酶較佳酶解條件如圖3 所示：料液比（g:mL）1:9、加酶量0.4%、pH5.0、50 ℃酶解180 min。

圖3 纖維素酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of single factor experiment on cellulase enzymatic hydrolysis of G.elata

單寧酶較佳酶解條件如圖4 所示：料液比（g:mL）1:8、加酶量0.3%、pH4.5、60 ℃酶解150 min。

圖4 單寧酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of single factor experiment on tannase enzymatic hydrolysis of G.elata

α-淀粉酶較佳酶解條件如圖5 所示：料液比（g:mL）1:10、加酶量0.5%、pH4.0、40 ℃酶解150 min。

圖5 α-淀粉酶酶解天麻單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of single factor experiment on α-amylase enzymatic hydrolysis of G.elata

由上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在天麻中分別加入果膠酶、纖維素酶、單寧酶和α-淀粉酶，隨著料液比、加酶量、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間增加，酶解率總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。隨著料液比的增加，酶解率先增后減，分析結(jié)果可能是溶劑體積小時(shí)，溶液濃度過大，流動(dòng)性差，酶與底物接觸不充分，致使酶解不完全；溶劑體積大時(shí)，溶液稀釋，底物濃度降低，影響了反應(yīng)的進(jìn)行[37]。隨著單酶量的增加，酶解效率提高，酶量繼續(xù)增加，酶過剩則會(huì)導(dǎo)致溶液體系黏度增加，進(jìn)而限制酶解效率[38]。隨著pH 升高，酶活性逐漸增強(qiáng)，酶解率提高，pH 繼續(xù)升高酶活性可能受到抑制，酶解率降低。隨著酶解溫度升高，酶活性逐漸增強(qiáng)，酶解率提高，溫度繼續(xù)升高，酶的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致酶活性下降，酶解率也隨之降低[39]。在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解率增加，酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，酶解率趨于穩(wěn)定，分析原因可能是酶解后期底物基本被酶解完全[40]。果膠酶、纖維素酶的較佳酶解時(shí)間為180 min，單寧酶和α-淀粉酶的較佳酶解時(shí)間為150 min，綜合考慮后選擇固定酶解時(shí)間為180 min。楊培青[41]藍(lán)莓果渣酵素制備工藝的研究也得出了相似的結(jié)果。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，果膠酶、纖維素酶、單寧酶和α-淀粉酶的較佳料液比分別是1:10、1:9、1:8 和1:10，較佳酶添加量是0.2%、0.4%、0.3%和0.5%，較佳pH 分別是4.5、5.0、4.5 和4.0，較佳溫度分別是50、50、60 和40 ℃。綜合考慮，選擇不同考察因素中相同的最優(yōu)條件作為正交試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即確定料液比1:9、1:10、1:11，復(fù)合酶添加量0.3%、0.4%、0.5%，pH4.0、4.5、5.0，酶解溫度40、50、60 ℃作為正交因素考察水平。

2.1.2 正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶酶解天麻最佳工藝條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定料液比（A）、復(fù)合酶添加量（B）、酶解pH（C）和酶解溫度（D）4 個(gè)因素，進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果（酶解率）Table 4 Results of orthogonal experiments (enzymolysis rate)

根據(jù)各因素顯著水平，結(jié)合R 值大小可以判斷影響天麻酶解率的主次因素關(guān)系為C>A>B>D，即酶解pH>料液比>復(fù)合酶添加量>酶解溫度。根據(jù)K 值，得出理論最佳酶解工藝組合為A3B1C1D2，即料液比1:11、復(fù)合酶添加量0.3%、pH4.0、酶解溫度50 ℃。在正交試驗(yàn)表中組合A3B2C1D2酶解率最高。將正交試驗(yàn)中由直觀分析所得的酶解工藝?yán)碚撟顑?yōu)和實(shí)際最優(yōu)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示A3B2C1D2（70.93）酶解率高于A3B1C1D2（70.53）。結(jié)果與別蒙等[42]和孟然等[43]研究一致，分析可能是因?yàn)橐蛩氐乃介g具有交互作用導(dǎo)致[44]。故選擇最佳酶解工藝為料液比1:11、復(fù)合酶添加量0.4%、pH4.0、酶解溫度50 ℃。由表5 中方差分析結(jié)果可知，料液比（A）和pH（C）對(duì)酶解率影響顯著，因素影響大小順序與表4 極差分析結(jié)果一致，表明正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

表5 正交試驗(yàn)方差分析（酶解率）Table 5 Anova of orthogonal experiments (enzymolysis rate)

2.2 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液工藝優(yōu)化

2.2.1 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn)結(jié)果 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了植物乳植桿菌STDA6 發(fā)酵天麻口服液的工藝條件，結(jié)果如圖6 所示。隨著乳酸菌接種量的增加，天麻口服液的感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分析原因是在一定濃度范圍內(nèi)，增加乳酸菌接種量，對(duì)天麻口服液的口感香味方面產(chǎn)生了積極的影響，導(dǎo)致感官評(píng)分上升，當(dāng)接種量達(dá)到1×106CFU/mL 時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值。隨著接種量繼續(xù)增加，感官評(píng)分降低，分析原因可能是接種量過多導(dǎo)致天麻口服液口感偏酸、接受度低[45]，這與鄭聰?shù)萚46]研究余甘子圣女果復(fù)合飲料發(fā)酵工藝的乳酸菌添加量結(jié)果相似，因此確定接種量1×105、1×106、1×107CFU/mL 作為正交因素考察水平。發(fā)酵溫度對(duì)天麻口服液感官評(píng)分影響結(jié)果顯示，隨發(fā)酵溫度升高，感官評(píng)分先升高后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高，分析原因可能是溫度會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng)的速率和產(chǎn)物形成，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，乳酸菌活性最高，發(fā)酵效果最好，天麻口服液口感和滋味最好；溫度高于35 ℃時(shí)，乳酸菌活性也會(huì)隨溫度升高而下降，發(fā)酵效果也隨之降低[47]。郗恩光[48]對(duì)香蕉金針菇發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化研究也得出了相似的結(jié)果，因此確定發(fā)酵溫度33、35、37 ℃作為正交因素考察水平。發(fā)酵時(shí)間對(duì)天麻口服液感官評(píng)分影響結(jié)果顯示，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，感官評(píng)分先升高后降低，分析原因可能是發(fā)酵時(shí)間太短，發(fā)酵風(fēng)味不明顯，發(fā)酵時(shí)間太長(zhǎng)時(shí)，乳酸菌增長(zhǎng)迅速，使飲料酸澀，口感較差[49]，與汪云陽(yáng)等[50]研究一致。因此確定發(fā)酵時(shí)間12、16、20 h 作為正交因素考察水平。蔗糖添加量對(duì)天麻口服液感官評(píng)分影響結(jié)果顯示，隨蔗糖添加量增加，感官評(píng)分先升高后降低，蔗糖添加量過少或過多時(shí)，口感偏酸或偏甜；當(dāng)蔗糖添加量為9%時(shí)，天麻口服液口感適中，感官評(píng)分達(dá)到最高，因此確定蔗糖添加量8%、9%、10%作為正交因素考察水平。

圖6 植物乳植桿菌發(fā)酵天麻口服液工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Single factor experiment results of processing of G.elata oral liquid fermented with L.plantarum

2.2.2 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定植物乳植桿菌接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）和蔗糖添加量（D）4 個(gè)因素，進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。根據(jù)各因素顯著水平，結(jié)合R 值大小可以判斷影響乳酸菌發(fā)酵天麻口服液感官評(píng)價(jià)的主次因素關(guān)系為A>B>D>C，即接種量>發(fā)酵時(shí)間>蔗糖添加量>發(fā)酵溫度。根據(jù)K 值，得出最佳工藝組合為A1B1C3D3，即接種量1×105CFU/mL，發(fā)酵時(shí)間12 h，發(fā)酵溫度37 ℃，蔗糖添加量10%。在正交試驗(yàn)表中感官評(píng)價(jià)得分最高的組合為A3B1C2D3，即接種量為1×107CFU/mL，發(fā)酵時(shí)間12 h，發(fā)酵溫度為35 ℃，蔗糖添加量為10%。將正交試驗(yàn)中由直觀分析所得的發(fā)酵工藝?yán)碚撟顑?yōu)和實(shí)際最優(yōu)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示理論最優(yōu)A1B1C3D3感官評(píng)分88.33，高于實(shí)際最優(yōu)A3B1C2D3感官評(píng)分85.60。故確定最佳發(fā)酵工藝為接種量1×105CFU/mL，發(fā)酵時(shí)間12 h，發(fā)酵溫度37 ℃，蔗糖添加量10%。由表7 中方差分析可知，接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和蔗糖添加量（D）3 個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分影響顯著，因素影響大小順序與表6極差分析結(jié)果一致，表明正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果（感官評(píng)分）Table 6 Results of orthogonal experiments (sensory score)

表7 正交試驗(yàn)方差分析（感官評(píng)分）Table 7 Anova of orthogonal experiments (sensory score)

2.3 乳酸菌發(fā)酵天麻口服液質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)測(cè)得乳酸菌發(fā)酵天麻口服液pH 為3.5，乳酸菌活菌數(shù)2×108CFU/mL，微生物指標(biāo)：菌落總數(shù)<10 CFU/mL，大腸菌群、霉菌和酵母菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均未檢出，符合GB/T 31326-2014《植物飲料》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

纖維素和果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分，前人研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶和果膠酶能夠破壞植物細(xì)胞壁的完整性[51]。另有研究表明天麻中含有大量酚類物質(zhì)[2]，食用時(shí)會(huì)有苦澀味。單寧酶在清除植物果實(shí)和皮衣中的苦澀味和改善食品原料的適口性方面具有良好的效果，同時(shí)可以提高游離氨基酸的得率[52]。天麻中支鏈淀粉的含量高達(dá)90%[53]，α-淀粉酶對(duì)支鏈淀粉的酶解速率高于直鏈淀粉，支鏈淀粉平均鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的淀粉結(jié)構(gòu)更利于經(jīng)α-淀粉酶酶解[54]。因此，應(yīng)用α-淀粉酶可以將天麻中的支鏈淀粉降解為麥芽糖和少量葡萄糖，水溶性增強(qiáng)[55]。目前酶解技術(shù)主要應(yīng)用于提取天麻多糖，而在乳酸菌發(fā)酵前酶解天麻的研究鮮見報(bào)道。因此，基于多種酶復(fù)合使用可有效提升原料利用效率、利于發(fā)酵性物質(zhì)溶出和改善風(fēng)味的優(yōu)勢(shì)。趙敏等[56]制備天麻酵素研究中，采用熱水?dāng)嚢韬图永w維素酶的方法處理天麻原料。朱苗等[57]和李剛鳳等[58]制備天麻復(fù)合植物飲料中，均采用85 ℃浸提20 min 制備天麻浸提液。與上述文獻(xiàn)相比，本文采用酶法一步處理，具有工藝簡(jiǎn)單和節(jié)省能源的優(yōu)勢(shì)。以天麻單獨(dú)為基質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)品主要集中在多菌種復(fù)配酵素中，乳酸菌發(fā)酵天麻產(chǎn)品鮮見報(bào)道。已有研究證實(shí)植物乳植桿菌在石斛[59]、薏苡仁[60]、葛根[61]等藥食同源藥材中繁殖性能良好，可能是因?yàn)橹参锶橹矖U菌能夠耐受和代謝多酚類物質(zhì)，有學(xué)者提出植物乳植桿菌通過對(duì)酚類物質(zhì)的代謝也可能具有維護(hù)細(xì)胞能量平衡的作用[62]。此外，在纖維素酶和淀粉酶的作用下，天麻中的纖維素和淀粉分解產(chǎn)生的可發(fā)酵性糖可被植物乳植桿菌利用進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖[63]，進(jìn)一步提高了植物乳植桿菌的發(fā)酵性能。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間是影響乳酸菌發(fā)酵天麻感官品質(zhì)的主要因素，與范俊華等[64]結(jié)果一致。推測(cè)隨著發(fā)酵時(shí)間的變化產(chǎn)生的酯類和醛類物質(zhì)可能對(duì)乳酸菌發(fā)酵天麻口服液的風(fēng)味品質(zhì)形成發(fā)揮了重要作用[65]，酶解與乳酸菌協(xié)同發(fā)酵可能有助于酯類等香氣物質(zhì)的產(chǎn)生而促進(jìn)不良風(fēng)味物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[66]。在未來(lái)研究中，將對(duì)乳酸菌發(fā)酵天麻口服液的風(fēng)味物質(zhì)及功能性進(jìn)行深入研究，為其產(chǎn)品應(yīng)用提供理論支持。

4 結(jié)論

本文采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了復(fù)合酶果膠酶、纖維素酶、單寧酶和ɑ-淀粉酶酶解天麻最佳工藝條件。本研究以自主分離的植物乳植桿菌STDA6 為接種菌劑，乳酸菌發(fā)酵天麻口服液的最佳工藝條件為：接種量1×105CFU/mL，發(fā)酵時(shí)間12 h，發(fā)酵溫度37 ℃，蔗糖添加量10%，口感具有天麻的特征風(fēng)味，酸甜比例適中，發(fā)酵酸味濃厚且柔和，細(xì)膩滑爽，植物乳植桿菌STDA6 活菌數(shù)平均值為2×108CFU/mL，pH3.5。與發(fā)酵0 h 的活菌數(shù)相比，植物乳植桿菌的數(shù)量增加了3.3 log CFU/mL，表明其在天麻酶解液中具有優(yōu)良的增殖活性。