耐碳青霉烯類大腸埃希菌耐藥基因及同源性分析*

宋瑞雅,閆小利,陳清清,林玉玲

福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院檢驗科,福建泉州 362000)

大腸埃希菌為最常見的腸道桿菌,是醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染的主要病原菌之一,大腸埃希菌感染可引起嚴重疾病,包括肺炎、腦膜炎、敗血癥等[1]。由于抗生素的廣泛使用,碳青霉烯類耐藥腸桿菌(CRE)不斷增加,CRE造成的感染增加了臨床的治療難度,病死率較高,達30.0%～80.0%[2-3]。大腸埃希菌在CRE中占比排名第二,僅次于肺炎克雷伯菌[4-5]。因此,本研究對耐碳青霉烯類大腸埃希菌(CRECO)菌株的臨床資料、耐藥表型及耐藥基因的ST型進行監(jiān)測分析,從而為臨床合理用藥及感染防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2017-2021年福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌,剔除同一患者檢出的重復菌株。共獲得6 609株大腸埃希菌,其中CRECO 36株,對成功復蘇的15株CRECO進行耐藥基因及同源性分析。

1.2主要試劑和儀器 MH瓊脂平板、血瓊脂平板(廣州市迪景微生物科技有限公司);MALDI-TOF微生物質譜儀(布魯克公司);Phoenix100全自動細菌鑒定儀及藥敏系統(tǒng)(美國BD公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);基因擴增儀(杭州博日科技有限公司);美羅培南、亞胺培南等藥物敏感紙片(奧克歐德有限公司);PCR試劑盒(廈門萬和信生物科技有限公司);引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定及藥敏試驗 采用常規(guī)細菌培養(yǎng)方法對臨床標本進行細菌培養(yǎng),采用Phoenix100全自動細菌鑒定儀及藥敏系統(tǒng)對37 ℃培養(yǎng)24 h的單個菌落進行鑒定及藥敏試驗,采用質譜儀及Kirby-Bauer(K-B)法進行藥敏復核,結果判斷遵循美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2021年版本標準。

1.3.2耐藥基因檢測 利用煮沸法提取菌株的DNA,PCR擴增碳青霉烯酶(CAPs)基因,引物參照文獻[6],見表1。CAPs反應體系(50 μL): Premix Taq 25 μL,模板5 μL,正、反向引物各2 μL,雙蒸餾水16 μL。反應參數(shù):94 ℃預變性5 min;94 ℃變性50 s,退火溫度50～55 ℃ 30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察菌株是否攜帶待檢的碳青霉烯耐藥基因。電泳陽性的擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。測序結果經(jīng)Blast比對分析,確定基因類型。

表1 CPAs基因及其引物

1.3.3多位點序列分型(MLST) 提取菌株的DNA,PCR擴增大腸埃希菌7個管家基因(adk、 fumC、icd、purA、gyrB、recA、mdh),引物設計參考MLST網(wǎng)站(http://mLst.ucc.ie/mLst/dbs/Ecoli)。反應體系(50 μL):Premix Taq 25 μL,模板5 μL,正、反向引物各2 μL,雙蒸餾水16 μL。反應參數(shù):94 ℃預變性5 min;94 ℃變性60 s,退火溫度50～55 ℃ 30 s,72 ℃延伸50 s,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。測序后的結果經(jīng)過PubMlst數(shù)據(jù)庫比對確定其ST型。

1.4統(tǒng)計學處理 采用WHONET5.6統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結 果

2.1菌株來源及分布 患者年齡主要分布在50～60歲及80歲以上,菌株來自17個科室,主要來源于泌尿外科(16.67%, 6/36)和老年病科泌尿外科(13.89%,5/36),其余來自兒科(5.56%,2/36)、感染病科(8.33%,3/36)、胃腸外科(8.33%,3/36)、消化內科(5.56%,2/36)、血液內科(2.78%,1/36)、重癥醫(yī)學科(8.33%,3/36)等。尿液標本分離的CRECO占55.56%(20/36);其次為靜脈全血(8.33%,3/36)、膿液(11.11%,4/36)和痰液(8.33%,3/36)等。

2.2CRECO藥敏情況 CRECO對8種抗菌藥物的耐藥率達100.0%,對7種抗菌藥物耐藥率>50.0%,對阿米卡星的耐藥率<20.0%,對多黏菌素耐藥率低(2.8%);對替加環(huán)素的敏感率高。見表2。

表2 CRECO對抗菌藥物耐藥率[n=36,n(%)]

2.3CRECO耐藥基因分析 通過PCR擴增15株復蘇菌株的耐藥基因,共得獲得14株陽性,有12株攜帶blaNDM[80%(12/14)],其中11株攜帶blaNDM-5,1株攜帶blaNDM-1;2株攜帶blaKPC[13.33%(2/15)];1株陰性。其余耐藥基因(blaIMP、blaVIM、blaOXA-48)均未檢出。

2.4MLST分型結果 同源性分析11株攜帶blaNDM-5基因的CRECO,結果顯示大部分屬于不同克隆型,ST型有ST156、ST117、ST2177、ST744、ST405和ST10Cplx(復合群),其中3株大腸埃希菌的ST型完全一致,屬于ST10Cplx。見表3。

表3 CRECO管家基因和ST分型分析

3 討 論

本研究中CRECO檢出率為0.54%(36/6 609),與中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(http:/ /www.chinets.com /Data /AntibioticDrugFast)報道的2021年全國CRECO平均檢出率1.6%及福建地區(qū)1.1%基本一致;大腸埃希菌分離率居首位占18.96%,雖然CRECO檢出率較低,但由于臨床中大腸埃希菌檢出基數(shù)大及CRECO治療難度大,臨床醫(yī)生需繼續(xù)做好CRECO的耐藥監(jiān)測。

本研究中CRECO呈現(xiàn)多重耐藥狀態(tài):對頭孢菌素類、喹諾酮類耐藥率>95.0%;對多數(shù)抗菌藥物耐藥率>50.0%;對阿米卡星耐藥率為19.4%,高于文獻報道的大腸埃希菌對阿米卡星的耐藥率(2.2%)[7];對多黏菌素耐藥率低,尚未見替加環(huán)素耐藥情況。目前,多黏菌素及替加環(huán)素被認為是對CRE感染臨床常選擇的治療藥物[8-9]。多黏菌素由于腎毒性和神經(jīng)毒性較大應用較有限。劉周等[10]報道對多黏菌素B非耐藥的CRECO有9.1%菌株攜帶mcr-9基因,而攜帶mcr-9菌株均表現(xiàn)為多黏菌素的誘導耐藥,臨床工作中應注意這一特殊表型。而近年來對替加環(huán)素耐藥的CRECO也常見報道[11]。劉宇陽等[12]報道CRECO對替加環(huán)素異質性耐藥率達37.5%?？梢奀RECO感染的治療現(xiàn)狀不容樂觀,因此應對其耐藥機制進一步研究,以遏制其耐藥的傳播。

現(xiàn)有研究認為CRECO的耐藥機制主要有4種,其中以產(chǎn)碳青霉烯酶為主要耐藥機制[13]。blaNDM和blaOXA-48被認為是碳青霉烯類耐藥腸桿菌中產(chǎn)生金屬-β-內酰胺酶和碳青霉烯酶的最常見原因[14]。產(chǎn)新德里金屬β-內酰胺酶(NDM-1)是大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制之一,NDM-5是NDM-1的變體之一[15]。有研究表明,與NDM-1相比,NDM-5對碳青霉烯類抗菌藥物具有更強的水解作用,耐藥性更強[16]。本研究檢測了15株CRECO碳青霉烯酶編碼基因,陽性率為93.33%(14/15),以blaNDM-5檢出為主,與文獻報道我國CRECO blaNDM-5檢出率最高相一致[17-18],可見國內CRECO以產(chǎn)blaNDM-5為流行株。1株試驗陰性的原因可能是其他耐藥機制引起,如膜孔蛋白缺失、外排泵等,有待進一步研究。利用MLST進行菌株的同源性分析,為進一步證實菌株的克隆型、區(qū)分菌株提供了重要依據(jù)。有研究報道,攜帶blaNDM-5的CRECO的ST型以ST410、ST167、ST361、ST405等流行為主[19-20]。本地區(qū)則以ST10Cplx流行為主,ST型分布在不同地區(qū)有所差異。本研究中攜帶blaNDM-5的CRECO雖有3株ST型完全一致,但其入院時間未重疊、所在科室不同,屬于散發(fā)病例。目前,國內外尚未見NDM-5菌株引起暴發(fā)的相關報道。余艷等[21]報道,絕大多數(shù)blaNDM基因可位于20種不同類型的質粒上,可傳遞到其他細菌或整合到染色體,而引起blaNDM基因快速而廣泛地傳播。目前已有多個國家報道新型冠狀病毒感染大流行期間CRECO檢出率明顯增加[22-23],因此應進一步加強對CRECO的監(jiān)測以防造成CRECO擴散而增加治療難度。