MALDI-TOF MS在NTM臨床分離株快速鑒定中的應(yīng)用研究*

黃琨波,陳桂春,林玉玲,陳清清,李 科,張建明△

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院:1.檢驗科;2.心內(nèi)科,福建泉州 362000

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)病是指人體感染了NTM引起相關(guān)組織或臟器的病變。NTM肺病與肺結(jié)核有著類似的臨床癥狀和影像特征,二者無法通過痰標(biāo)本抗酸染色進(jìn)行區(qū)分,常造成誤診[1]。目前可以通過膠體金和熒光PCR檢測等手段初步排除結(jié)核菌的感染,但仍無法明確診斷NTM病,更無法區(qū)分至亞種,誤診率也較高。滯后的鑒定技術(shù)嚴(yán)重阻礙了NTM病的診治[2]。由于診斷困難、高度耐藥且容易復(fù)發(fā),近年來我國NTM病的發(fā)病率明顯上升,對人類健康構(gòu)成極大的威脅[3]。

NTM傳統(tǒng)培養(yǎng)方法操作繁雜,培養(yǎng)周期長,可重復(fù)性差,加之分枝桿菌大多屬于慢生長菌,培養(yǎng)條件較苛刻,不易生長,已無法滿足臨床實際工作的需求[3]。近年來,基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用日漸廣泛。MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)技術(shù)相比,具有快速、準(zhǔn)確、靈敏及經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點,盡管不能完全替代傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,但也彌補了傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜、費時等不足[4-5]。MALDI-TOF MS技術(shù)在國內(nèi)用于NTM的鑒別較少見,因此臨床參考數(shù)據(jù)較為有限[6]。本研究擬通過優(yōu)化質(zhì)譜上機前處理條件,建立適用于臨床的NTM MALDI-TOF MS鑒定方法?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018-2020年泉州某三甲醫(yī)院微生物實驗室的部分臨床疑似NTM感染(涂片抗酸染色陽性,分離培養(yǎng)并經(jīng)結(jié)核DNA檢測為陰性,初步鑒為NTM)患者的痰液、肺泡灌洗液、胸部穿刺液和腦脊液等樣本。采用改良羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)進(jìn)行分離培養(yǎng)。NTM參考株來源于美國菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑 主要儀器:全自動快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(Bruker Daltonik GmbH);基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司)。 主要試劑:基質(zhì)液;甲酸水溶液;乙腈水溶液;無水乙醇;固體培養(yǎng)基;哥倫比亞血瓊脂平板;PCR 試劑盒、Ex Taq DNA 聚合酶及標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA(Marker)購自TaKaRa 公司。

1.3方法

1.3.1傳統(tǒng)(常規(guī))質(zhì)譜法

1.3.1.1臨床標(biāo)本前處理 (1)痰標(biāo)本:首先將痰樣本轉(zhuǎn)移至螺口管中,視樣本具體性狀,在生物安全柜內(nèi)加入1～2倍體積的N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)處理液。旋緊蓋子,在渦旋振蕩器上渦旋振蕩充分混勻,靜置15 min。小心打開蓋子,加入適量磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至總體積約40 mL;3 000×g離心20 min,棄上清液用l mL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀,并將重懸液接種至新的培養(yǎng)基上。(2)支氣管灌洗液、腦脊液等無菌體液:直接將樣本離心后取沉淀接種進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.1.2NTM菌株篩選 將經(jīng)Bactec MGT960系統(tǒng)培養(yǎng)陽性的分枝桿菌菌液接種于羅氏培養(yǎng)基上,37 ℃持續(xù)培養(yǎng)4周,記錄菌落的生長狀態(tài)。其中,經(jīng)結(jié)核DNA檢測呈陰性的初步判定為NTM。

1.3.1.3菌株DNA提取 采用煮沸裂解法進(jìn)行菌株DNA的提取。

1.3.2MALDI-TOF MS改良前處理(甲酸提取法)

1.3.2.1標(biāo)本處理 (1)在1.5 mL的離心管中先加入300 μL去離子水;轉(zhuǎn)移分枝桿菌樣本到上述離心管中(避免取到培養(yǎng)基,盡可能轉(zhuǎn)移1～3份10 μL接種環(huán)的菌量。取菌量更直觀的概念:離心管中2 μL水的量代表一小份沉淀,5 μL的量代表合適大小的沉淀);煮沸30 min以滅活分枝桿菌(可使用95 ℃的金屬浴或水浴)。(2)使用移液槍反復(fù)吹打混勻,然后渦旋振蕩至少1 min,在離心管中形成懸液。(3)添加900 μL的無水乙醇溶液,然后懸液振蕩至少1 min。(4)離心菌體細(xì)胞(離心2 min,13 000 r/min)并吸凈上清液。(5)將第4步重復(fù)一次,使用移液槍小心吸取剩下的乙醇,以完全除去乙醇溶液。(6)將10 μL 70%甲酸水溶液加入沉淀物中,通過移液槍反復(fù)吹打,然后進(jìn)行渦旋充分混勻,(7)加入10 μL乙腈,通過移液槍反復(fù)吹打混合懸液。(8)離心細(xì)菌提取物(離心2 min,13 000 r/min )。

1.3.2.2MALDI-TOF MS測定 參考質(zhì)譜儀的操作說明進(jìn)行。

1.3.316S rRNA測序

1.3.3.1PCR擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[7]合成16S rRNA基因的引物,引物均由上海生工生物有限公司合成。PCR體系50 μL,2xTaq MasterMix 25 μL,DNA模板5 μL,引物(10 pmol/L)各1 μL,ddH2O 18 μL。陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)株,陰性對照組為ddH2O。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72℃延伸1 min,第2～4步30個循環(huán),最后72 ℃充分延伸10 min。將配好的體系放置到PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.3.2PCR序列分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測驗證后,取20 pmol/L擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化及測序。將基因序列分析結(jié)果與GenBank中分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對,相似度最高的菌種為標(biāo)本所屬菌種。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本收集基本情況 本研究共收集臨床微生物實驗室初步鑒定為NTM的標(biāo)本50例,以呼吸內(nèi)科、感染科、ICU和發(fā)熱門診來源的標(biāo)本較為常見。將已有標(biāo)本轉(zhuǎn)種于固體培養(yǎng)基上,以獲取單個菌落用于后續(xù)實驗分析。

2.2傳統(tǒng)(常規(guī))質(zhì)譜方法與甲酸提取法的鑒定結(jié)果比較 用傳統(tǒng)(常規(guī))質(zhì)譜方法共鑒定出4例菌株,檢出率為8.0%(4/50),包括膿腫分枝桿菌3例和鳥分枝桿菌1例。采用甲酸提取法共鑒定出24株菌株,檢出率為48.0%(24/50),鑒定結(jié)果見表1。在26株未能鑒定出結(jié)果的菌株中,有6株的蛋白指紋圖譜具有良好波譜譜峰。兩種方法檢出率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 甲酸提取法鑒定結(jié)果

2.316s rRNA基因測序結(jié)果

2.3.116s rRNA基因擴(kuò)增 將甲酸提取法處理后有鑒定結(jié)果的菌株,采用加熱裂解法提取核酸,以16S F、16S R作為引物進(jìn)行16 s rRNA基因擴(kuò)增,分2批次擴(kuò)增,第1次擴(kuò)增10株,第2次擴(kuò)增14株,共擴(kuò)增了24株菌株,凝膠電泳結(jié)果表明全部有明亮的目的基因擴(kuò)增條帶出來,選用Mark分子量大小約為2.0 kb,目的核酸片段分子量約為1.5 kb,電泳條帶1.0～2.0 kb,符合試驗預(yù)期。部分凝膠電泳條帶見圖1。

注:1～9為菌株擴(kuò)增結(jié)果(約1 500 bp);10為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;11為陰性對照。

2.3.2測序結(jié)果分析 將甲酸提取法處理后有鑒定結(jié)果的菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物技術(shù)公司進(jìn)行測序,通過GenBank進(jìn)行Blast比對,結(jié)果顯示24株均為NTM,結(jié)果與質(zhì)譜鑒定完全一致,符合率為100.0%,其中胞內(nèi)分枝桿菌6株,馬賽分枝桿菌3株,膿腫分枝桿菌4株,哥倫比亞分枝桿菌1株,鳥分枝桿菌3株,福特分枝桿菌1株,堪薩斯分枝桿菌2株,擬桿菌分枝桿菌1株,隱藏分枝桿菌1株,產(chǎn)黏液分枝桿菌1株,猿分枝桿菌1株。

3 討 論

NTM毒性弱于結(jié)核分枝桿菌,大多是機會性致病菌,感染范圍廣,但臨床普遍耐藥,治療方案存在較大差異。近年來,NTM感染率和發(fā)病率逐漸增加,其潛在危害越來越受到重視[3]。全球性的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中,我國的情況一直不容樂觀。

臨床患者中發(fā)生聯(lián)合耐藥的概率在升高,且具有廣泛的耐藥率[8-10]。因此臨床實驗室中快速、準(zhǔn)確地鑒定NTM就顯得極為迫切。傳統(tǒng)生化方法可以用于鑒別MTBC和NTM,卻無法避免操作煩瑣、實驗周期長的缺陷,生化培養(yǎng)以細(xì)菌生長特點和生化反應(yīng)為依據(jù)作出判斷,本身存在一定的局限性。近年來,分子診斷技術(shù)已經(jīng)得到全面發(fā)展,PCR、PCR直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)已成為較常用的鑒定結(jié)核分枝桿菌的方法[11]。

有文獻(xiàn)報道PCR-核酸探針技術(shù),能有效鑒別23種臨床常見分枝桿菌;PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析技術(shù)、熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)等,能夠?qū)μ囟ǖ囊环N或多種NTM進(jìn)行快速鑒定,極大地豐富了臨床分枝桿菌鑒定實驗方法;基因芯片技術(shù)即cDNA微陣列芯片,能夠?qū)εR床常見20種NTM進(jìn)行快速鑒定[12]。這些分子生物學(xué)技術(shù)雖可以快速診斷NTM,但局限于特定的一些分枝桿菌,而且費用高,操作難度較大,對實驗室檢驗人員要求較高,測序引物又因方案不同而變動,引物擴(kuò)增長度沒有達(dá)到一定要求,也很難鑒定出相應(yīng)菌種,難以做到統(tǒng)一操作,故此,探索新的更為簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定方法對臨床工作意義重大。

質(zhì)譜方法是近年快速發(fā)展的一種生物質(zhì)譜技術(shù),具有極大的潛在價值[13-15]。MALDI-TOF MS技術(shù)的基本原理是獲取細(xì)菌蛋白質(zhì),形成質(zhì)量圖譜。國內(nèi)已有MALDI-TOF MS技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌分型、耐藥分析的相關(guān)文獻(xiàn)報道,充分顯示了其巨大的應(yīng)用價值。但國內(nèi)目前MALDI-TOF MS在分枝桿菌鑒定的應(yīng)用中還未達(dá)到預(yù)期效果,使NTM在質(zhì)譜鑒定方面遠(yuǎn)落后于細(xì)菌。本研究中依照布魯克公司的操作標(biāo)準(zhǔn),檢出率僅為8.0%(4/50),而采用改良前處理方法(甲酸提取法)后檢出率為48.0%(24/50),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。NTM細(xì)胞壁中蠟質(zhì)成分占60%以上,可抵抗機體免疫力和藥物的攻擊,同時能耐受攪拌,不易破碎,因此,傳統(tǒng)方法不易使其細(xì)胞壁破碎釋放出蛋白質(zhì)形成圖譜[16-17]。而采用改良的甲酸提取法后,甲酸能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞壁破裂,使得細(xì)菌緩慢釋放出細(xì)胞質(zhì)中的蛋白,從而提升質(zhì)譜的鑒定效率[18-19]。本研究表明改良前處理方法后的質(zhì)譜技術(shù)用于NTM 鑒定,與傳統(tǒng)的質(zhì)譜鑒定方法比較檢出率更高;且與傳統(tǒng)微生物臨床鑒定相比同樣具有質(zhì)譜本身的經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點。因此,用于鑒別NTM與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,一定程度上能夠滿足臨床工作中NTM快速鑒定的需求,對于臨床NTM菌種鑒定有一定的應(yīng)用價值。

標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的菌株庫存容量是影響質(zhì)譜鑒定的一個重要因素[20-21]。本研究中發(fā)現(xiàn),采用甲酸提取法時,在26株未能鑒定出結(jié)果的菌株中,有6例菌株質(zhì)譜鑒定圖譜峰值比較理想,但卻沒有明確結(jié)果,分析原因可能是由于本實驗室數(shù)據(jù)庫不夠全面,沒有對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株,從而導(dǎo)致質(zhì)譜鑒定結(jié)果失敗。另一個影響因素就是乙腈溶液和甲酸溶液的稀釋濃度偏低,對蛋白酸化和提取產(chǎn)生影響。除此之外的一個決定性的實驗因素是細(xì)菌細(xì)胞壁堅實,常規(guī)實驗手段難以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁,導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)獲取困難,甚至蛋白質(zhì)基本沒有提取出來,以致實驗分析失敗。本研究采用了加熱、加酸、加生物酶等方法,以提高蛋白質(zhì)含量,不過效果并不理想,因此需要探索破除細(xì)菌細(xì)胞壁的新方法。

MALDI-TOF MS技術(shù)用于NTM鑒定的臨床價值,仍有待于未來大量樣本的研究分析給予更為客觀和科學(xué)的評價。本課題在研究過程中,收集標(biāo)本相對有限,后續(xù)研究工作將進(jìn)一步繼續(xù)深入開展下去,以期探索出更加準(zhǔn)確、可靠、快速的NTM鑒定技術(shù)。綜上所述,MALDI-TOF MS技術(shù)用于NTM鑒定及分型,具有實際的應(yīng)用價值,可用于臨床實驗室檢驗工作。