miRNA-146通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路促進(jìn)POI模型卵巢顆粒細(xì)胞生長的機(jī)制研究*

劉 英,何鳳屏,△,劉玉蘭,范舒舒,劉彥慧

1.廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院體檢中心,廣東韶關(guān) 523125;2.廣東省東莞市婦幼保健院/東莞市生殖與遺傳研究所,廣東東莞 512026

原發(fā)性卵巢功能不全(POI)通常是指女性40歲之前閉經(jīng),伴有高卵泡刺激素(FSH)和低雌激素水平,卵巢功能喪失導(dǎo)致閉經(jīng)和性器官萎縮,抑制卵泡生長和發(fā)育[1]。目前尚無特異性標(biāo)志物預(yù)測POI的發(fā)生,也無有效治療措施改善卵巢功能,是導(dǎo)致女性不孕的重要原因[1-2]。POI病因不清楚,其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,迄今為止尚不明確。文獻(xiàn)顯示,白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等炎癥因子所介導(dǎo)的生理性炎癥反應(yīng)參與卵泡發(fā)育、成熟及排卵過程,炎癥因子異常表達(dá)引發(fā)病理性炎癥反應(yīng),可導(dǎo)致影響卵泡質(zhì)量和排卵障礙及不孕等事件的發(fā)生[3]。卵巢中卵泡的正常發(fā)育、成熟及排出是女性孕育的重要條件,從始基卵泡發(fā)育至排卵前卵泡的過程中大量相關(guān)炎癥因子活躍存在,但是任何影響卵母細(xì)胞質(zhì)量及卵泡發(fā)育、成熟及排出過程的因素,均可能引起卵泡質(zhì)量、排卵障礙進(jìn)而導(dǎo)致女性不孕。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),20.0%～40.0%的不孕女性存在排卵障礙和卵泡發(fā)育不良,均與慢性炎癥有關(guān)[4],慢性炎癥反應(yīng)引起的卵泡發(fā)育不良和排卵障礙性等常見于POI、多囊卵巢綜合征(PCOS)等疾病,長期的慢性炎癥還可引起炎癥性衰老[5-6],嚴(yán)重影響患者生育力。

微小RNA(miRNA)是一類新的非編碼RNA,它通過與靶mRNA特異性結(jié)合,降解靶向mRNA或抑制其翻譯過程,從而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展,是重要的基因調(diào)控分子。既往研究表明,miRNAs在卵巢和生殖細(xì)胞中均有表達(dá)[7]。miRNA-146是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)對免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用的miRNA,miRNA-146可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路減輕或抑制炎癥反應(yīng)[8]。以往的研究證實(shí)miRNA-146通過調(diào)控Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號通路抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[9]。因此,本研究擬探討miRNA-146促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖和生長的作用,分析其是否對TLR4/NF-κB信號通路、TNF-α和IL-6炎癥因子有調(diào)控作用,為miRNA-146在POI中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性BALB/c小鼠(8周;體質(zhì)量18～22 g)40只,購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。小鼠在溫度為(22±2)℃、濕度為(50±5)%條件下,光照12 h,黑暗12 h,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,然后將其隨機(jī)分為POI組和對照組,每組20只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號:SYSU-IACUC-020-B1236)。

1.2方法

1.2.1小鼠POI模型的建立 參考文獻(xiàn)[10]通過注射透明帶3肽(pZP3)建立POI小鼠模型,模型建立由中山大學(xué)動(dòng)物室進(jìn)行并提供POI模型鼠。

1.2.2miRNA-146水平檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miRNA-146水平,采用Trizol法提取血清中總RNA,采用Roche LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),內(nèi)參基因U6,嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。miRNA-146、內(nèi)參U6引物和探針由廣州市銳博生物有限公司提供。 miRNA-146a正向引物:5′-CACACAACGTCTCCGCTAT-3′,反向引物:5′-GTGCGATCCAGTCGCG-3′;U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6反向引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL,正向引物 0.4 μL,反向引物 0.4 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,DNA模板2.0 μL,去離子水6.8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 s,循環(huán)1次;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.3小鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 每只小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素8～10 U,48 h后,頸椎脫臼處死,無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢,用緩沖液PBS清洗3次,在體視顯微鏡下去除其周圍脂肪和被膜,用1 mL注射器針頭刺破卵泡使顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞釋放出來,加入1 g/L透明質(zhì)酸酶消化使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離,用孔徑為0.074 mm篩網(wǎng)過濾,1 000 r/min離心5 min。棄上清液,用PBS(-)清洗3次,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液(D/F12培養(yǎng)基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+0.5μg/mL兩性霉素2B+體積分?jǐn)?shù)10%FBS)重懸。倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果表明,剛接種時(shí)顆粒細(xì)胞呈球形,10 h后貼壁生長,培養(yǎng)24 h后,形態(tài)不規(guī)則,呈多角形或梭形。培養(yǎng)5 d時(shí)可鋪滿皿底,形成單層的顆粒細(xì)胞。

1.2.4雙側(cè)卵巢相對質(zhì)量測定及組織形態(tài)學(xué)觀察 常規(guī)無菌方法留取卵巢,用冰冷生理鹽水清潔,濾紙干燥,然后稱重,計(jì)算小鼠卵巢相對質(zhì)量[卵巢質(zhì)量(mg)÷體質(zhì)量(g)]。

卵巢稱重后用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,將蠟塊切成4 μm厚的薄片,脫蠟,蘇木精-伊紅染色。每只切片至少選3個(gè)不同區(qū)域,高倍鏡(×200)下觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)。

1.2.5卵巢顆粒細(xì)胞生長的活力測定 采用MTT比色法測定顆粒細(xì)胞生長的活力。miRNA-146轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞接種于密度為1×103個(gè)細(xì)胞/孔的6孔板中,用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗2次后,10 μL MTT溶液稀釋為5 mg/mL,加到每一孔中。將培養(yǎng)皿在37 ℃條件下培養(yǎng)10 min,然后添加150 μL的二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(A)。

1.2.6卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡測定 (1)顆粒細(xì)胞增殖:采用細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)評價(jià)顆粒細(xì)胞的增殖能力。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞,離心后計(jì)數(shù),取需要的細(xì)胞量(200～500個(gè)/孔)重懸于對應(yīng)的培養(yǎng)基,接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿里。于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3周,在顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆的情況。(2)顆粒細(xì)胞凋亡:使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京Biosea生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行顆粒細(xì)胞凋亡檢測,鑒定和定量顆粒凋亡細(xì)胞。將miRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種在密度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔的6孔板中,用冷磷酸鹽緩沖鹽水洗滌處理細(xì)胞2次,并將其重新懸浮在含有10 μL膜聯(lián)蛋白V和5 μL PI的200 μL結(jié)合緩沖液中。將貼壁細(xì)胞和漂浮細(xì)胞結(jié)合,按照說明書進(jìn)行操作,使用流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特)測量細(xì)胞百分比,以區(qū)分凋亡細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白V陽性和PI陰性)和壞死細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白V陰性和PI陽性)。

1.2.7miRNA-146轉(zhuǎn)染 VSMC消化離心后以合適密度接種到培養(yǎng)板,24 h后細(xì)胞融合到60%～70%時(shí)按照Lipofec-tamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作,分成miRNA-146抑制劑組、miRNA-146模擬物組及對照組,分別轉(zhuǎn)染miRNA-146抑制劑(50 mmol/L)、miRNA-146模擬物(50 mmol/L),對照組加入同等劑量Lipofec-tamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及PBS,5 h后換成完全培養(yǎng)基,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。通過克隆實(shí)驗(yàn)檢測miR-146模擬物、抑制物轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞增殖情況,克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法及其他實(shí)驗(yàn)方法 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠卵巢組織中TLR4和NF-κB蛋白的水平,TLR4和NF-κB抗體購自Abcam公司。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(廣州市銳博生物有限公司)檢測血清IL-6和TNF-α的水平。采用Cobas 601化學(xué)發(fā)光儀檢測血清FSH和雌激素(E2)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組小鼠性激素水平比較 POI組的FSH水平高于對照組,而E2水平低于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠性激素水平比較

2.2兩組小鼠血清miRNA-146、IL-6、TNF-α水平比較 POI組血清miRNA-146水平低于對照組,IL-6、TNF-α水平高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠miRNA-146、IL-6、TNF-α水平比較

2.3miRNA-146對卵巢顆粒細(xì)胞增殖、活力、生長、凋亡的影響 miRNA-146模擬物增加顆粒細(xì)胞的克隆形成,miRNA-146抑制劑抑制顆粒細(xì)胞的克隆形成,見圖1A。miRNA-146模擬物在顆粒細(xì)胞中呈高水平表達(dá),見圖1B;在不同水平(5,10,20,40 μg/mL)miRNA-146的作用下,顆粒細(xì)胞生長活力均增強(qiáng),且呈濃度依賴趨勢,見圖1C。miRNA-146轉(zhuǎn)染后,miRNA-146模擬物組細(xì)胞凋亡率低于對照組,miRNA-146抑制劑組細(xì)胞凋亡率高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1D。

注:A為miR-146模擬物、抑制劑轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞增殖情況;B為miR-146模擬物、抑制物轉(zhuǎn)染后miRNA-146表達(dá)水平;C為不同濃度miRNA-146對增加顆粒細(xì)胞生長活性的影響;D為各組顆粒細(xì)胞凋亡的情況。

2.4兩組小鼠卵巢組織中TLR4、NF-κB蛋白的水平比較 miRNA-146模擬物組的TLR4、NF-κB水平低于對照組,而miRNA-146抑制劑組的TLR4、NF-κB水平高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,POI小鼠的miRNA-146水平與TLR4水平和NF-κB水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.725、-0.681,P<0.05)。

2.6兩組小鼠POI模型的卵巢形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化 POI組小鼠的卵巢最大徑及質(zhì)量明顯小于對照組(P<0.01)。見表3。POI組小鼠卵巢組織中可見早期卵泡閉鎖及退化的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞,伴有大量間質(zhì)和纖維組織增生,而對照組鼠卵巢組織學(xué)可見大量的成熟卵泡。見圖2。

注:A為對照組;B為POI組。

表3 兩組卵巢最大徑及質(zhì)量比較

3 討 論

POI可能與炎癥反應(yīng)有顯著相關(guān)性,而卵巢早衰(POF)為POI發(fā)展的終末階段。慢性低度炎癥為POI發(fā)生的重要原因之一,UC-MSC移植可通過旁分泌機(jī)制發(fā)揮抗凋亡和抗炎癥反應(yīng)作用,抑制IL-6 和IL-1β水平,減輕化療誘導(dǎo)的POI或POF,改善卵巢功能,提示炎癥反應(yīng)的降低可能與POF的改善有相關(guān)性,同時(shí)也有研究通過臨床患者試驗(yàn)證實(shí)炎癥因子可能作為POI或POF患者的獨(dú)立生物標(biāo)志物[11]。根據(jù)當(dāng)前的研究結(jié)果筆者推測POF與炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示POI組小鼠的炎癥因子TNF-α和IL-6水平高于對照組,主要作用機(jī)制可能是miRNA-146負(fù)性調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路,誘導(dǎo)TNF-α和IL-6高水平表達(dá),導(dǎo)致卵巢發(fā)生炎癥反應(yīng)、缺氧,影響卵泡質(zhì)量,最終造成不孕癥的發(fā)生。POI是一個(gè)逐階遞進(jìn)的過程,在POI的早期,如果調(diào)控miRNA-146、TLR4/NF-κB、TNF-α和IL-6水平,可以維持性激素水平在正常范圍,不會(huì)影響生育能力,提示miRNA-146、TLR4、NF-κB水平與POI模型病情程度密切相關(guān),可發(fā)揮臨床預(yù)警作用。本研究結(jié)果顯示,POI組血清miRNA-146、E2水平低于對照組,而FSH水平高于對照組,可能是miRNA-146水平下調(diào)促進(jìn)患者雌激素水平的異常,從而影響卵巢功能和卵泡質(zhì)量[12]。一項(xiàng)在模型體內(nèi)注射miRNA-146模擬物的研究顯示,E2水平顯著上調(diào),FSH、LPS水平顯著下調(diào)[13]。因此,miRNA-146有望作為評估卵泡質(zhì)量的指標(biāo)之一。

miRNAs與特異性的靶基因結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平引起靶mRNA剪切和翻譯的抑制,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生等[14],miRNA-146家族成員被稱為炎癥誘導(dǎo)型miRNAs,參與Toll樣受體(TLRs)信號的負(fù)反饋調(diào)節(jié),誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),參與動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)[15]。TLRs是一種模式識別受體,參與慢性炎癥、氧化應(yīng)激、腫瘤微環(huán)境的形成。TLRs識別相應(yīng)配體后,通過活化一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子激活NF-κB通路,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷等免疫反應(yīng)[8-9]。TLRs存在于卵巢和生殖道中,它們在卵巢和卵泡排卵活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。NF-κB、有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)是炎癥因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要通路[16-17],即使作用途徑不同,但其中阻礙卵泡發(fā)育及排卵過程的相關(guān)炎癥因子所起的作用是一樣的。本研究結(jié)果顯示,miRNA-146模擬物能夠提高顆粒細(xì)胞增殖和生長的活力,并減少顆粒細(xì)胞的凋亡率,而且miRNA-146水平與顆粒細(xì)胞生長呈依賴關(guān)系,提示miRNA-146具有促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和生長的作用。其機(jī)制可能是miRNA-146通過調(diào)控免疫反應(yīng)影響HPO軸的神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng),誘導(dǎo)雌激素釋放,從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和生長。有研究表明,炎癥因子IL-6、免疫細(xì)胞與NF-κB等信號通路具有相互調(diào)控作用,通過影響垂體促性腺激素FSH受體、LH受體表達(dá)及卵巢中雌、孕激素的水平以促進(jìn)卵泡發(fā)育,而垂體FSH及LH的合成與分泌受到下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)的調(diào)節(jié),誘導(dǎo)雌激素、孕激素釋放,促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟,但其確切機(jī)制尚未明確[16-18]。

本研究結(jié)果顯示,POI組miRNA-146水平低于對照組,miRNA-146模擬物組的TLR4、NF-κB水平低于對照組,而miRNA-146抑制劑組的TLR4、NF-κB表達(dá)水平高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可能是上調(diào)miRNA-146通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路影響TNF-α和IL-6的表達(dá),提示炎癥因子TNF-α和IL-6參與卵巢的炎癥反應(yīng),從而影響卵巢功能的障礙,是一種炎癥性的卵巢功能衰竭。本研究結(jié)果顯示,miRNA-146抑制物誘導(dǎo)小鼠TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著升高,而miR-146模擬物誘導(dǎo)TLR4和NF-κB表達(dá)水平顯著降低,提示TLR4可能是miRNA-146的靶基因,并且通過TLR4/NF-κB信號通路對POI發(fā)揮調(diào)控作用,其機(jī)制可能與下游的炎癥因子釋放有關(guān)。

本研究通過HE染色證實(shí)了在POI過程中,出現(xiàn)了卵巢體積和質(zhì)量均減少,原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡等顯著降低,閉鎖卵泡增加。miRNA-146過表達(dá)通過抑制Dab2ip/Ask1/p38MAPK通路和γH2A.X磷酸化減輕小鼠參與卵細(xì)胞的增殖與凋亡過程[19],同時(shí)有研究表明POF與顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡早期閉鎖密切相關(guān),卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡是卵泡早期閉鎖的主要原因,這是一個(gè)不可逆的逐步損耗過程,卵泡細(xì)胞缺乏再生能力,導(dǎo)致女性生殖能力的衰退,在早期閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞中Bax 促凋亡蛋白大量表達(dá),而在正?；蛲耆]鎖卵泡中幾乎不表達(dá);Bcl-2 基因缺失的小鼠模型中,卵泡數(shù)量下降,高表達(dá)的Bcl-2 基因抑制小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡早期閉鎖,表明了在卵泡發(fā)育過程中Bcl-2 和Bax基因分別參與卵細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控[20],提示miRNA-146是卵巢正常功能的重要調(diào)控分子,發(fā)揮抑制POI的作用。

綜上所述,本研究證明了POI與炎癥反應(yīng)有關(guān),是一種由miRNA調(diào)控的卵巢慢性炎癥性功能衰退,即miRNA-146可能過TLR4/NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖和生長,對POI的卵巢功能發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過相關(guān)性分析確定miRNA-146與TLR4/NF-κB信號通路負(fù)相關(guān),為miRNA-146在臨床的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。