Klotho蛋白對急性心肌梗死小鼠腸道菌群及心功能的影響

李巖松 王 凱 李鐘鳴 劉先玲 丁胤彰 孫 燕 馬文杰 許 迪

急性心肌梗死作為一種缺血性心臟病,具有極高的致殘率和病死率。每年全球大約有1600萬人死于急性心肌梗死引起的心力衰竭[1]。目前,我國心血管病發(fā)生率正處于持續(xù)上升階段。據(jù)推算,全國約有3.3億人患有心臟病,其中冠心病患病人數(shù)達(dá)到了1139萬。自2005年以來,我國急性心肌梗死病死率呈快速上升趨勢,2005年我國城鄉(xiāng)地區(qū)急性心肌梗死病死率分別為42.1/10萬和22.2/10萬,而2018年我國城鄉(xiāng)地區(qū)急性心肌梗死病死率則達(dá)到了120.18/10萬和128.24/10萬[2]。吸煙、肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病等作為急性心肌梗死的傳統(tǒng)危險因素,已被廣大群眾所重視。近些年,越來越多的研究表明,腸道菌群在人類心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[3]。良好的腸道菌群環(huán)境不僅可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝、抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激、調(diào)控免疫應(yīng)答等途徑緩解動脈粥樣硬化,有效降低急性心肌梗死風(fēng)險,減少急性心肌梗死后不良事件的發(fā)生,還可以通過改善血壓、抑制心肌纖維化、改善心臟重構(gòu)發(fā)揮心臟保護(hù)作用[3～5]。

Klotho(KL)是一種抗衰老基因,最早于1997年在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[6]。研究表明,小鼠體內(nèi)KL水平升高可以延長小鼠壽命,改善認(rèn)知功能,同時能有效預(yù)防心臟病、腎臟病、血管鈣化、氧化應(yīng)激,而KL缺乏的小鼠則表現(xiàn)出明顯的衰老體征,如壽命短、生長發(fā)育遲緩、脊柱后凸、血管鈣化、骨質(zhì)疏松、認(rèn)知障礙、多器官萎縮等[6,7]。人類的KL基因位于13號染色體上,長約50kb,由5個外顯子組成,在預(yù)防心血管疾病,特別是維持心臟和血管功能方面發(fā)揮著重要作用。KL能預(yù)防心肌肥大,改善心肌重塑,防止血管鈣化和動脈粥樣硬化。因此調(diào)節(jié)血漿中KL水平及其在心肌細(xì)胞中的表達(dá)對于改善細(xì)胞代謝、維持心功能和預(yù)防某些疾病至關(guān)重要[8]。但KL對急性心肌梗死后小鼠腸道菌群及心功能的影響目前鮮有報(bào)道。本研究通過建立小鼠急性心肌梗死模型,應(yīng)用16S rDNA測序技術(shù)和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù),比較分析了KL治療的急性心肌梗死后小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化及相關(guān)心力衰竭指標(biāo)的差異。

材料與方法

1.動物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):本實(shí)驗(yàn)方案按照美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)指南進(jìn)行,并經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(許可證號:IACUC-2102002)。24只體質(zhì)量為20～25g的6周齡雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠重組Klotho蛋白(貨號:1819-KL-050)購自美國R&D Systems公司。所有動物均在22～24℃溫度下飼養(yǎng),每天光暗循環(huán)12h,能自由飲食飲水。適應(yīng)1周后,7只小鼠接受假急性心肌梗死手術(shù),17只小鼠接受急性心肌梗死手術(shù)。急性心肌梗死手術(shù)按如下方法進(jìn)行:用戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉小鼠,在第2、3肋間打開胸腔,暴露心臟,用7-0縫合線結(jié)扎左前降支(left anterior descending artery, LAD)。假手術(shù)組小鼠進(jìn)行相同操作,但不結(jié)扎LAD。術(shù)后第2天,假手術(shù)組小鼠全部存活,手術(shù)組小鼠存活14只。將小鼠分為以下3組:假手術(shù)組小鼠為對照組,手術(shù)組小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為心梗組和KL組,每組各7只。KL組小鼠每兩天腹腔注射1次KL(20ng/kg),對照組和心梗組小鼠按相同方法腹腔注射0.9%氯化鈉溶液(15ml/kg),共計(jì)4周[9]。4周后進(jìn)行超聲心動圖檢查。

2.樣本收集及16S rDNA測序:術(shù)后第30天每組均存活7只小鼠,處死小鼠,收集1粒腸道內(nèi)糞便置于凍存管,-80℃冰箱保存,隨后進(jìn)行測序(由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成)。收取小鼠心臟,剪去心房及右心室,收集心梗組與KL組梗死周圍區(qū)域心肌組織及對照組左心室心肌組織置于4℃ 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)中清洗,后置于-80℃冰箱凍存[10]。選取E.Z.N.A.?StoolDNA提取試劑盒,按照試劑盒說明書提取糞便DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量,同時采用紫外分光光度計(jì)對DNA進(jìn)行定量。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)對序列進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物由AMPure XT beads (美國Beckman Coulter Genomics公司)純化,Qubit(美國Invitrogen公司)定量,擴(kuò)增子文庫的大小和數(shù)量分別在Agilent2100生物分析儀(美國Agilent公司)和Illumina(Kapa Biosciences,美國Woburn公司)的文庫定量試劑盒上進(jìn)行評估。在NovaSeq PE250平臺上對庫進(jìn)行測序。

3.生物信息分析:樣品在Illumina NovaSeq平臺上按照制造商的建議進(jìn)行測序,由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司提供。根據(jù)樣品獨(dú)特的條形碼,將配對端序列分配給樣品,并將建庫引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端序列并讀取。根據(jù)fqtrim(v0.94),在特定的過濾條件下對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾,以獲得高質(zhì)量的clean標(biāo)簽。使用Vsearch軟件(v2.3.4)對嵌合序列進(jìn)行過濾。利用DADA2進(jìn)行解調(diào),得到特征表和特征序列。使用SILVA以及NT-16S數(shù)據(jù)庫做物種分類及后續(xù)分析,根據(jù)feature注釋結(jié)果和各樣品feature特征表,獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表,本研究主要在門、屬兩個分類水平統(tǒng)計(jì)分析菌群結(jié)構(gòu)。

4.BNP、TNF-α和TGF-β1mRNA表達(dá)水平的測定:將凍存的心肌組織置于組織研磨器中,加入500μl TRIzol提取總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)檢測。使用RT-qPCR引物,引物序列依次為:BNP上游引物:5′-GAGGTCACTCCTATCCTCTGG-3′,下游引物:5′-GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC-3′;TNF-α上游引物:5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3′,下游引物:5′-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3′;TGF-β1上游引物:5′-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3′,下游引物:5′-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物:5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′[11]。

結(jié) 果

1. α多樣性分析:α多樣性是指一個特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種多樣性情況,主要用來反映物種豐富度、均勻度以及測序深度。本實(shí)驗(yàn)主要選取了Chao1、Shannon、Simpson等指數(shù)來反映各個樣本菌群的豐富度和均勻度。在本實(shí)驗(yàn)中,各樣本的稀釋曲線趨于平緩,說明測序深度已足夠(圖1)。對組間α多樣性指數(shù)Chao1、Shannon、Simpson進(jìn)行比較,繪制小提琴圖,進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),結(jié)果顯示,各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 各樣本的稀釋曲線

圖2 α多樣性指數(shù)Chao1、Shannon、Simpson的小提琴圖

2.β多樣性分析:β多樣性是指不同環(huán)境群落之間的物種差異性。本實(shí)驗(yàn)通過主成分分析(principal component analysis, PCA)對3組小鼠進(jìn)行了β多樣性分析,從圖中可以看出心梗組與KL組在菌群結(jié)構(gòu)上存在明顯的差異(圖3)。二維未加權(quán)主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)則表明心梗組與另外兩組菌群輪廓存在明顯分離(圖4)。

圖3 3組間主成分分析(PCA)

圖4 3組間二維未加權(quán)PCoA分析

3.物種分析:在門水平上,3組小鼠菌群主要由擬桿菌門、厚壁菌們、變形菌門、Epsilonbacteraeota菌門和疣微菌門組成,其中擬桿菌門和厚壁菌門所占比例較大。與對照組比較,心梗組小鼠厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)豐度值降低,兩組間Epsilonbacteraeota菌門相對豐度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.826)。與心梗組比較,KL組小鼠F/B豐度值升高,Epsilonbacteraeota菌門相對豐度增高。本實(shí)驗(yàn)中,3組間變形菌門和疣微菌門相對豐度比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5、表1)。在屬水平上,各組小鼠主要菌群為Muri菌、毛螺菌科NK4A136菌屬、杜氏桿菌、幽門螺桿菌等。從圖6中可以看出,與對照組比較,心梗組小鼠Muri菌相對豐度增高,毛螺菌科NK4A136菌屬相對豐度降低。與心梗組比較,KL組小鼠Muri菌明顯減少,毛螺菌科NK4A136菌屬略微增加。與另外兩組比較,KL組小鼠杜氏桿菌、幽門螺桿菌和乳酸桿菌相對豐度明顯增高,3組小鼠嗜黏蛋白阿克曼菌屬、嗜膽菌屬、Muribaculum菌、擬桿菌屬和另枝菌屬相對豐度比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 小鼠腸道菌群門水平主要物種豐度差異情況(相對豐度

表2 小鼠腸道菌群屬水平主要物種豐度差異情況(相對豐度

4.心力衰竭相關(guān)指標(biāo)分析:與對照組比較,心梗組小鼠BNP、TNF-α和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平明顯升高,左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)降低(P<0.05);與心梗組比較,KL組小鼠BNP、TNF-α和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平明顯降低,左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)升高(P<0.05),詳見圖7。

討 論

目前,腸道菌群和急性心肌梗死間的關(guān)系受到人們廣泛關(guān)注。有研究認(rèn)為,急性心肌梗死后由于腸道灌注不足、腸道屏障功能受損以及通透性增加,導(dǎo)致腸道細(xì)菌及其代謝物移位進(jìn)入體循環(huán),從而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)最終促進(jìn)不良心血管事件的發(fā)生[12,13]。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組大鼠比較,急性心肌梗死的大鼠回腸微絨毛排列雜亂、粗糙、無光澤,腸絨毛上皮細(xì)胞廣泛脫落,小腸Chiu評分明顯高于假手術(shù)組。近年來,應(yīng)用抗生素、益生菌、微生物酶抑制劑等調(diào)節(jié)腸道菌群、保護(hù)腸黏膜已逐漸成為治療急性心肌梗死后心力衰竭的新方向[15]。KL作為一種抗衰老蛋白,對心臟的保護(hù)作用已被越來越多的研究證實(shí),而其對腸道菌群的影響至今仍無相關(guān)報(bào)道。本研究基于16S rDNA測序技術(shù),探討了KL對急性心肌梗死小鼠腸道菌群的影響,為KL的臨床應(yīng)用提供了新的思路。

許多疾病都可以對腸道菌群產(chǎn)生影響,其共同特點(diǎn)是條件致病菌增加而益生菌減少[16,17]。在本研究中,3組小鼠腸道菌群均以擬桿菌門和厚壁菌門為主,而發(fā)生急性心肌梗死后,擬桿菌門的相對豐度顯著提高,厚壁菌門的相對豐度則明顯減少,這一結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致[14,18]。有研究表明,厚壁菌能將食物中纖維轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸,后者是腸黏膜細(xì)胞主要的能量來源之一。厚壁菌相對豐度的提高有利于腸黏膜細(xì)胞的能量供應(yīng),保護(hù)腸道屏障功能,阻止菌群移位及機(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生[19]。杜氏桿菌是近些年才被鑒定并命名的一種新菌屬,近年來有研究提出,杜氏桿菌擁有調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、降低肥胖小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇、提高腸道免疫力和提高機(jī)體抗炎能力的功效,這一發(fā)現(xiàn)或?qū)?yīng)用于疾病的預(yù)防和治療[20,21]。乳酸桿菌是一種常見的益生菌,動物研究表明,乳酸桿菌可以顯著縮小冠脈結(jié)扎大鼠的心肌梗死面積,改善心功能[22]。近年來,一項(xiàng)針對15例冠心病患者的研究發(fā)現(xiàn),額外補(bǔ)充乳酸桿菌不僅能有效改善血管內(nèi)皮功能,并且具有良好的抗炎作用,其主要降低了血漿中瘦素、IL-8、IL-12水平[23]。在本研究中,KL組厚壁菌、杜氏桿菌和乳酸桿菌相對豐度明顯高于心梗組,雖然3組間乳酸桿菌相對豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但其在熱圖上已呈現(xiàn)出明顯差異,這可能與樣本量不足有關(guān),后續(xù)研究會加大樣本量。

另外,本研究結(jié)果顯示,KL組幽門螺桿菌(屬Epsilonbacteraeota門)相對豐度顯著高于另外兩組。近年來,幽門螺桿菌對心血管疾病的影響成為研究熱點(diǎn)。盡管目前有研究表明幽門螺桿菌感染可能是心肌梗死的危險因素之一,但兩者之間的關(guān)系仍存在爭議,有Meta分析否認(rèn)了兩者間的關(guān)聯(lián)[24～26]。一項(xiàng)大型前瞻性研究表明,幽門螺桿菌感染和缺血性心臟病病死率之間亦無明顯聯(lián)系。本研究比較了3組小鼠相關(guān)心力衰竭指標(biāo),發(fā)現(xiàn)KL可以有效降低急性心肌梗死后BNP、TNF-α和TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平,逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死后左心室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)的降低。上述結(jié)果表明,經(jīng)過KL治療,急性心肌梗死小鼠的心功能得到了一定的改善。因此,KL組小鼠幽門螺桿菌的改變是否會對小鼠的心功能產(chǎn)生遠(yuǎn)期影響仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,KL能顯著改善急性心肌梗死小鼠的腸道菌群紊亂,促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的生長,同時能改善心功能,這為KL的應(yīng)用提供了新的思路和依據(jù)。