白術內(nèi)酯Ⅱ抗血小板作用及對血小板中蛋白激酶B磷酸化水平的影響

陳一竹　楊文龍　郭玲玉　張明亮　劉俊嶺　張俊峰.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院心內(nèi)科，上?！?900；.上海交通大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，上?！?005

白術內(nèi)酯Ⅱ抗血小板作用及對血小板中蛋白激酶B磷酸化水平的影響

陳一竹1楊文龍1郭玲玉1張明亮1劉俊嶺2張俊峰1
1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海201900；2.上海交通大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，上海200025

目的 觀察白術內(nèi)酯Ⅱ在體外對小鼠和人血小板活化的影響，并探討其可能的分子機制。方法 通過體外血小板聚集實驗，采用比濁法測定不同濃度白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)δz原誘發(fā)的小鼠及人血小板聚集的影響；通過血小板的鋪展實驗，檢測白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)θ搜“邃佌沟淖饔茫贿\用Western blot檢測人血小板中蛋白激酶B（Akt473）的磷酸化水平。結(jié)果 白術內(nèi)酯Ⅱ可抑制膠原刺激下小鼠和人血小板的體外聚集（P<0.01）；經(jīng)白術內(nèi)酯Ⅱ處理后的人血小板鋪展面積縮?。≒<0.01）；人血小板中Akt473分子的磷酸化水平降低（P<0.01）。結(jié)論 白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)δz原誘導的小鼠和人血小板聚集能產(chǎn)生顯著抑制作用，對人血小板的鋪展也有抑制作用，其作用機制可能與血小板活化過程中的PI3K-Akt信號通路有關，提示白術內(nèi)酯Ⅱ是一種有效的抗血小板化合物。

白術內(nèi)酯Ⅱ；血小板；血栓；蛋白激酶B

動脈血栓形成是缺血性心、腦血管疾病和其他血栓栓塞性疾病發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，血小板聚集是動脈血栓形成的重要誘因。能否有效控制病理狀態(tài)下血小板的活化、聚集是防治血栓性疾病的關鍵，臨床上抗血小板藥物的使用目前是心腦血管疾病防治的重要手段，在心腦血管疾病的一級及二級預防中廣泛應用。因此，對抗血小板治療藥物的探索一直是預防血栓及心血管疾病基礎與臨床研究的熱點。對我國中醫(yī)藥的研究中發(fā)現(xiàn),許多具有活血化瘀作用的中藥都含有抑制血小板聚集的有效組分。天然中草藥與目前已上市的西藥和生物技術產(chǎn)品相比，具有安全性好，口服有效且來源廣泛等優(yōu)點[1-3]。因此，發(fā)展純天然的抗血栓藥物是目前研制新型抗血栓藥物的有效途徑。白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)俦栋胼祁悆?nèi)酯化合物，是常用中藥白術的主要化學成分之一。有研究發(fā)現(xiàn)白術內(nèi)酯Ⅱ能阻滯黑色素瘤細胞的細胞周期及誘導細胞凋亡，但其對血小板的作用目前尚不清楚[4-5]。本實驗擬觀察白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)ρ“寤钚允欠裼幸种谱饔?，并探討其可能的分子機制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

健康人單采血小板由上海瑞金醫(yī)院提供。膠原購自CHRONO-PAR（美國），蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自瑞士的羅氏公司，三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）、前列腺素E（PGE1）、纖維蛋白原（Fg）購自西格瑪公司（美國），磷酸化蛋白類激酶B（Akt473）抗體、GAPDH抗體購自Cell Signaling公司，鬼筆環(huán)肽購自美國生命技術公司。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG購自Jackson公司，Western發(fā)光液為Milipore公司生產(chǎn)，白術內(nèi)酯Ⅱ購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。血小板聚集儀 （CHRONO-LOG，美國），正置熒光顯微鏡（Zeiss公司，德國），電泳儀（上海天能科技有限公司，上海）。

1.2實驗動物

C57BL/6野生型小鼠，6～8周，雌雄各半，體重（20±2）g，動物合格證號：2015000510330。動物飼養(yǎng)在上海交通大學醫(yī)學院SPF級動物房，實驗開始前1周進行適應性飼養(yǎng)，溫度（23±1）℃，濕度（50±5）%，飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。

1.3方法

1.3.1小鼠血小板聚集1%異戊巴比妥（0.2 m L/只）麻醉小鼠后，用加有抗凝劑枸櫞酸鈉的2.5 mL注射器抽取小鼠的腹主動脈血至15 mL BD管中，加入等體積的0.9%生理鹽水，apyrase（終濃度1 U/mL）以及PGE1（終濃度為0.1μg/mL），顛倒混勻后室溫離心，1050 r/min，10 min，吸取上層富含血小板血漿（PRP）至新的15 m L BD管中，加入apyrase（同上）和乙二胺四乙酸（EDTA，終濃度為5 mmol/L），顛倒混勻后室溫離心，2100 r/min，10 min，棄上清，得到血小板，重懸于事先37℃預熱好的臺式緩沖液中，用全血細胞計數(shù)儀計數(shù)并將血小板稀釋為3×108個/mL，37℃水浴靜置1 h待用[6]。以二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，配制白術內(nèi)酯Ⅱ溶液。白術內(nèi)酯Ⅱ（終濃度為10μmol/L）與小鼠洗滌血小板（每管300μL）孵育3 min后，使用血小板聚集儀檢測在膠原誘導下白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)π∈笱“寰奂潭鹊挠绊憽?/p>

1.3.2人血小板聚集 在富含人血小板血漿（PRP）中加入apyrase（終濃度2 U/mL）和EDTA（終濃度為5 mmol/L），室溫離心，1900 r/min 10 min，得到血小板，重懸于臺式緩沖液中，用全血細胞計數(shù)儀計數(shù)并稀釋為3× 108個/mL，37℃水浴靜置1 h。不同濃度的白術內(nèi)酯Ⅱ與洗滌人血小板（每管300μL）孵育3 min，使用血小板聚集儀檢測在膠原誘導下白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)θ搜“寰奂潭鹊挠绊慬7]。

1.3.3血小板在纖維蛋白原上的鋪展將制備好的洗滌人血小板稀釋為3×107個/m L，取100μL加到已鋪有纖維蛋白原的玻璃爬片上，置于37℃恒溫箱中孵育1 h；洗去爬片上未與纖維蛋白原結(jié)合的血小板，每個爬片上加100μL鬼筆環(huán)肽染料，室溫避光孵育30 min；封片；使用正置顯微鏡的油鏡觀察并拍照，用NIH Image J軟件計算鋪展血小板的面積[8]。

1.3.4Ak t 473分子的磷酸化水平檢測人血小板樣品用2×SDS裂解液裂解并煮沸，用10%的聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)到聚乙二烯氟化物膜上，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為相同上樣量[9]。

1.4統(tǒng)計學方法

采用Graphpad prism 5軟件分析和作圖，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)π∈笱“寰奂挠绊?/p>

在膠原（1.3μg/mL）的刺激下，白術內(nèi)酯Ⅱ為10μmol/L時就能顯著的抑制小鼠血小板的聚集，與DMSO組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1　白術內(nèi)酯Ⅱ在刺激劑膠原的誘導下對小鼠血小板聚集的影響（n=4）

2.2白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)θ搜“寰奂挠绊?/p>

結(jié)果顯示：白術內(nèi)酯Ⅱ為10μmol/L時能明顯抑制在膠原刺激下小鼠血小板的聚集，因此檢測相同濃度的白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)θ搜“寰奂挠绊?，在膠原（0.67μg/mL）的刺激下，白術內(nèi)酯Ⅱ為10μmol/L時也能顯著的抑制人血小板的聚集，且隨濃度降低其抑制程度，與DMSO組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），在白術內(nèi)酯Ⅱ濃度為0.5μmol/L時基本無抑制作用。見圖2。

圖2　白術內(nèi)酯Ⅱ在刺激劑膠原的誘導下對人血小板聚集的影響（n=4）

2.3白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)θ搜“邃佌沟挠绊?/p>

在固態(tài)纖維蛋白原上的鋪展，經(jīng)過不同濃度（1、5、10μmol/L）的白術內(nèi)酯Ⅱ的處理后，血小板在纖維蛋白原上鋪展的平均面積分別為（3847.3±1738.7）、（1926.2±786.1）、（1467.2±591.5）像素，而DMSO組鋪展的平均面積為（8697.1±1388.9）像素，由此說明白術內(nèi)酯Ⅱ能抑制血小板在纖維蛋白原上鋪展。見圖3。

2.4白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)Ψ肿覣kt473磷酸化的影響

PI3K/Akt是參與調(diào)節(jié)血小板活化的經(jīng)典信號通路，因此，本研究探討膠原（0.67μg/mL）刺激下白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)ρ“逯蠥kt473分子磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示：白術內(nèi)酯Ⅱ降低了人血小板中Akt473分子的磷酸化水平，并呈濃度依賴。見圖4。

3　討論

白術為菊科植物白術的干燥根，其性味甘、苦、溫，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，可用于脾虛食少、腹脹腹瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等，是臨床上常用的中藥[10-11]。白術中主要含有揮發(fā)油和內(nèi)酯類化合物，白術內(nèi)酯Ⅱ是白術內(nèi)酯類成分之一，具有抗炎抗腫瘤作用，具有調(diào)節(jié)胃腸道功能和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收的功效[12-13]。有資料顯示白術有抗栓作用[14-15]，但其具體機制是通過影響血小板還是凝血系統(tǒng)以及有效成分為何目前尚無報道[11]。

圖3　白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)θ搜“邃佌沟挠绊懀╪=4）

圖4　Western blot檢測經(jīng)不同濃度白術內(nèi)酯Ⅱ處理后人血小板中Akt473分子磷酸化的水平

冠狀動脈疾病等血栓栓塞性疾病的發(fā)病率逐年增加，而血栓形成是一個復雜的病理過程，血小板激活在血栓形成過程中發(fā)揮著至關重要的作用，因此抗血小板聚集在防治血栓栓塞性疾病中具有重要意義[16]。膠原是常用血小板聚集的刺激劑[17-18]，本研究顯示白術內(nèi)酯Ⅱ以較低濃度抑制了小鼠血小板在膠原刺激下的體外聚集，對人血小板也具有較強的抑制作用，且具有濃度梯度。血小板的鋪展是由整合素介導的。血小板接收到其表面受體傳遞到細胞內(nèi)部的活化信號后，通過一系列的下游蛋白激活和抑制將信號傳遞到整合素，從而使整合素活化，即為血小板的內(nèi)向外信號傳遞，活化的整合素與纖維蛋白原特異性結(jié)合，從而向胞內(nèi)傳遞外向內(nèi)信號引起血小板活化信號的進一步放大。整合素所介導的雙向信號在血小板聚集、鋪展和穩(wěn)定血栓形成中起著至關重要的作用[19-20]。白術內(nèi)酯Ⅱ可能通過影響整合素的外向內(nèi)信號從而抑制血小板的鋪展。

在血小板的活化過程中有多種信號分子的參與，已有研究證實分子Akt在血小板黏附、聚集、鋪展的過程中具有重要作用[21]。在白術內(nèi)酯Ⅱ抗炎的相關研究中也發(fā)現(xiàn)其對PI3K-Akt信號通路有影響[22]。因此本研究檢測了在膠原的刺激下，經(jīng)過白術內(nèi)酯Ⅱ處理后人血小板蛋白中Akt473分子的磷酸化水平變化[16-17]。結(jié)果顯示，白術內(nèi)酯Ⅱ處理后，人血小板中Akt473分子的磷酸化水平明顯降低，提示白術內(nèi)酯Ⅱ可能通過抑制PI3K-Akt通路，進而抑制血小板的活化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，白術內(nèi)酯Ⅱ能有效抑制膠原誘導的血小板聚集，并通過影響PI3K-Akt通路來抑制血小板的活化，為白術內(nèi)酯Ⅱ成為新型抗血栓藥物提供了可能。

[1]武源，郭宏寶，王鐵軍，等.幾種中草藥組分對家兔體外血小板聚集作用的比較[J].中國臨床藥理學與治療學，2007，12（9）：1047-1051.

[2]Liu L，Li J，Zhang Y，etal.Salvianolic acid B inhibits platelets as a P2Y12 antagonist and PDE inhibitor：evidence from clinic to laboratory[J].Thromb Res，2014，134（4）：866-876.

[3]Maione F，De Feo V，Caiazzo E，etal.Tanshinone IIA，a major component of Salvia milthorriza Bunge，inhibits platelet activation via Erk-2 signaling pathway[J].J Ethnopharmacol，2014，155（2）：1236-1242.

[4]Ge J，Wang YW，Lu XC，et al.Determination of atractylenolide II in rat plasma by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].Biomed Chromatogr，2007，21（3）：299-303.

[5]Ye Y，Wang H，Chu JH，et al.AtractylenolideⅡinduces G1 cell-cycle arrest and apoptosis in B16 melanoma cells[J]. J Ethnopharmacol，2011，136（1）：279-282.

[6]Weng Z，Li D，Zhang L，et al.PTEN regulates collageninduced platelet activation[J].Blood，2010，116（14）：2579-2581.

[7]Liu J，Jackson CW，Gruppo RA，et al.The beta3 subunit of the integrin alphaIIbbeta3 regulates alphaIIb-mediated outside-in signaling[J].Blood，2005，105（11）：4345-4352.

[8]Flevaris P，Li Z，Zhang G，et al.Two distinct roles of mitogen-activated protein kinases in platelets and a novel Rac1-MAPK-dependent integrin outside-in retractile signaling pathway[J].Blood，2009，113（4）：893-901.

[9]Liu J，F(xiàn)itzgerald ME，Berndt MC，et al.Bruton tyrosine kinase is essential for botrocetin/VWF-induced signaling and GPIb-dependent thrombus formation invivo[J]. Blood，2006，108（8）：2596-2603.

[10]馮文林，伍海濤.白術治療腸道疾病的作用機制探討[J].遼寧中醫(yī)雜志，2016，43（1）：125-127.

[11]朱釗銘，李漢成，羅佳波.HPLC-MS法同時測定白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及其在大鼠體內(nèi)的藥動學[J].中藥藥理與臨床，2013，29（6）：25-29.

[12]孫燁，蔡云，劉昳，等.白術內(nèi)酯對癌性惡病質(zhì)小鼠血清細胞因子的影響[J].河北中醫(yī)，2013，35（7）：1059-1062.

[13]高小玲，汪保英，陳玉龍，等.白術內(nèi)酯對小鼠結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響[J].世界華人消化雜志，2013，21（26）：2690-2693.

[14]彭騰，李鴻翔，鄧赟，等.白術內(nèi)酯類成分及藥理作用研究進展[J].中國藥房，2012，23（39）：3732-3734.

[15]劉玥，殷惠軍，史大卓，等.活血化瘀中藥與抗血小板治療[J].科學通報，2014，59（8）：647-655.

[16]王炎炎，朱慧超，李來來，等.注射用血栓通體外對家兔血小板聚集的影響[J].中草藥，2014，45（18）：2669-2672.

[17]梁翌，楊為民，李緒蘭，等.銀杏葉提取物對兔血小板聚集的影響[J].中國藥學雜志，2002，37（1）：25-28.

[18]Chen X，Zhang Y，Wang Y，et al.PDK1 regulates platelet activation and arterial thrombosis[J].Blood，2013，121（18）：3718-3726.

[19]Shattil SJ，Newman PJ.Integrins：dynamic scaffolds for adhesion and signaling in platelets[J].Blood，2004，104（6）：1606-1615.

[20]Jackson SP，Nesbitt WS，Kulkarni S.Signaling events underlying thrombus formation[J].J Thromb Haemost，2003，1（7）：1602-1612.

[21]閆琰，趙革新，陳北冬，等.銀杏內(nèi)酯B抑制血小板CD40 Ligand表達的分子機制研究[J].中國藥理學通報，2012，28（2）：245-248.

[22]Jackson SP，Schoenwaelder SM，Goncalves I，et al.PI3-kinase p110beta：a new target forantithrombotic therapy[J]. Nat Med，2005，11（5）：507-514.

Influence of atractylenolideⅡ on p latelet and phosphorylation level of protein kinase B

CHEN Yizhu1YANG Wenlong1GUO Lingyu1ZHANG Mingliang1LIU Junling2ZHANG Junfeng1
1.Department of Cardiology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai201900,China;2.School of Basic Medicine,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

Objective To observe the effects of the atractylenolideⅡon mice and human platelet in vitro and discuss the underlying mechanism.M ethods The effect of atractylenolideⅡ on mice and human platelet aggregation was induced by collagen in vitro.The effect of atractylenolideⅡ on human platelet was detected through the experiment of spreading.The phosphorylation level of Akt473 was detected by Western blot.Results AtractylenolideⅡinhibited collagen-induced mice and human platelet aggregation(P<0.01),and the spreading of human platelets on immobilized fibrinogen treaded with atractylenolideⅡwas diminished(P<0.01).The level of phospho-Akt 473 was downregulated in the presence of atractylenolideⅡ(P<0.01).Conclusion These results show that atractylenolideⅡ affected the platelet aggregation and spreading,and through regulating the PI3K-Akt signal way to inhibit platelet activities,atractylenolideⅡis an effective antiplatelet compounds.

AtractylenolideⅡ;Platelet;Thrombus;Akt473

R285.5

A

1673-7210（2016）04（b）-0018-05

上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院自然科學研究基金資助項目（syz2015-002）。

陳一竹（1988-），女，上海交通大學2013級內(nèi)科學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：冠心病。

張俊峰（1972-），男，教授，碩士研究生導師；研究方向：冠心病。

（2016-01-11本文編輯：蘇暢）