桃紅四物湯對(duì)創(chuàng)傷性股骨頭壞死大鼠組織形態(tài)學(xué)及VEGFR2、Dll4表達(dá)的影響

馮海波，王怡璇，姚金龍，熊輝

〔摘要〕 目的 通過(guò)觀察桃紅四物湯對(duì)創(chuàng)傷性股骨頭壞死大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）、Delta樣配體4（Delta-like 4， Dll4）蛋白表達(dá)的影響，探究其防治創(chuàng)傷性股骨頭壞死的作用機(jī)制。方法 將44只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（10只）和造模組（34只）。造模組行創(chuàng)傷性股骨頭壞死造模；8周后從正常組和造模組分別隨機(jī)取2只進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)造模是否成功。將造模成功的剩余32只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組及桃紅四物湯低、中、高劑量組，每組8只；加上正常組剩余大鼠8只，共計(jì)5組。正常組和模型組予以生理鹽水灌胃；桃紅四物湯低、中、高劑量組分別予以9、18、36 g/kg桃紅四物湯灌胃。持續(xù)4周后采集股骨頭標(biāo)本，采用micro-CT觀察股骨頭組織形態(tài)學(xué)，光鏡下檢測(cè)空骨陷窩率，免疫組織化學(xué)法測(cè)定VEGFR2和Dll4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組對(duì)比，其余4組大鼠股骨頭均有不同程度的骨質(zhì)破壞、軟骨面塌陷及空骨陷窩率升高（P＜0.05）；模型組和桃紅四物湯低劑量組VEGFR2蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與模型組對(duì)比，桃紅四物湯中、高劑量組大鼠股骨頭軟骨形態(tài)改善，組織空骨陷窩率下降（P＜0.05）；桃紅四物湯低、中、高劑量組VEGFR2蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。結(jié)論 桃紅四物湯能有效降低創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨組織空骨陷窩、改善組織形態(tài)，可能與增加VEGFR2、Dll4蛋白的表達(dá)、激活VEGF/Notch信號(hào)通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 桃紅四物湯；組織形態(tài)學(xué)；創(chuàng)傷性股骨頭壞死；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2；Delta樣配體4；血管重建

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.006

Effects of Taohong Siwu Decoction on histomorphology and expressions of VEGFR2 and Dll4 in rats with traumatic osteonecrosis of the femoral head

FENG Haibo1，2， WANG Yixuan2， YAO Jinlong1， XIONG Hui2*

1. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha，

Hunan 410005， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Taohong Siwu Decoction （THSWD） on the expressions of vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2）and Delta-like 4 （Dll4） proteins in rats with traumatic osteonecrosis of the femoral head （ONFH）， so as to explore its mechanism of action in preventing and treating this disease. Methods Totally 44 rats were randomized into normal group （n=10） and modeling group （n=34） using the random number table method. Modeling group underwent traumatic ONFH modeling; after 8 weeks， 2 rats were randomly selected from normal group and 2 rats from modeling group， for comparative testing to determine whether the modeling was successful. The remaining 32 rats with successful modeling were randomly subdivided into model group and low-， medium-， and high-dose THSWD groups using the random number table method， with 8 rats in each group; with the 8 remaining rats from normal group， totally 5 groups were set. Normal group and model group were given normal saline by gavage; low-， medium-， and high-dose THSWD groups were given 9， 18， and 36 g/kg THSWD by gavage， respectively. After 4 weeks of continuous treatment， femoral head specimens were collected， and the morphology of femoral head tissues was observed using micro-CT; the rate of empty bone lacuna was checked by light microscopy; the expression levels of VEGFR2 and Dll4 proteins were measured using immunohistochemistry. Results Compared with normal group， the other four groups of rats showed varying degrees of bone destruction， cartilage surface collapse， and an increase in the rate of empty bone lacuna （P<0.05）; the expression of VEGFR2 protein decreased in both model group and low-dose THSWD group （P<0.05）; the expression of Dll4 protein was significantly higher in medium- and high-dose THSWD groups （P<0.05）. Compared with model group， the morphology of the femoral head cartilage in medium- and high-dose THSWD groups improved， and the rate of empty bone lacunae in the tissue decreased （P<0.05）; the expression of VEGFR2 protein increased in low-， medium-， and high-dose THSWD groups （P<0.05）; the expression of Dll4 protein increased in medium- and high-dose THSWD groups （P<0.05）. Conclusion THSWD can effectively reduce the empty bone lacunae of traumatic ONFH and improve the tissue morphology， which may be related to increasing the expressions of VEGFR2 and Dll4 proteins and activating the VEGF/Notch signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Taohong Siwu Decoction; histomorphology; traumatic osteonecrosis of the femoral head; vascular endothelial growth factor receptor 2; Delta-like 4; vascular reconstruction

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head， ONFH）是骨科臨床常見(jiàn)的致殘率高、治療較為復(fù)雜的骨關(guān)節(jié)疾病[1]。目前，對(duì)于本病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但根據(jù)病因主要分為激素性、酒精性和創(chuàng)傷性O(shè)NFH。隨著生活節(jié)奏和交通的快速化，創(chuàng)傷性O(shè)NFH發(fā)病率不斷升高，并逐漸年輕化[2]。目前，髖關(guān)節(jié)置換是本病的主要治療方式，但存在創(chuàng)傷大、需二期翻修等風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，早期非手術(shù)保髖治療ONFH尤為重要。創(chuàng)傷性O(shè)NFH的機(jī)制主要在于損傷局部血管、導(dǎo)致血運(yùn)的破壞，因此，治療的關(guān)鍵在于血液循環(huán)的重新建立。

桃紅四物湯是中醫(yī)經(jīng)典活血方，具有活血化瘀的作用，臨床運(yùn)用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯具有促進(jìn)壞死股骨頭修復(fù)，改善股骨頭局部血運(yùn)，使壞死股骨頭修復(fù)的功能，對(duì)ONFH臨床療效較好[4-5]。血管的通暢是血運(yùn)重建的基礎(chǔ)，因此，推測(cè)其機(jī)制可能與促進(jìn)損傷血管的修復(fù)和血管新生相關(guān)。VEGF/Notch信號(hào)軸是調(diào)節(jié)血管新生的重要通路，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）受體中與血管最相關(guān)的調(diào)控因子，VEGFR2水平上調(diào)，可促進(jìn)血管新生[6]。Delta樣配體4（Delta-like4， Dll4）是與血管新生和損傷血管修復(fù)最為相關(guān)的Notch配體，在血管生成中發(fā)揮重要作用[7]。本研究通過(guò)觀察桃紅四物湯對(duì)大鼠創(chuàng)傷性O(shè)NFH進(jìn)程中VEGFR2及Dll4表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討桃紅四物湯治療創(chuàng)傷性O(shè)NFH的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

44只雄性健康SD大鼠（體質(zhì)量180～200 g），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0005]統(tǒng)一購(gòu)置并分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度50%～70%，由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心人員進(jìn)行專人飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)：LL2019100906。

1.2? 藥物及試劑

蘇木精染液、蘇木精分化液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G1004、G1309）；伊紅染液（上海晶萊生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17372-87-1）；Dll4（英國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab176876）；VEGFR2（北京博奧森生物技術(shù)公司，批號(hào)：Bs-1047R）；PBS溶液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9062）。

1.3? 主要儀器

Micro-CT（美國(guó)Perkin Elmer公司，型號(hào)：Quantum FX）；成像系統(tǒng)（日本Nikon公司，型號(hào)：Nikon DS-U3）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C、DYCZ-40D）；電磁爐（荷蘭Philips公司，型號(hào)：HD4925）；包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JB-P5）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：RV-211M）。

1.4? 動(dòng)物分組

將44只雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（10只）和造模組（34只）。正常組不予特殊處理，造模組予以手術(shù)造模。8周后正常組和造模組分別隨機(jī)取2只大鼠進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)造模是否成功。造模成功后，將剩余32只造模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組及桃紅四物湯低、中、高劑量組，每組8只，正常組剩余大鼠8只，共計(jì)5組。

1.5? 模型制備

參照PELED等[8]手術(shù)造模方式，具體步驟如下：根據(jù)常用標(biāo)準(zhǔn)配制大鼠麻醉所需戊巴比妥鈉，然后用1 mL注射器予以腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉滿意后，用固定器將大鼠俯臥位固定于保溫操作臺(tái)上，在備皮處（手術(shù)區(qū)域）用聚維酮碘消毒。手術(shù)切口以大鼠大轉(zhuǎn)子為中心，沿大腿方向縱向依次切開(kāi)皮膚、皮下組織，分離臀中肌。在保護(hù)好神經(jīng)血管的前提下切斷圓韌帶，使髖關(guān)節(jié)脫位、股骨頭充分暴露；將股骨頸基底骨膜用尖刀充分刮離，并切除關(guān)節(jié)囊的折返纖維，然后將股骨頭重新復(fù)位，復(fù)位后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合。術(shù)后予以青霉素5萬(wàn)U/d，肌內(nèi)注射，連續(xù)3 d，防止傷口感染。注意在鼠籠上方放置鼠糧，以便大鼠只有在保持站立的情況下才能進(jìn)食水。通過(guò)micro-CT見(jiàn)大鼠股骨頭軟骨面改變、軟骨下骨出現(xiàn)壞死、骨小梁稀疏甚至斷裂等即為造模成功[9]。

1.6? 桃紅四物湯制備及給藥劑量

桃紅四物湯的配比根據(jù)《醫(yī)宗金鑒》中的比例換成現(xiàn)代計(jì)量：桃仁20 g、紅花10 g、生地黃20 g、當(dāng)歸20 g、赤芍20 g、川芎10 g。中藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科一次購(gòu)進(jìn)，采用傳統(tǒng)煎煮后，用蒸發(fā)儀濃縮成含生藥2 g/mL的湯劑，并封包處理。以大鼠200 g為中位數(shù)，采用人與動(dòng)物體表面積換算[10]確定大鼠具體給藥劑量，桃紅四物湯的低、中、高劑量分別為9、18、36 g/kg。

1.7? 干預(yù)方法

正常組大鼠予以常規(guī)喂養(yǎng)+生理鹽水灌胃；模型組在造模成功后予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)+生理鹽水灌胃；桃紅四物湯低、中、高劑量組予以正常喂養(yǎng)并分別予以桃紅四物湯9、18、36 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃。持續(xù)4周后采集股骨頭標(biāo)本。

1.8? 觀察指標(biāo)

1.8.1? 大體組織形態(tài)學(xué)觀察? 將所截取的股骨頭標(biāo)本用專用試管進(jìn)行存放固定，然后用micro-CT對(duì)股骨頭及近端股骨頸進(jìn)行掃描，觀察股骨頭大體組織形態(tài)學(xué)，主要包括股骨頭整體外觀、關(guān)節(jié)軟骨面塌陷情況。X線掃描參數(shù)：電壓90 kV，電流80 ？滋A，像素尺寸90 ？滋m，高分辨率掃描模式。

1.8.2? 空骨陷窩率檢測(cè)? 將股骨頭經(jīng)4%多聚甲醛固定后，在用EDTA脫鈣，持續(xù)3～4周。脫鈣完全后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成厚度約4 μm的切片。在200倍鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，記錄出空骨陷窩和總骨陷窩，并計(jì)算出平均值。平均空骨陷窩數(shù)與平均總骨陷窩數(shù)的比值用百分比率表示，即為空骨陷窩率[11]。

1.8.3? 大鼠股骨頭VEGFR2、Dll4蛋白表達(dá)水平檢測(cè)? 取出大鼠股骨頭標(biāo)本后，用多聚甲醛液固定，采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行樣品制備、抗原修復(fù)、背景封閉等步驟，測(cè)定VEGFR2、Dll4蛋白的平均光密度。首先進(jìn)行石蠟切片脫蠟、抗原修復(fù)、孵育；然后將切片進(jìn)行DAB顯色，顯色時(shí)間在顯微鏡下控制，陽(yáng)性為棕黃色；再用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，蘇木精返藍(lán)液返藍(lán)；最后進(jìn)行脫水封片，顯微鏡檢查并采集圖像進(jìn)行分析。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，滿足正態(tài)性、方差齊性時(shí)，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；方差不齊時(shí)，采用Dunnett's T3檢驗(yàn)；當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠大體組織形態(tài)學(xué)觀察

正常組大鼠股骨頭軟骨面光滑，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)塌陷；模型組股骨頭可見(jiàn)骨質(zhì)破壞、軟骨面塌陷明顯；桃紅四物湯低劑量組大鼠股骨頭軟骨面可見(jiàn)部分塌陷、骨質(zhì)破壞較明顯；桃紅四物湯中劑量組大鼠股骨頭形態(tài)結(jié)構(gòu)輕度變形、軟骨面可見(jiàn)少部分塌陷和毛糙；桃紅四物湯高劑量組大鼠股骨頭形態(tài)稍改變，關(guān)節(jié)面欠規(guī)整，少部分軟骨面塌陷。詳見(jiàn)圖1。

2.2? 各組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較

與正常組比較，其余各組大鼠空骨陷窩率升高（P＜0.05）。與模型組比較，桃紅四物湯中、高劑量組空骨陷窩率下降（P＜0.05）。與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯中、高劑量組空骨陷窩率降低（P＜0.05）。桃紅四物湯中、高劑量組空骨陷窩率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3? 各組大鼠股骨頭VEGFR2、Dll4蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組和桃紅四物湯低劑量組VEGFR2蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組VEGFR2蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；桃紅四物湯中、高劑量組Dll4蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯中劑量組VEGFR2蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組Dll4蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。桃紅四物湯中、高劑量組VEGFR2、Dll4蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2、圖2—3。

3 討論

創(chuàng)傷性O(shè)NFH是臨床上的常見(jiàn)骨科疾病，其發(fā)病機(jī)制主要是由于創(chuàng)傷損傷了營(yíng)養(yǎng)股骨頭的血管，導(dǎo)致血液循環(huán)的中斷或不暢，從而使骨代謝出現(xiàn)異常并進(jìn)一步形成ONFH；多見(jiàn)于髖周骨折、脫位等損傷，以股骨頸骨折和髖關(guān)節(jié)脫位最為常見(jiàn)[12]。ONFH的治療主要在于抑制壞死股骨頭的進(jìn)一步惡化和促進(jìn)骨組織新生重建，這兩方面皆離不開(kāi)血運(yùn)[13]。因此，血液循環(huán)的恢復(fù)離不開(kāi)血管的運(yùn)載，血管的重建和修復(fù)是保守治療的關(guān)鍵。

中醫(yī)學(xué)中，沒(méi)有“股骨頭壞死”的病名；但根據(jù)發(fā)病的部位及臨床癥狀與“髖痹”“骨痹”“骨痿”“骨蝕”等疾病相對(duì)應(yīng)。歷代不同醫(yī)家認(rèn)為[14]，其發(fā)病機(jī)制主要與各種致病因素導(dǎo)致人體血瘀氣滯、瘀血阻絡(luò)、正氣虧虛有關(guān)，其中瘀血阻絡(luò)是關(guān)鍵因素?，F(xiàn)代眾多醫(yī)家也主張“從瘀論治”，活血化瘀的治則應(yīng)貫穿在本病治療的全過(guò)程[15]。桃紅四物湯是中醫(yī)活血化瘀的經(jīng)典方，廣泛應(yīng)用于血瘀病癥，在臨床上對(duì)ONFH的治療也有肯定的療效[16]。林智軍等[17]在臨床運(yùn)用桃四物湯加減治療ONFH患者，發(fā)現(xiàn)能有效減輕Ⅰ、Ⅱ期ONFH患者的臨床癥狀。高玉龍等[18]在臨床中采用手術(shù)聯(lián)合桃紅四物湯加減治療ONFH，發(fā)現(xiàn)不僅可有效降低炎癥因子水平，而且可有效降低全血黏度（vhole blood viscosity， WBV）和血漿黏度（plasma viscosity， PV）。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[19]，桃紅四物湯對(duì)創(chuàng)傷性O(shè)NFH的髖關(guān)節(jié)功能有明顯的改善作用。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，micro-CT可見(jiàn)中、高劑量的桃紅四物湯能有效改善創(chuàng)傷性O(shè)NFH大鼠股骨頭塌陷，降低骨組織空骨陷窩率，進(jìn)一步證實(shí)了桃紅四物湯對(duì)創(chuàng)傷性O(shè)NFH的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯治療ONFH的機(jī)制可能與其調(diào)控炎性因子和凝血因子表達(dá)、改善血液流變學(xué)（hemorheology， HR）特性、促進(jìn)血管修復(fù)或新生等有關(guān)[20-22]。VEGF是一種具有調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)血管生成和重塑的特異性生長(zhǎng)因子[23]，VEGF表達(dá)的上調(diào)在血管新生中發(fā)揮重要的作用[24]。趙建濤等[25]研究證實(shí)，心肌組織VEGF、b-FGF表達(dá)的上調(diào)，能促進(jìn)血管新生，改善心室重構(gòu)，從而改善急性心肌梗死大鼠心功能。人體中的VEGF主要有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及PLGF 5個(gè)亞型；有VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 3種受體[26]。VEGFR2作為重要的血管生長(zhǎng)因子受體之一，與VEGF結(jié)合后發(fā)生磷酸化，p-VEGFR2繼而調(diào)控下游信號(hào)通路，在血管新生及重塑過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)增殖與機(jī)體血管形成的調(diào)控，主要是通過(guò)相關(guān)的細(xì)胞因子調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體VEGFR2的活化及表達(dá)，進(jìn)而抑制或激活其相關(guān)的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過(guò)影響增殖、遷移等途徑達(dá)到調(diào)控作用[29-30]。宋宇可等[31]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，血管生成數(shù)和長(zhǎng)度的增長(zhǎng)與VEGF、VEGFR-2表達(dá)的上調(diào)密切相關(guān)。欒冰等[32]在研究中發(fā)現(xiàn)，化瘀通絡(luò)中藥單體的主要成分可通過(guò)抑制VEGFR2/Akt/ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管新生，進(jìn)一步印證了VEGFR2在血管新生中的作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，桃紅四物湯低、中、高劑量組的VEGFR2蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯中劑量組VEGFR2蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；桃紅四物湯低、高劑量組的VEGFR2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；說(shuō)明桃紅四物湯能提高VEGFR2蛋白表達(dá)水平，但并不是濃度越高越好，以中劑量桃紅四物湯為最佳。

Notch信號(hào)通路由Notch受體、配體及下游信號(hào)分子組成。哺乳動(dòng)物中有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4共4個(gè)Notch受體和Deltalike1、Deltalike3、Deltalike4，Jagged1、Jagged2 5個(gè)配體，其中Notch1和Dll4與損傷血管的修復(fù)和血管新生關(guān)系最為密切[33-34]。有研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠Dll4比敲除Notch1會(huì)出現(xiàn)更加嚴(yán)重的血管缺陷；在血管新生過(guò)程中，Notch1受體必須與配體Dll4相結(jié)合才能激活，發(fā)揮Notch信號(hào)通路的作用[35]。有研究證明[36]，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)Notch1及其配體Dll4的表達(dá)來(lái)促進(jìn)損傷內(nèi)皮修復(fù)，若Notch信號(hào)通路被阻斷，血管內(nèi)皮細(xì)胞將停止增殖。LI等[37]研究發(fā)現(xiàn)，宣痹通瘀方可通過(guò)促進(jìn)Dll4表達(dá)，從而促進(jìn)心肌缺血大鼠血管生成。ＨE等[38]研究發(fā)現(xiàn)，錦雞兒總黃酮通過(guò)促進(jìn)腦組織中Dll4和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠的局部血管生成，改善局部血循環(huán)，使缺血性腦卒中癥狀改善并使梗死面積減少。HULTGREN等[39]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)Dll4-Notch-VEGFR2軸可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞活化和血管生成。Dll4作為Notch信號(hào)通路的配體之一，在血管修復(fù)和新生過(guò)程中起著十分重要的作用。本研究結(jié)果顯示，低、中、高劑量的桃紅四物湯均具有促進(jìn)股骨頭Dll4蛋白表達(dá)的作用，并隨著藥物濃度的提升不斷增強(qiáng)；與低劑量組比較，桃紅四物湯高劑量組Dll4蛋白表達(dá)明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但桃紅四物湯中、高劑量組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明Dll4蛋白表達(dá)并不是隨著藥物濃度的升高而無(wú)限增加。

綜上所述，經(jīng)典活血方桃紅四物湯可有效改善創(chuàng)傷性O(shè)NFH形態(tài)，有效降低股骨頭空骨陷窩率；桃紅四物湯中、高劑量組可明顯增加股骨頭VEGFR2和Dll4蛋白的表達(dá)，與藥物濃度有一定的相關(guān)性，但不是隨著濃度升高而無(wú)限增加。因此，推測(cè)中、高劑量的桃紅四物湯能有效降低股骨頭組織空骨陷窩、改善組織形態(tài)，可能與增加VEGFR2、Dll4蛋白的表達(dá)，激活VEGF/Notch信號(hào)通路有關(guān)，但是否具有靶向作用，需進(jìn)一步深入研究。

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（本文編輯? 周? 旦）