CDCA5、miR-146a、S100A7水平與過敏性鼻炎嚴(yán)重程度的關(guān)系及其臨床價值*

石 昊,薛 媛,安 麗,閆 娟,拓明祥,李二樂

陜西省延安市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西延安 716000

過敏性鼻炎(AR)又稱變應(yīng)性鼻炎,是一種鼻黏膜非感染性炎癥疾病,全球發(fā)病率較高[1-2]。目前AR診斷主要依據(jù)患者臨床癥狀、體征及過敏原檢測等方法,但用于AR早期診斷及判斷預(yù)后的客觀指標(biāo)很少。因此探討AR的發(fā)病機制,找尋能夠有效評估AR病情的敏感指標(biāo),對臨床診治具有重要意義。細胞分裂周期相關(guān)蛋白5(CDCA5)是一種新的癌基因,近年來,有研究發(fā)現(xiàn)CDCA5水平升高與哮喘的發(fā)生及疾病嚴(yán)重程度關(guān)系密切[3-4]。AR在發(fā)病機制、病理改變方面很大程度上與哮喘相似,但CDCA5與AR關(guān)系的相關(guān)報道有限,探討CDCA5與AR的關(guān)系是AR研究的一個新分子靶標(biāo)。微小RNA-146a(miR-146a)是可調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)的miRNAs,可參與炎癥調(diào)節(jié),在炎癥反應(yīng)、固有免疫及癌癥進展等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn),miR-146a水平異常與AR病理特征及病情程度顯著相關(guān),是診斷AR有效的分子標(biāo)志物[6]。S100鈣結(jié)合蛋白A7(S100A7)是近年基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在AR鼻腔分泌物中發(fā)現(xiàn)的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)志物,有研究報道S100A7能夠特異性識別Ca2+結(jié)合位點,趨化CD4+T淋巴細胞參與細胞炎癥反應(yīng)與細胞免疫功能調(diào)控,與多種炎癥疾病及心血管疾病的發(fā)生有關(guān)[7-8],為AR的診治提供了新的思路。但目前有關(guān)S100A7與過敏性疾病關(guān)系的研究報道較少,故S100A7參與調(diào)控AR發(fā)生的作用機制需進一步研究分析。因此,本研究通過檢測AR患者外周血中CDCA5、miR-146a及鼻腔分泌物中S100A7水平,分析了這3項指標(biāo)與AR病情嚴(yán)重程度的關(guān)系及其對AR的臨床診斷價值,以期為AR的臨床診治提供更多分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2019年7月至2022年3月本院收治的AR患者83例作為觀察組,其中男46例、女37例,平均年齡(35.5±5.7)歲,平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(23.2±2.3)kg/m2。另選取同期在本院體檢且無過敏性疾病和呼吸道相關(guān)疾病的健康人50例作為對照組,其中男31例、女19例,平均年齡(36.3±6.2)歲,BMI為(22.7±2.5)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡>18歲;AR診斷符合《中國變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2022年,修訂版)》[9]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn);近1個月內(nèi)未使用過抗過敏、抗組胺及免疫治療等藥物;未合并肝腎功能障礙、免疫系統(tǒng)性疾病及惡性腫瘤等;臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):其他類型過敏性疾病;近期患有急慢性感染性疾病;伴有鼻竇炎、鼻息肉等其他鼻部疾病;合并HIV感染、結(jié)核病等。兩組患者性別、年齡、BMI等一般基線資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有受試者對本研究知情,并簽署知情同意書。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1AR病情評估 根據(jù)2015年《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》[10]的相關(guān)要求,采用四分法對鼻塞、鼻癢、噴嚏、流清涕4個癥狀進行評估:0分為無癥狀;1分為癥狀較輕,易于忍受;2分為癥狀明顯,但可以忍受;3分為癥狀無法忍受,影響日常生活/睡眠。各項評分之和即為總分,總分0～12分,總分≤6分為輕度,>6分為中重度。

1.2.2外周血CDCA5、miR-146a水平檢測 采集兩組受試者外周靜脈血各4 mL,均分為2份,肝素抗凝,保存待測,采用實時熒光定量PCR進行檢測。(1)CDCA5水平:取待測血樣1份,加入細胞分離液,2 000 r/min離心20 min,得到淋巴細胞。采用Trizol法提取細胞總DNA,檢測RNA水平,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板按照CDCA5檢測試劑盒說明書配置RNA反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:95 ℃ 60 s,65 ℃ 30 s,75 ℃ 15 s,循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計算CDCA5水平。(2)miR-146a水平:取待測血樣1份,通過密度梯度法提取單個核細胞,方法同上提取細胞懸液總DNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照miR-146a檢測試劑盒說明書配置RNA反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:95 ℃ 60 s,95 ℃ 45 s,75 ℃ 30 s;循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法計算miR-146a水平。CDCA5、miR-146a引物均由上?；倒驹O(shè)計合成。

1.2.3鼻腔分泌物中S100A7水平檢測 用無菌槍狀鑷夾取無菌干燥脫脂棉2.5 cm×1.0 cm×0.5 cm,置入受試者一側(cè)鼻腔,貼放于下鼻甲處,放置10 min后取出,收集患者鼻腔分泌物于低溫保存待測。取鼻腔分泌物標(biāo)本解凍,室溫3 000 r/min離心10 min,取上清液,嚴(yán)格按照試劑盒操作說明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測鼻腔分泌物中S100A7水平。

1.3觀察指標(biāo) 觀察兩組外周血CDCA5、miR-146a及鼻腔分泌物中S100A7水平,并分析其與AR病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性及其對AR的診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1兩組CDCA5、miR-146a、S100A7水平比較 觀察組CDCA5水平高于對照組,miR-146a及S100A7表達水平低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組CDCA5、miR-146a、S100A7水平比較

2.2不同程度AR患者CDCA5、miR-146a、S100A7水平比較 入組AR患者病情癥狀得分為2～11分,平均(6.53±1.14)分,其中輕度組34例、中重度組49例。中重度組AR患者CDCA5水平高于輕度組,而miR-146a、S100A7水平低于輕度組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同程度AR患者CDCA5、miR-146a、S100A7水平比較

2.3CDCA5、miR-146a、S100A7水平與AR病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CDCA5水平與AR病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.637,P<0.05),miR-146a、S100A7水平與AR病情嚴(yán)重程度呈負相關(guān)(r=-0.596、-0.605,P<0.05)。

2.4CDCA5、miR-146a、S100A7水平對AR的診斷效能 ROC曲線結(jié)果顯示,CDCA5、miR-146a、S100A7單獨診斷AR的曲線下面積(AUC)分別為0.778、0.784、0.806,而3項指標(biāo)聯(lián)合診斷AR的AUC為0.897、靈敏度為87.9%、特異度為83.6%。見表3、圖1。

圖1 CDCA5、miR-146a、S100A7單獨及聯(lián)合檢測診斷AR的ROC曲線

表3 CDCA5、miR-146a、S100A7單獨及聯(lián)合檢測對AR的診斷效能

3 討 論

AR是常見的上呼吸道慢性疾病,以鼻黏膜慢性炎癥為主要特征,目前其發(fā)病機制尚不明確,但有研究顯示其與鼻黏膜產(chǎn)生的過度免疫反應(yīng)激活了炎癥因子和免疫球蛋白E(IgE)釋放有關(guān)[2]。AR發(fā)病的病理基礎(chǔ)是免疫反應(yīng),免疫失衡引起的炎癥因子大量釋放會加重AR病情[2]。目前,AR臨床治療方法較多,但治療整體效果不理想,部分患者病情控制不佳。因此積極探討AR發(fā)病機制及找尋有效的臨床分子標(biāo)志物對評估AR病情及指導(dǎo)臨床治療意義重大。

CDCAs基因家族是調(diào)控細胞分裂周期過程的關(guān)鍵基因,其家族基因異常會造成細胞生長失控,通過促進腫瘤細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞周期、減少細胞凋亡,介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[3,11]。CDCA5是CDCA基因家族成員,研究發(fā)現(xiàn),CDCA5水平在人類多種腫瘤中上調(diào),與腫瘤惡性進展及患者預(yù)后相關(guān)[12-13]。有研究顯示,AR進展為過敏性哮喘的發(fā)生率達20%～30%,而哮喘患者伴AR的發(fā)生率高達60%～78%[14]。王麒淇等[4]、黃輝等[15]研究發(fā)現(xiàn),哮喘患者及AR伴哮喘綜合征患者外周血中CDCA5水平明顯升高,但CDCA5水平與AR的關(guān)系研究報道較少見。鑒于AR和哮喘在病因及病理改變等方面相似性較高,主要區(qū)別在于癥狀體征和發(fā)病部位不同,因此本研究分析了CDCA5在AR中的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR患者外周血中CDCA5水平升高,且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P<0.05),提示CDCA5可能參與AR的發(fā)病,但其調(diào)控AR發(fā)生的作用機制需進一步研究。

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA,大量研究表明,miRNAs在許多生理過程中起著關(guān)鍵作用,參與調(diào)節(jié)多種疾病的發(fā)病機制,如腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥及其他類型疾病等[5,16]。趙磊等[17]發(fā)現(xiàn),miRNAs水平異?？蓪?dǎo)致免疫紊亂,激發(fā)炎癥反應(yīng),為過敏性疾病的發(fā)病研究和治療提供了新思路。相關(guān)AR小鼠模型中,miR-146a能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β產(chǎn)生,誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞向Treg細胞分化[18]。miR-146a能夠降低AR小鼠體內(nèi)IgE及炎癥細胞因子水平,發(fā)揮抗炎作用[19]。AR患者中miR-146a水平降低,并通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5b水平發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)反應(yīng)功能,參與Treg細胞分化及功能維持,參與AR的發(fā)生、發(fā)展[20]。而本研究發(fā)現(xiàn),miR-146a水平與AR病情嚴(yán)重程度呈負相關(guān)(P<0.05),與王忠勛等[21]研究結(jié)果一致。

有研究表明,S100蛋白與腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換及腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程相關(guān),而當(dāng)其分泌到細胞外時,通過組織修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)等途徑,可影響局部炎癥細胞及腫瘤細胞的活動,參與炎癥反應(yīng)[8,22]。S100A7是S100蛋白家族的一員,正常情況下當(dāng)鼻腔受微生物病原菌刺激時,鼻腔上皮細胞會產(chǎn)生S100A7蛋白,吸引免疫功能細胞發(fā)揮抗菌防御作用。有研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比,AR患者鼻腔灌洗液中S100A7水平明顯降低,考慮與機體抗菌防御功能受損有關(guān)[23]。過敏性疾病的發(fā)病可能與S100A7水平降低使細胞免疫能力降低,從而引起感染擴散或微生物定植有關(guān)[24]。目前,S100A7水平與過敏性疾病的發(fā)病關(guān)系研究尚無明確定論,但其在過敏性疾病中的表達特性為AR的臨床診治提供了新的研究靶點。本研究發(fā)現(xiàn),中重度組AR患者鼻腔分泌物中S100A7水平明顯低于輕度組(P<0.05),與文獻[23-24]研究結(jié)果一致,本研究還發(fā)現(xiàn),S100A7與AR病情嚴(yán)重程度呈負相關(guān)(r=-0.605,P<0.05)。ROC曲線結(jié)果顯示,CACD5、miRNA-146a、S100A7診斷AR的AUC分別為0.778、0.784、0.806,而3項指標(biāo)聯(lián)合診斷的AUC為0.897,明顯高于各指標(biāo)單獨檢測。

綜上所述,AR患者外周血中CDCA5、miR-146a水平及鼻腔分泌物中S100A7水平與AR病情密切相關(guān),且3項指標(biāo)聯(lián)合檢測能提高AR的臨床診斷效能,對評估患者病情及指導(dǎo)臨床診治具有重要意義。