速溶蘆筍粉的酶解工藝優(yōu)化及其改善小鼠睡眠功能

楊曉春，黎重陽，張玲玲，王榮春，張英春, ，盧衛(wèi)紅,

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150001；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)重慶研究院，特色藥食資源開發(fā)智能化裝備研究中心，重慶 401135；3.四川工大西南食品研究有限責(zé)任公司，四川巴中 636063）

睡眠是一種較為復(fù)雜的生理過程。睡眠功能障礙已成為當(dāng)前常見疾病，該疾病的發(fā)生與精神、生理疾病等密切相關(guān)，嚴(yán)重?fù)p害人們的健康，并影響正常的工作和生活[1]。根據(jù)2020 年中國睡眠研究會公布的調(diào)查結(jié)果顯示，我國約有38.2%的人口存在失眠障礙問題，人均每日睡眠時(shí)間不足7 h。近年來，中國人整體入睡時(shí)間延遲了2～3 h，且失眠逐漸呈年輕化趨勢。目前，睡眠功能障礙主要依賴于鎮(zhèn)靜催眠類藥物進(jìn)行治療，但存在一定的成癮性和毒副作用，長時(shí)間服用容易使人產(chǎn)生胃腸道不適、乏力以及記憶力減退等癥狀。近年來，消費(fèi)者開始逐漸意識到植物藥和植物提取物對健康的益處，對保健品的接受度也越來越高。因此，天然植物成分在睡眠健康中的應(yīng)用需求顯著增加。

蘆筍（Asparagus officinalisL.）又名石刁柏，為天門冬科天門冬屬多年生草本植物[2?3]。蘆筍是一種營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值較高的名貴蔬菜，被列為“世界十大蔬菜之首”，國際上素有“蔬菜之王”的美稱[4?6]。蘆筍營養(yǎng)價(jià)值很高[7]，除富含多種維生素和微量元素等成分外[8]，同時(shí)含有蘆筍皂苷[9?10]、黃酮[11?12]、多糖[13?14]等多種具有藥用價(jià)值的活性成分。其中，蘆筍皂苷因具有較好的調(diào)節(jié)免疫[15?16]、抗腫瘤[17?18]、降血糖[19]等功效，逐漸受到國內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注。近年來，皂苷類成分，如酸棗仁皂苷，因在治療神經(jīng)衰弱、改善睡眠等癥方面具有良好的調(diào)節(jié)作用，逐漸成為治療失眠方面的研究熱點(diǎn)[20?22]。目前，對于蘆筍皂苷在改善睡眠功能方面的研究還鮮有報(bào)道。四川省巴中市恩陽區(qū)種植綠蘆筍的歷史悠久，恩陽蘆筍已榮獲國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志認(rèn)證，恩陽區(qū)也被授予“中國蘆筍之鄉(xiāng)”的稱號。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，恩陽蘆筍中蘆筍皂苷含量較為豐富，精深加工潛力較大。本實(shí)驗(yàn)以恩陽綠蘆筍為主要原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化速溶粉的酶解工藝條件，同時(shí)利用動物實(shí)驗(yàn)考察其改善睡眠功能的效果，旨在為新型蘆筍助睡眠類保健食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

恩陽綠蘆筍 巴中市惠豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；果膠酶（10 萬U/g）、纖維素（10 萬U/g）夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；健康昆明種小鼠 體重20±2 g，單一雄性，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號：SCXK（黑）2019-001）；菝葜皂苷元 ≥98%純度，上海倍卓生物科技有限公司；冰醋酸 ≥99%純度，北京市通廣精細(xì)化工公司；酸棗仁皂苷 ≥98%純度，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；巴比妥鈉（≥95%純度）、戊巴比妥鈉（≥99%純度）Sigma-Aldrich 公司。

YB5001B 電子太平 上海衡際科學(xué)儀器有限公司；ES220 精密天子天平 天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州鴻澤實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；RE-520 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；D-3L 納米高壓均質(zhì)機(jī) 美國phD 科技（國際）有限公司；ADL311-A 臺式噴霧干燥機(jī) 日本Yamato 大和科學(xué)株式會社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 速溶蘆筍粉的加工工藝 速溶蘆筍粉的加工工藝流程如下：

1.2.1.1 操作要點(diǎn) a.前處理：準(zhǔn)備好新鮮綠蘆筍，流動水清洗去除表面泥沙，再去除蘆筍根部一端的老皮，控干水分備用；b.燙漂：燙漂水預(yù)先加熱至85～90 ℃左右，添加0.03%～0.05%的檸檬酸進(jìn)行護(hù)色。燙漂時(shí)筍尖向上，基部先燙漂2～3 min，然后整條再燙漂1～2 min，迅速撈出后冷卻至36 ℃以下，控干水分備用[23?24]；c.酶解：添加一定量纖維素酶和果膠酶（質(zhì)量比為1:1），在適宜的溫度和pH 下對打漿后的蘆筍漿進(jìn)行一定時(shí)間的酶解處理[25?26]；d.離心：酶解液經(jīng)過濾后在4000 r/min 下離心10 min 處理[27]；e.均質(zhì)：均質(zhì)溫度控制在50～60 ℃，均質(zhì)壓力控制在25～30 MPa；f.濃縮：將蘆筍漿旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至固形物含量20%以上；g.噴霧干燥：加入麥芽糊精，將蘆筍濃縮液預(yù)熱至55 ℃以上后再進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)料流量900 mL/h，進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，出風(fēng)溫度100 ℃；h.冷卻、包裝和檢測：待產(chǎn)品冷卻后，在無菌條件下裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的包裝袋內(nèi)，密封后進(jìn)行檢測。

1.2.1.2 酶解工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn) a.復(fù)合酶添加量對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響：在酶解溫度65 ℃，酶解時(shí)間2.0 h，pH4.8 的條件下，探究復(fù)合酶添加量（果膠酶和纖維素酶按質(zhì)量比1:1 復(fù)配）分別為0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%和0.14%時(shí)，對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響；b.酶解溫度對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響：在復(fù)合酶添加量選擇a 得出的最優(yōu)結(jié)果，酶解時(shí)間2.0 h，pH4.8 的條件下，探究酶解溫度分別為55、60、65、70、75 和80 ℃時(shí)，對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響；c.酶解時(shí)間對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響：在復(fù)合酶添加量、酶解溫度分別選擇a、b 得出的最優(yōu)結(jié)果，pH4.8 的條件下，探究酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 h 時(shí)，對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響；d.pH 對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響：在復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間分別選擇a、b、c 得出的最優(yōu)結(jié)果的條件下，探究pH 分別為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2 和5.6 時(shí)，對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響。

1.2.1.3 酶解工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)1.2.1.2的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取復(fù)合酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH 作為Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素，速溶蘆筍粉出粉率和蘆筍皂苷含量為響應(yīng)值，采用Design Exper.V 8.0.6.1 軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Experimental design of RSM

1.2.2 指標(biāo)檢測

1.2.2.1 速溶蘆筍粉的出粉率測定 在噴霧干燥、冷卻至常溫后，取樣測定速溶蘆筍粉的出粉率。速溶蘆筍粉的出粉率用以下公式計(jì)算：

式中：A 為噴霧干燥后最終獲得的速溶蘆筍粉總質(zhì)量，g；B 為蘆筍原料質(zhì)量，g。

1.2.2.2 速溶蘆筍粉中總皂苷的測定方法 參照葛思琪等、才衛(wèi)川等[28?29]的實(shí)驗(yàn)方法，并加以改進(jìn)。精密稱取20.0 mg 菝葜皂苷元，加甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，得2 mg/mL 溶液。再分別稀釋成梯度為0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL 的菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別移取上述不同濃度的菝葜皂苷元標(biāo)溶液100 μL，置于20 mL 的具塞量筒中，于70 ℃水浴將溶劑揮發(fā)至干。依次加入0.2 mL 5%香草醛乙酸溶液，0.8 mL 高氯酸溶液（70%），振動混勻，加塞于70 ℃水浴中靜置15 min，取出后再冰浴5 min，冷卻至室溫。最后加入冰醋酸（≥99%）5 mL，振蕩混勻即可。以甲醇為空白，按照上述操作方法制備參比溶液，于535 nm 波長下測定吸光度值，最終以吸光度為縱坐標(biāo)，不同濃度（mg/mL）的菝葜皂苷元為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸分析，得回歸方程為y=1.1928x?0.0135，R2=0.9987。表明菝葜皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.2～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可作為蘆筍總皂苷含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取實(shí)驗(yàn)制備的速溶蘆筍粉樣品10.0 g，用25 mL 蒸餾水溶解于500 mL 三角瓶中。按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定速溶蘆筍粉的吸光值，以不加速溶蘆筍粉為空白對照，計(jì)算速溶蘆筍粉中的蘆筍總皂苷含量。蘆筍皂苷含量用以下公式計(jì)算：

式中：X 為蘆筍總皂苷含量，%；A 為樣品顯色后吸光值；a 為回歸直線斜率；b 為回歸直線截距；m 為樣品質(zhì)量，g；V1為樣品溶解定容體積，mL；V2為樣品加樣體積，mL。

1.2.3 速溶蘆筍粉干預(yù)小鼠睡眠功能實(shí)驗(yàn) 參照馬淑鳳等、黃云祥等[30?31]實(shí)驗(yàn)方法，并加以改進(jìn)。飼養(yǎng)環(huán)境，23±2 ℃，濕度55%±10%，12 h 光照，12 h 黑暗，自由供給食物和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，即空白對照組（NC）、陽性對照組（酸棗仁皂苷360 mg·kg?1，以粗品的濃度計(jì)）、速溶蘆筍粉低、中、高劑量組分別設(shè)置為50、100 和200 mg·kg?1（速溶蘆筍粉推薦劑量為成人（按60 kg 體質(zhì)量計(jì)）每日人 300 mg，相當(dāng)于 5 mg 每日kg 體質(zhì)量。速溶蘆筍粉低、中、高劑量組分別設(shè)人體推薦量的10、20、40 倍，以粗品的濃度計(jì)）。每天灌胃1 次，空白對照組給予生理鹽水，連續(xù)30 d。在末次灌胃15 min 后，分別進(jìn)行戊巴比妥鈉閥下劑量催眠實(shí)驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)。本研究的動物實(shí)驗(yàn)方案獲得哈爾濱工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：（IACUC-2021075），并且嚴(yán)格按照哈爾濱工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會的管理要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3.1 戊巴比妥鈉閥下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 給各實(shí)驗(yàn)組按32 mg/kg 體質(zhì)量的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量為0.1 mL/10 g 體質(zhì)量，以小鼠翻正反射消失達(dá)1 min 以上為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄各組入睡動物數(shù)和睡眠發(fā)生率。

1.2.3.2 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) 給各實(shí)驗(yàn)組按290 mg/kg 體質(zhì)量的劑量腹腔注射巴比妥鈉，注射量為0.1 mL/10 g 體質(zhì)量，以小鼠翻正反射消失為指標(biāo)，觀察受試物能否縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期。

1.2.3.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 給各實(shí)驗(yàn)組按41 mg/kg 體質(zhì)量的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量為0.1 mL/10 g 體質(zhì)量，以小鼠翻正反射消失為指標(biāo)，觀察受試物能否延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)測定三次，繪圖采用GraphPad Prism 7 軟件，響應(yīng)面分析軟件為 Design Exper.V 8.0.6.1，采用IBM SPSS Statistics 26 進(jìn)行顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶添加量的影響 復(fù)合酶添加量對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響結(jié)果如圖1 所示。隨著復(fù)合酶添加量的增多，出粉率和皂苷含量均呈現(xiàn)明顯增加趨勢，特別是0.04%至0.10%區(qū)間，二者增加趨勢明顯。當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到0.12%時(shí)，出粉率和皂苷含量分別為39.3%和17.9%。而當(dāng)復(fù)合酶添加量繼續(xù)增加后，二者增加趨勢均十分緩慢并趨于平緩。這可能是因?yàn)槊傅臐舛仁艿教砑恿康挠绊?，隨著酶濃度的增加，復(fù)合酶酶解速率增加，導(dǎo)致出粉率和皂苷含量增加，但當(dāng)添加量過多時(shí)，酶的濃度達(dá)到飽和狀態(tài)，從而抑制了酶解作用。故在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)復(fù)合酶的最佳添加量為0.12%。

圖1 復(fù)合酶添加量對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響Fig.1 Effect of compound enzyme addition amount on the powder yield and total saponins from asparagus

2.1.2 酶解溫度的影響 酶解溫度對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響結(jié)果如圖2 所示。自55 ℃開始，隨著酶解溫度的增加，出粉率和皂苷含量都是先明顯增加，70 ℃以后則均開始快速減少，此時(shí)出粉率和皂苷含量分別為39.5%和19.5%。這一現(xiàn)象可能是因?yàn)樵诔跏茧A段，隨著溫度升高后會增加酶的活性，從而加速酶解效率。但超過一定的溫度后，酶蛋白分子就會發(fā)生失活變性，從而失去酶解作用?？梢姕囟冗^低或過高均不利于酶解反應(yīng)的發(fā)生。故在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)最佳酶解溫度為70 ℃。

圖2 酶解溫度對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temparature on the powder yield and total saponins from asparagus

2.1.3 酶解時(shí)間的影響 酶解時(shí)間對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響結(jié)果如圖3 所示。隨著酶解時(shí)間的延長，出粉率和皂苷含量均逐漸升高。當(dāng)酶解達(dá)到2.0 h 后，出粉率和皂苷含量分別達(dá)到40.1%和21.7%。隨著酶解時(shí)間延長，二者增加趨勢均十分緩慢并趨于平緩。酶解3.0 h 后，出粉率和蘆筍皂苷含量與2.0 h的值變化不明顯。這可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，復(fù)合酶對植物細(xì)胞壁的作用不斷加大，使其充分發(fā)揮酶解作用。但是當(dāng)?shù)孜锿耆缓谋M后，即使繼續(xù)增加酶解時(shí)間，出粉率和蘆筍皂苷含量也會不再增加。故在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)最佳酶解時(shí)間為2.0 h。

圖3 酶解時(shí)間對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the powder yield and total saponins from asparagus

2.1.4 pH 的影響 pH 對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響結(jié)果如圖4 所示。當(dāng)pH 達(dá)到4.4 時(shí)，出粉率和蘆筍皂苷含量開始明顯增加，在pH5.2 時(shí)達(dá)到最大值，出粉率和皂苷含量分別達(dá)到41.2%和21.5%。而后又開始呈現(xiàn)明顯下降趨勢?？梢娒附膺^程中的pH 對最終的出粉率和蘆筍皂苷含量均有明顯影響，這是因?yàn)閜H 影響著酶的活性，適宜的pH 有利于酶和底物結(jié)合，pH 過低或過高均不利于酶解反應(yīng)的發(fā)生，甚至有一定的抑制作用。故在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)最佳pH 為5.2。

圖4 pH 對出粉率和蘆筍皂苷含量的影響Fig.4 Effect of pH on the powder yield and total saponins from asparagus

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間和pH 作為因素，以出粉率和蘆筍皂苷含量為響應(yīng)值，用Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM

2.2.1 酶解工藝條件對出粉率的影響 以出粉率為響應(yīng)值，建立酶解工藝參數(shù)回歸模型?；貧w方程為：

Y1=43.20+0.24A?0.68B+0.97C+0.47D?0.25AB?0.30AC?0.28AD?1.47BC?0.83BD?0.85CD?1.92 A2?1.61B2?1.85C2?2.19D2

該方程的決定系數(shù)R2=0.9804，變異系數(shù)（C.V.）為0.93，在可接受范圍內(nèi)。方差分析結(jié)果詳見表3。

表3 出粉率的回歸方程方差分析Table 3 Regression equation variance analysis of powder yield

由表3 分析結(jié)果可知，F(xiàn)模型=49.94，整體模型極為顯著（P<0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1015>0.05），說明方程和試驗(yàn)擬合較好。該模型的調(diào)整相關(guān)系數(shù)（R2Adj=0.9607）接近1，說明變量間的線性相關(guān)程度密切。本試驗(yàn)的噪音信號比（Adeq Precision=23.717）大于4，說明模型的信號適中，可對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。綜上所述，該試驗(yàn)結(jié)果可靠，本試驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，該模型的一次項(xiàng)B、C、D 和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對出粉率的影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)A 影響顯著（P<0.05）。交互項(xiàng)BC、BD 和CD 影響極顯著（P<0.01）。對一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小進(jìn)行比較可知，對出粉率影響作用的大小順序?yàn)椋篊>B>D>A，即酶解時(shí)間>酶解溫度>pH>復(fù)合酶添加量。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗(yàn)因子A、B、C、D 構(gòu)成的三維空間的曲面圖。通過模型方程所得的具有極顯著影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖如圖5 所示。3 個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲線，說明響應(yīng)值存在極大值。此外，酶解溫度和酶解時(shí)間（BC）、酶解溫度和pH（BD）、酶解時(shí)間和pH（CD）的響應(yīng)面圖的坡度均趨勢陡峭，且等高線較密集，表明3 因素之間的交互作用對出粉率的影響較大，交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 酶解溫度、酶解時(shí)間和pH 對出粉率影響的響應(yīng)圖和等高線圖Fig.5 Response surface and counter showing the interactive effects of enzymolysis temperature,time and pH on the powder yield

2.2.2 酶解工藝條件對皂苷含量的影響 以皂苷含量為響應(yīng)值，建立酶解工藝參數(shù)回歸模型。回歸方程為：

Y2=21.82+0.19A?0.28B+0.48C+0.27D?0.28AB?0.15AC+0.000AD?0.82BC?0.45BD?0.55CD?0.81A2?0.90B2?0.74C2?1.15D2

該方程的決定系數(shù)R2=0.9445，變異系數(shù)（C.V.）為1.57，在可接受范圍內(nèi)。方差分析結(jié)果詳見表4。

表4 皂苷含量的回歸方程方差分析Table 4 Regression equation variance analysis of saponin content

由表4 分析結(jié)果可知，F(xiàn)模型=17.03，整體模型極為顯著（P<0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.9624>0.05），說明方程和試驗(yàn)擬合較好。該模型的調(diào)整相關(guān)系數(shù)（R2Adj=0.8891）接近1，說明變量間的線性相關(guān)程度密切。本試驗(yàn)的噪音信號比（Adeq Precision=13.851）大于4，說明模型的信號適中，可對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。綜上所述，該試驗(yàn)結(jié)果可靠，本試驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，該模型的一次項(xiàng)B、C，交互項(xiàng)BC、CD 以及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對皂苷含量的影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)D 和交互項(xiàng)BD 影響顯著（P<0.05）。對一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小進(jìn)行比較可知，對皂苷含量影響作用的大小順序?yàn)椋篊>B>D>A，即酶解時(shí)間>酶解溫度>pH>復(fù)合酶添加量。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗(yàn)因子A、B、C、D構(gòu)成的三維空間的曲面圖。通過模型方程所得的具有顯著性和極顯著性影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖如圖6 所示。3 個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲線，說明響應(yīng)值存在極大值。此外，酶解溫度和酶解時(shí)間（BC）、酶解溫度和pH（BD）、酶解時(shí)間和pH（CD）的響應(yīng)面圖的坡度均趨勢陡峭，且等高線較密集，表明3 因素之間的交互作用對皂苷含量的影響較大，交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖6 酶解溫度、酶解時(shí)間和pH 對皂苷含量影響的響應(yīng)圖和等高線圖Fig.6 Response surface and counter showing the interactive effects of enzymolysis temperature,time and pH on the saponin content

2.2.3 酶解工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在選取的各因素范圍內(nèi)，由Design Exper.V 8.0.6.1 軟件處理后，經(jīng)對兩個(gè)響應(yīng)值的結(jié)果進(jìn)行擬合，分析得到的酶解最佳工藝條件為：復(fù)合酶添加量0.12%，酶解溫度67.88 ℃，酶解時(shí)間2.23 h，pH5.24，模型預(yù)測的出粉率為43.60%，皂苷含量為22.0%。考慮實(shí)際操作的可信性，選取條件為：復(fù)合酶添加量為0.12%，酶解溫度為68 ℃，酶解時(shí)間為2.2 h，pH 為5.2。為驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的可行度，在該最佳條件下做3 次平行實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)際值為：速溶蘆筍粉出粉率42.7%，皂苷含量21.4%，與理論預(yù)測值基本一致（誤差在3%以內(nèi)）。因此，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化所得的酶解工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

2.3 速溶蘆筍粉干預(yù)小鼠睡眠功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 速溶蘆筍粉對小鼠體重的影響 如圖7 所示，與空白組和陽性對照組相比，各劑量組小鼠的初始體重和終止體重均無顯著差異（P>0.05）。此外，在給予受試物1.0 h 內(nèi)各組均未出現(xiàn)直接睡眠情況，符合《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊》中相關(guān)規(guī)定。

圖7 受試物對小鼠體重的影響Fig.7 The effect of test drug on body weight of mice

2.3.2 速溶蘆筍粉對小鼠睡眠發(fā)生率的影響 如圖8所示，空白組小鼠無一入睡，睡眠發(fā)生率為0%。與空白組相比，當(dāng)速溶蘆筍粉作用濃度在50～200 mg/kg·bw范圍內(nèi)時(shí)，低、中、高劑量組對小鼠的睡眠發(fā)生率分別為26.7%、36.7%和43.3%，各劑量組均能極顯著增加小鼠睡眠發(fā)生率（P<0.001），且速溶蘆筍粉的刺激作用呈濃度依賴性。另外，中劑量組（100 mg/kg·bw）小鼠的睡眠發(fā)生率與陽性對照組基本一致。以上結(jié)果表明速溶蘆筍粉具備良好的催眠效果。

圖8 受試物對小鼠睡眠發(fā)生率的影響Fig.8 The effect of test drug on sleeping rate of mice

2.3.3 速溶蘆筍粉對小鼠睡眠潛伏期的影響 如圖9所示，空白組小鼠的自然睡眠潛伏期為35.73 min。與空白組相比，當(dāng)速溶蘆筍粉作用濃度在50～200 mg/kg·bw 范圍內(nèi)時(shí)，小鼠睡眠潛伏期分別減少了6.76 min（P<0.05）、9.43 min（P<0.001）和10.6 min（P<0.001），速溶蘆筍粉的刺激作用呈濃度依賴性。另外，中、高劑量組小鼠的睡眠潛伏期與陽性對照組基本一致。以上結(jié)果表明，速溶蘆筍粉具備良好的降低睡眠潛伏期的效果。

圖9 受試物對小鼠睡眠潛伏期的影響Fig.9 The effect of test drug on sleeping delitescence of mice

2.3.4 速溶蘆筍粉對延長小鼠睡眠時(shí)間的影響 如圖10 所示，空白組小鼠的睡眠時(shí)間一般為29.47 min。與空白組相比，當(dāng)速溶蘆筍粉作用濃度在50～200 mg/kg·bw 范圍內(nèi)時(shí)，小鼠睡眠時(shí)間分別增加了6.93 min（P<0.01）、10.06 min（P<0.001）和17.16 min（P<0.001），速溶蘆筍粉的刺激作用呈濃度依賴性。另外，中、高劑量組小鼠的睡眠潛伏期與陽性對照組基本一致。以上結(jié)果表明，速溶蘆筍粉具備良好的延長小鼠睡眠時(shí)間的效果。

圖10 受試物對延長小鼠睡眠時(shí)間的影響Fig.10 The effect of test drug on prolonged sleep time of mice

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 試驗(yàn)，得出速溶蘆筍粉最佳酶解工藝條件為：復(fù)合酶添加量0.12%、酶解溫度68 ℃、酶解時(shí)間2.2 h、酶解pH5.2，在此條件下速溶蘆筍粉出粉率為42.7%，皂苷含量為21.4%。在本實(shí)驗(yàn)條件下建立的二次回歸模型準(zhǔn)確，擬合性較好。此外，利用該最佳工藝條件制備的速溶蘆筍粉，研究其改善小鼠睡眠的功能。結(jié)果表明，該速溶蘆筍粉的低、中、高劑量組對小鼠的睡眠發(fā)生率、睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間均顯著優(yōu)于空白對照組（P<0.05），助睡眠作用效果呈劑量依賴性增強(qiáng)。本研究的開展可為蘆筍速溶粉的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)，也為蘆筍皂苷的助睡眠機(jī)理研究奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)對于蘆筍系列產(chǎn)品的精深開發(fā)起到了較好的推動作用，具有較高的科研價(jià)值和社會經(jīng)濟(jì)效益。