MicroRNA-101對(duì)肺塵埃沉著病肺纖維化影響的研究*

黃 健,汪 濤,蘇盈笑,洪 炳△

江西省胸科醫(yī)院:1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科;2.麻醉科,江西南昌 330006

肺塵埃沉著病是一種不可逆的職業(yè)病,由于患者長(zhǎng)期吸入大量游離的二氧化硅(SiO2)粉塵導(dǎo)致肺部出現(xiàn)廣泛結(jié)節(jié)性纖維化病變[1]。數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)至今肺塵埃沉著病患者累計(jì)超70萬(wàn)人[2]。肺塵埃沉著病患者的預(yù)后情況都較差,因此找尋新的治療方向成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。研究顯示,microRNA(miRNA)可通過(guò)調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路,參與到纖維化的過(guò)程中[3],本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),通過(guò)觀察相關(guān)指標(biāo)水平在不同對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的變化,研究miRNA-101(miR-101)在延緩肺塵埃沉著病肺纖維化中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)健康成年雄性C57BL/6小鼠18只,2月齡,體質(zhì)量20～25 g,購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。

1.2儀器與試劑 Olympus光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司),Forma 311CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、ECO0.9超凈工作臺(tái)、Siemens低溫-80 ℃冰柜、低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司),4 ℃冰箱及-20 ℃冰箱(德國(guó)Siemens公司)、DYY-7C Western電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、SPL-250電熱恒溫水浴鍋(北京泰瑞有限公司);兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)抗體(GeneTex公司),羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體(碧云天生物技術(shù)公司),RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(上海貝博生物公司);SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(莊盟生物公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京百萊公司),SiO2粉塵(Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1肺塵埃沉著病小鼠的構(gòu)建 將18只雄性C57BL/6小鼠均分為空白對(duì)照組、生理鹽水組及SiO2組,各組小鼠稱體質(zhì)量后,用75%乙醇消毒,鈍性分離皮膚,逐層暴露氣管。生理鹽水組、SiO2組分別使用微量注射器吸取50 μL生理鹽水或SiO2粉塵混懸液后,經(jīng)兩氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管,空白對(duì)照組小鼠只做假手術(shù)處理。待動(dòng)物清醒后,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2小鼠肺組織形態(tài) 各組小鼠處死后留取肺組織,取部分肺組織采用4%的多聚甲醛固定24 h,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等步驟后,以5 ?m厚度連續(xù)切片,HE染色后,采用光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠肺組織形態(tài)。

1.3.3小鼠肺組織miR-101表達(dá)水平檢測(cè) 小鼠處死后留取肺組織,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織中miR-101的表達(dá)水平。

1.3.4小鼠肺組織Col I表達(dá)水平檢測(cè) 采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑預(yù)混液裂解細(xì)胞,將上清液置于-80 ℃保存,采用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè),各組細(xì)胞的蛋白樣品通過(guò)SDS-PSGE凝膠電泳進(jìn)行分離。PVDF 膜恒流200 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)模,轉(zhuǎn)膜結(jié)束用考馬斯亮藍(lán)染色液觀察凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移情況。用麗春紅染色液對(duì)PVDF膜進(jìn)行染色,膜上有粉紅色條帶表明蛋白轉(zhuǎn)移成功。使用TBST緩沖液漂洗干凈,進(jìn)行免疫檢測(cè),5%脫脂奶粉封閉膜,4 ℃過(guò)夜。按照兔抗鼠一抗說(shuō)明書配制好反應(yīng)液,孵育2 h。TBST 緩沖液漂洗3次,按照羊抗兔二抗說(shuō)明書配制好二抗反應(yīng)液,孵育2 h。TBST緩沖液洗膜3次,顯色后上機(jī)采圖。應(yīng)用ImageLab醫(yī)學(xué)圖像分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡所表達(dá)的條帶進(jìn)行半定量檢測(cè),用平均光密度(A)表示?？蛉「饔镜赖鞍?對(duì)照彩色Marker分層及相應(yīng)的分子量標(biāo)記,測(cè)出A,目的蛋白A/大鼠β肌動(dòng)蛋白(β-actin)A。

1.4檢測(cè)指標(biāo) (1)比較各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化;(2)比較各組小鼠肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1肺塵埃沉著病小鼠的構(gòu)建情況 SiO2組在28 d形成肺塵埃沉著病模型?？瞻讓?duì)照組及生理鹽水組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡間隔均勻,無(wú)間質(zhì)纖維組織增生。SiO2組小鼠肺部組織發(fā)生纖維化,肺部結(jié)構(gòu)被破壞,肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)有大量的細(xì)胞浸潤(rùn),并且伴有炎癥反應(yīng),血管壁增厚。

2.2肺塵埃沉著病小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變 空白對(duì)照組及生理鹽水組肺泡結(jié)構(gòu)正常,肺泡壁薄;SiO2組肺泡間隔增寬,肺泡壁增厚,結(jié)構(gòu)塌陷,纖維細(xì)胞和肉芽腫明顯,炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),肺間質(zhì)實(shí)變充血,殘存少量正常肺泡。見(jiàn)圖1。

注:A為空白對(duì)照組;B為生理鹽水組;C為SiO2組。

2.3三組小鼠肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達(dá)水平比較 生理鹽水組肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SiO2組的miR-101表達(dá)水平低于空白對(duì)照組,而ColⅠ蛋白水平高于空白對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組肺塵埃沉著病小鼠肺組織的miR-101和ColⅠ蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

肺塵埃沉著病是我國(guó)目前危害最嚴(yán)重和造成嚴(yán)重社會(huì)影響的職業(yè)病。肺塵埃沉著病的肺纖維化涉及大量細(xì)胞因子及細(xì)胞因子形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)miRNA可以靶向作用于相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路[4-5],對(duì)組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用。國(guó)外研究表明miR-101在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中表達(dá)下調(diào),可抑制成纖維細(xì)胞活化[6-8]。目前已知肺塵埃沉著病的病理改變包括結(jié)節(jié)、彌漫性纖維化、塵斑,但肺纖維化發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜尚未完全明確[9-12]。肺纖維化是由于各類刺激導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞損傷,進(jìn)一步與成纖維細(xì)胞作用,在肺損傷區(qū)域出現(xiàn)肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞累積,肺成纖維細(xì)胞灶從而形成[13]。

SiO2進(jìn)入肺組織后,能夠激活細(xì)胞自噬,進(jìn)而釋放大量炎癥細(xì)胞因子,造成持續(xù)性循環(huán)信號(hào)錯(cuò)誤傳導(dǎo),導(dǎo)致級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),造成不可逆的肺組織損傷,致使患者生存質(zhì)量下降。HE染色后觀察各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常,肺泡壁薄;SiO2模型組肺泡間隔增寬,肺泡壁增厚,結(jié)構(gòu)塌陷,纖維細(xì)胞和肉芽腫明顯,炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),肺間質(zhì)實(shí)變充血,殘存少量正常肺泡,提示SiO2干預(yù)后肺組織損傷嚴(yán)重。

miRNA是一類內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miR-101過(guò)表達(dá)可以減輕心肌梗死后心肌纖維化,也可作為其他器官纖維化疾病潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明,SiO2組的miR-101表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(P<0.05),提示miR-101是一種負(fù)性調(diào)控因子,在肺塵埃沉著病纖維化中發(fā)揮了同樣的作用。本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組小鼠肺組織的miR-101和Col I表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而SiO2組的miR-101表達(dá)水平顯著降低,Col I蛋白水平則顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明SiO2粉塵能夠激活肺纖維化細(xì)胞,使ColⅠ蛋白表達(dá)水平明顯升高,提示有大量成纖維細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化,而miR-101可改善SiO2粉塵誘導(dǎo)的肺纖維化。既往研究表明,miR-101是一種抗纖維化的microRNA[14],與本研究結(jié)果一致。

綜上所述,miR-101的特異性表達(dá)抑制了肺纖維化的發(fā)病過(guò)程,調(diào)控miR-101可作為肺纖維化治療的有效方法,為肺纖維化的臨床診斷和治療提供新的依據(jù)和方向。