丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒抗體滴度、miR-27a和miR-130a水平及意義

宋娟芳,李 源

陜西省西安市北方醫(yī)院檢驗科,陜西西安 710043

丙型肝炎是丙型肝炎病毒(HCV)感染機體所導致的病毒性肝炎。相關數(shù)據(jù)顯示,HCV屬于世界范圍內(nèi)的感染性疾病,除東歐外,1990-2017年全球HCV感染年齡標準化患病率逐漸下降[1]。在我國,丙型肝炎是發(fā)病率僅次于乙型肝炎的病毒性肝炎[2]。慢性HCV感染有進展為肝硬化的風險,約28.0%肝硬化由HCV感染所引發(fā)[3],而肝硬化存在較高肝細胞癌發(fā)生風險[4]。做好丙型肝炎肝硬化的準確診斷對預后改善有重要作用。HCV抗體(HCV-Ab)是機體遭受HCV感染后所產(chǎn)生的抗體,是HCV感染的主要診斷指標之一。以往在乙型肝炎病情研究中發(fā)現(xiàn),乙型肝炎病毒核心抗體定量檢測值與乙型肝炎炎癥程度和纖維化相關,故臨床可通過定量測定乙型肝炎病毒核心抗體水平判斷肝臟損傷程度,同時為疾病治療提供依據(jù)[5-6]。但在丙型肝炎中HCV-Ab是否存在與乙型肝炎相似狀態(tài),目前尚缺少數(shù)據(jù)報道。微小RNA(miRNA)是一類廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及病毒感染等過程的小分子肽,其中miRNA-27a(miR-27a)位于19p13.13號染色體,具有促炎癥反應、促血管生成、調(diào)控細胞增殖分化等功效;miRNA-130a(miR-130a)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子,可通過與靶基因上的信使RNA選擇性結合,抑制其表達,從而參與真核生物組織發(fā)育、細胞分化及免疫調(diào)控等生理變化。以往研究顯示,miR-27a在乙型肝炎患者體內(nèi)高表達,是影響乙型肝炎進展為肝硬化和肝癌的獨立危險因素[7];miR-130a在乙型肝炎病毒感染患者體內(nèi)呈高表達,尤其是隱匿性乙型肝炎患者,對隱匿性乙型肝炎病毒感染具有一定診斷價值[8],但關于其在丙型肝炎患者體內(nèi)表達狀態(tài)及意義尚未明確。本研究檢通過測定丙型肝炎患者血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a水平,分析其與HCV肝損傷情況的相關性,以期為患者臨床診治提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2022年6月在西安市北方醫(yī)院(以下簡稱本院)就診的152例丙型肝炎患者為觀察組,另選取同期在本院體檢中心接受常規(guī)體檢的健康人群152例為對照組。納入標準:觀察組符合《丙型肝炎防治指南(2019年版)》[9]中有關丙型肝炎的診斷標準;無凝血功能障礙;臨床資料完整;非過敏體質(zhì);精神正常,能配合研究。排除標準:被確診為乙型、戊型肝炎病毒感染;合并其他原因所致肝病;合并其他類型局部或全身性感染;近6個月內(nèi)接受過干擾素、核苷酸類或免疫調(diào)節(jié)劑治療;合并惡性腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病。觀察組男83例,女69例;年齡33～69歲,平均(57.15±8.16)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為19.45～29.13 kg/m2,平均(23.76±3.97)kg/m2。對照組男77例,女75例;年齡35～70歲,平均(56.64±8.17)歲;BMI為18.69～30.13 kg/m2,平均(23.77±3.95)kg/m2。兩組受試者性別、年齡、BMI比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究符合本院醫(yī)學倫理委員會審核標準。所有受試者均簽署知情協(xié)議書。

1.2方法

1.2.1血清指標測定 取兩組受試者晨起空腹肘靜脈血3～5 mL,3 000/min離心10 min,留取上清液待用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定觀察組HCV-Ab滴度,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定觀察組血清HCV-DNA載量和兩組血清miR-27a、miR-130a表達水平(2-△△Ct法計算)。

1.2.2肝臟損傷程度評估 觀察組于入院后3 d內(nèi)在超聲引導下進行肝穿刺活檢,獲取5個及以上完整匯管區(qū)長度1.0～2.0 cm的肝組織標本,10%甲醛溶液固定,制作石蠟切片,蘇木精-伊紅染色,采用Scheuer評分系統(tǒng)評估患者肝臟炎癥分級和纖維化分期情況。(1)炎癥分級:G0級為肝臟匯管區(qū)、肝小葉及周圍均無炎癥;G1級為匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥病變,肝小葉有肝細胞變性和少數(shù)點狀或灶狀壞死;G2級為匯管區(qū)及周圍均有輕度碎屑狀壞死,肝小葉內(nèi)細胞變性,出現(xiàn)點狀和灶狀壞死或嗜酸性小體;G3級為匯管區(qū)及周圍中度碎屑狀壞死,肝小葉變性,呈現(xiàn)融合壞死或橋接壞死;G4級為匯管區(qū)及周圍重度碎屑狀壞死,大范圍橋接壞死,多小葉壞死。(2)纖維化分期:S0期為無纖維化;S1期為匯管區(qū)無纖維化,但肝小葉和肝竇內(nèi)現(xiàn)纖維化;S2期為匯管區(qū)周圍呈現(xiàn)纖維化,且形成纖維間隔,但保留小葉結構;S3期為纖維間隔和小葉結構均紊亂,但尚未現(xiàn)肝硬化結節(jié);S4期為肝硬化[10]。

2 結 果

2.1兩組受試者血清miR-27a、miR-130a水平比較 觀察組患者miR-27a、miR-130a水平均顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組受試者血清miR-27a、miR-130a水平比較

2.2觀察組血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a與HCV-DNA載量的相關性 觀察組患者HCV-DNA載量為0.86～3.17 IU/mL,平均(1.75±0.44)IU/mL。Pearson相關分析顯示,觀察組血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a均與HCV-DNA載量呈正相關(r=0.325、0.365、0.427,P<0.001)。見圖1。

注:A為血清miR-27a與HCV-DNA載量相關性散點圖;B為血清miR-130a與HCV-DNA載量相關性散點圖;C為血清HCV-Ab滴度與HCV-DNA載量相關性散點圖。

2.3觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟炎癥分級的相關性 不同炎癥程度患者血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);肝臟炎癥G4級患者的血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平高于G3級、G2級和G1級(P<0.01)。見表2。

表2 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟炎癥分級的關系

2.4觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟纖維化的關系 不同纖維化程度患者血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);肝臟纖維化S4期者的血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平高于S2～S3期、S1期和S0期(P<0.01)。見表3。

表3 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平與肝臟纖維化情況的關系

2.5血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平預測肝硬化的效能 多因素Logistic回歸分析結果顯示,血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平是發(fā)生丙型肝炎肝硬化的影響因素(P<0.05)。見表4。根據(jù)是否發(fā)生肝硬化,得回歸方程為Y=-20.020+1.340×XHCV-Ab+1.197×XmiR-27a+1.061×XmiR-130a。3項指標聯(lián)合預測丙型肝炎患者發(fā)生肝硬化的曲線下面積(AUC)明顯高于血清HCV-Ab、miR-27a、miR-130a單獨檢測(Z=2.083、2.474、2.902,P<0.01)。見圖2、表5。

圖2 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平單獨及聯(lián)合預測肝硬化的ROC曲線

表5 觀察組血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平單獨及聯(lián)合預測肝硬化的效能

3 討 論

HCV感染后自然轉陰率較低,70.0%～80.0%急性HCV感染會轉化為慢性肝炎。慢性肝炎是引發(fā)肝硬化的重要病因之一,患者一旦進入肝硬化代償期即意味著其肝臟功能明顯減退,死亡風險顯著升高,5年存活率可降至50.0%左右[11]。相關數(shù)據(jù)顯示,2015年全球共有約7 100萬人被確診為HCV感染,其中30.0%以上進展為肝硬化或肝癌,同時每年約39.9萬人死于丙型肝炎及其所引發(fā)的肝硬化等疾病[12]。早期評估肝炎患者肝臟損傷情況對疾病治療和預后改善均具有重要意義。超聲引導下的肝臟穿刺活檢是判斷患者肝臟炎癥分級和纖維化分期的“金標準”,但該技術屬于有創(chuàng)操作,且檢測工序煩瑣、周期長。近年來,隨著血清學指標研究的深入,其在疾病診斷、病情和臨床效果評估中的優(yōu)勢越來越明顯,受到臨床工作者的廣泛關注。

HCV屬于單股正鏈RNA病毒,HCV感染者HCV-DNA水平可在一程度上反映疾病進展狀況和宿住免疫狀態(tài),其水平越高提示病毒復制能力越強,機體循環(huán)病毒量越大,免疫機制清除病毒難度越大[13];同時,HCV大量復制會干擾細胞內(nèi)大分子物質(zhì)合成,改變?nèi)苊阁w膜通透性,增加肝細胞毒性損傷[14]。HCV-Ab是HCV感染后刺激機體免疫系統(tǒng)所釋放的蛋白分子,其在HCV感染和病毒性肝炎診斷中具有良好的靈敏度和特異度[15]。本研究結果顯示,觀察組HCV-Ab滴度與HCV-DNA載量呈正相關,且隨著患者肝臟組織炎癥分級增加,纖維化程度加重,血清HCV-Ab滴度顯著升高(P<0.05),對患者肝硬化發(fā)生具有一定預測價值(P<0.05)。這可能歸因于HCV持續(xù)復制不斷刺激人體免疫細胞為對抗病毒而釋放相應抗體,同時病毒復制導致局部炎癥反復遷延,肝細胞持續(xù)壞死,纖維組織過度增生,最終導致了肝硬化的發(fā)生[16]。

miRNA是一類可在轉錄或翻譯水平上調(diào)控相關基因表達的小分子RNA,同時可參與病毒感染性疾病及惡性腫瘤等發(fā)生、發(fā)展過程。相關研究證實,miRNA與肝炎病毒所致肝臟損傷過程密切相關[17]。miR-27a是位于19號染色體上的小分子RNA,其高表達與病毒侵襲、炎癥反應及細胞增殖等病理過程有關[18];miR-130a是一種與血小板功能和惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關的小分子RNA。研究顯示,miR-27a是乙型肝炎患者肝硬化發(fā)生的危險因素之一,且可預測乙型肝炎肝硬化的發(fā)生,但預測靈敏度和特異度僅分別為73.02%和61.19%,而與另外一種微小RNA分子聯(lián)合檢測能有效提高預測特異度[7];miR-130a同樣高表達于乙型肝炎肝硬化患者體內(nèi)[19]。本研究結果顯示,與對照組相比,觀察組血清miR-27a和miR-130a均明顯表達上調(diào),且其表達水平與HCV-DNA載量呈正相關,同時其表達水平隨著丙型感染患者肝臟組織炎癥分級增大、纖維化程度加重而顯著升高(P<0.05)。分析原因,miR-27a一方面有助于HCV侵襲復制,促進局部炎癥反應,加重肝臟損傷[18];另一方面,可通過抑制肝細胞增殖蛋白-跨膜泛素樣蛋白1,抑制肝細胞增殖及肝臟損傷的修復過程[7]。HCV對骨髓細胞具有明顯抑制作用,導致患者體內(nèi)血小板顯著減少;同時細胞外基質(zhì)大量形成是肝臟纖維化的中心環(huán)節(jié)。miR-130a可作用于過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ的3’非翻譯區(qū),下調(diào)PPARγ表達,調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ,一方面抑制血小板形成,加速肝臟纖維化;另一方面激活細胞外基質(zhì)基因表達,加速肝臟纖維化進程及肝硬化發(fā)生[19-20]。此外,本研究結果顯示,miR-27a、miR-130a與HCV-Ab滴度聯(lián)合檢測對丙型肝炎患者發(fā)生肝硬化具有較高預測效能,提示臨床可通過檢測miR-27a、miR-130a水平與HCV-Ab滴度變化,判斷丙型肝炎患者肝臟損傷進程,從而指導臨床治療。

綜上所述,丙型肝炎患者血清中存在與乙型肝炎相似的miR-27a、miR-130a表達狀態(tài),且丙型肝炎患者血清HCV-Ab滴度、miR-27a、miR-130a水平均與機體HCV-DNA載量、肝臟炎癥活動度和纖維化嚴重程度呈一定相關性,對肝硬化具有一定預測價值,聯(lián)合檢測預測肝硬化效能更高。