基于核酸適配體的納米金比色法快速檢測腸炎沙門氏菌

董蕾，黃利華，江津津，鄭玉璽

（廣州城市職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與美食養(yǎng)生學(xué)院，廣東 廣州 510650）

食源性致病菌是導(dǎo)致食品安全事件頻發(fā)的主要原因之一。在世界范圍內(nèi)，每年感染沙門氏菌（Salmonella spp.）導(dǎo)致死亡或患病而造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超30 億美元[1-2]。沙門氏菌常見的主要有鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌等，是引起全球細(xì)菌性食物中毒的主要食源性致病菌之一，其中腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）由于不分解蛋白質(zhì)，食品基本不會發(fā)生感官變化，十分容易被忽略[3]。

傳統(tǒng)食源性致病菌檢測方法包括平板分離法[4]、分子生物學(xué)方法[5-7]、免疫學(xué)方法[8]等。平板分離法作為食品安全檢驗的金標(biāo)準(zhǔn)，需要依靠增菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等，其檢測周期長、靈敏度不高；同時檢測過程中可能出現(xiàn)非目標(biāo)菌干擾、污染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移等問題，影響檢測結(jié)果，出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題[9]；分子生物學(xué)方法要求技術(shù)條件高、檢測過程中一旦出現(xiàn)環(huán)境污染，則極易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，影響檢測結(jié)果；免疫學(xué)方法前期抗體制備周期長、研發(fā)成本高、抗體穩(wěn)定性較差，且易受檢測環(huán)境影響，很難滿足食品安全快速檢測中對食源性致病菌快速、靈敏、特異的檢測需求[10]。

適配體是一類能夠與蛋白結(jié)合、產(chǎn)生高特異性和親和度的單鏈核酸序列[11]，其通常僅含有15～40 個堿基，分子量為5～25 kDa。其片段短、性質(zhì)穩(wěn)定，因此環(huán)境適應(yīng)性好、易保存、不易降解；同時由于適配體為單鏈寡核苷酸DNA 或RNA，可形成各種所需的空間構(gòu)象（如發(fā)卡結(jié)構(gòu)、G-四聚體等），與食源性致病菌的標(biāo)志性蛋白或致病毒素的特異性結(jié)構(gòu)高特異性結(jié)合，而不與其他類似結(jié)構(gòu)物產(chǎn)生交叉反應(yīng)[12-13]，從而實現(xiàn)高特異性識別和高親和性結(jié)合靶物質(zhì)。且靶物質(zhì)可為生物分子、化學(xué)分子及細(xì)胞等多種物質(zhì)，探針也具有分子量小、無免疫原性、修飾簡單等特點[14-16]，因此被廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)檢測等領(lǐng)域[17]。近年來，研究者利用核酸適配體進(jìn)行沙門氏菌檢驗，如Duan 等[18]篩選鼠傷寒沙門氏菌核酸適配體，將其結(jié)合熒光技術(shù)檢測鼠傷寒沙門氏菌，其檢出限可達(dá)25 CFU/mL；Xu等[19]結(jié)合金納米顆粒變色效應(yīng)檢測沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7，當(dāng)有靶標(biāo)出現(xiàn)時，金納米顆粒由紅色變?yōu)樗{(lán)或紫色，其檢出限為105CFU/mL；Yuan 等[20]利用納米金適配體進(jìn)行鼠傷寒沙門氏菌檢測時，檢出限可達(dá)7 CFU/mL，實現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的可視化檢測，且檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致。

納米金（nano-gold，AuNPs）是金的微小顆粒，其具有優(yōu)異的催化活性和獨特的光學(xué)特性，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性。中等粒徑（10～20 nm）大小的納米金在分散態(tài)下呈紅色，高鹽情況下凝聚成藍(lán)色，而在含有單鏈DNA（ssDNA）條件下，ssDNA 的正電荷堿基自由狀態(tài)暴露，通過靜電吸附在納米金上，使納米金在高鹽溶液中仍保持穩(wěn)定性，納米金溶液仍為紅色[21-22]。通過納米金進(jìn)行檢驗，產(chǎn)生的變色比色反應(yīng)，其靈敏度可達(dá)熒光檢測法的靈敏程度[23-24]。納米金在存在特異性靶標(biāo)的情況下，適配體形成特定三維結(jié)構(gòu)，與靶標(biāo)特異性結(jié)合；而未吸附適配體的納米金則在高鹽溶液中發(fā)生聚集，最終使溶液呈深藍(lán)色。

本文通過配制納米金溶液，結(jié)合已開發(fā)的腸炎沙門氏菌核酸適配體，通過優(yōu)化腸炎沙門氏菌適配體濃度，研究納米金-適配體體系的腸炎沙門氏菌檢測限、特異性及適用溫度；同時以人工污染樣品為例，評價納米金-適配體的加標(biāo)回收率，從而構(gòu)建一種操作成本低、特異性強(qiáng)的腸炎沙門氏菌檢測方法。同時，通過更換其他致病菌特異性的適配體，又可進(jìn)行其他致病菌的快捷檢測，具有良好推廣效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料及藥品

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538、腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）50335，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。

冷鮮雞肉：市售，散裝稱重，于4 ℃保存。

木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂（xylose-lysinesodium tetrahydrosulfate agar，XLT4）、腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、M9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M9 minimal medium）、LB 培養(yǎng)基（Luria-Bertani）：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）（分析純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；聚乙二醇20000（polyethylene glycol，PEG）、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、NaCl、KH2PO4、KCl、MgCl2、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸三鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化股份有限公司；腸炎沙門氏菌核酸適配體序列參考Joshi 等[25]，序列：5'-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3'；引物1和引物2 分別為5'-GGT GAC GCC ATA-3'和5'-CTG TCA TAA TGT C-3'由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2ws 加熱型磁力攪拌器：上海滬析實業(yè)有限公司；UV1810S 型紫外分光光度計：青島聚創(chuàng)環(huán)保有限公司；LDZX-40AI 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DH5000AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納米金溶液制備

錐形瓶中加入95.8 mL 超純水和4.2 mL 氯金酸溶液，磁力加熱攪拌器混勻后，加入10 mL 檸檬酸三鈉溶液和5 mL PVP，持續(xù)攪拌加熱至溶液變紅，靜置冷卻至室溫。

1.3.2 檢測條件優(yōu)化

1.3.2.1 菌種活化及菌懸液制備

3 種試驗菌株接種于腦心浸液肉湯并涂布LB 平板劃線，挑取單菌落于10 mL 營養(yǎng)肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)（150 r/min）至達(dá)到對數(shù)生長期。4 ℃、2 850 r/min離心20 min，利用預(yù)冷的PBS 緩沖液（pH7.5）清洗2次，無菌水重懸，調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL，此時OD550nm為6.30。

1.3.2.2 適配體濃度篩選

在96 孔板中加入1×109CFU/mL 的菌液50 μL，再分別加入等體積濃度為0、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1 000 nmol/L 的適配體，混勻孵育5 min。加入納米金溶液50 μL，平衡5 min，加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液，平衡5 min 后比色拍照，篩選最佳適配體濃度。

1.3.2.3 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌檢測限測試

梯度稀釋菌懸液，使菌懸液濃度分別為101～109CFU/mL。96 孔板中分別加入1.3.2.2 中篩選出的最佳適配體濃度的適配體50 μL，再依次加入101～109CFU/mL 菌懸液50 μL，混勻孵育5 min，加入50 μL納米金溶液，平衡5 min，加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液，平衡5 min 后比色拍照，確定腸炎沙門氏菌的檢測限。

1.3.2.4 適配體-納米金溶液特異性檢測

分別加入3 種試驗菌株1×109CFU/mL 菌懸液50 μL，加入最佳適配體濃度適配體50 μL，混勻孵育5 min，加入納米金溶液50 μL，平衡5 min，加入10 μL 5 mol/L NaCl 溶液，平衡5 min 后比色拍照，檢測腸炎沙門氏菌適配體-納米金溶液的特異性。

1.3.2.5 適配體-納米金溶液的適用溫度測定

96 孔板中加入50 μL 1×109CFU/mL 的菌液、最佳適配體濃度適配體50 μL，混勻孵育5 min 后，加入納米金溶液50 μL，平衡5 min。加入10 μL 5 mol/L NaCl溶液后，置于15、25、35 ℃的水浴中，測定該體系的適用溫度。

1.3.3 人工污染樣品檢測

冷鮮雞肉切塊，生理鹽水沖洗，超凈臺紫外照射30 min，經(jīng)GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》[26]方法檢測，無腸炎沙門氏菌檢出。稱取50 g 雞肉塊為1 份，分別浸入102～109CFU/mL 的菌液中，放置1 h。取出后，利用生理鹽水充分浸泡振蕩30 min。沖洗溶液取50 μL 進(jìn)行平板計數(shù)，另取50 μL 進(jìn)行納米金-適配體檢驗，以開始出現(xiàn)顏色變化所對應(yīng)的平板計數(shù)濃度為納米金-適配體的加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析，顯著性分析為ANOVA（One-way analysis of variance，the Duncan test），多重比較采用LSD 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 適配體-納米金溶液檢測腸炎沙門氏菌

基于納米金溶液在高鹽環(huán)境下所產(chǎn)生的凝聚顏色變化原理[21，27-28]，適配體-納米金法檢測腸炎沙門氏菌的顏色變化如圖1 所示。若溶液中僅存在納米金，則在高鹽溶液環(huán)境下，會發(fā)生凝聚現(xiàn)象，使溶液變?yōu)樗{(lán)色；而當(dāng)溶液中存在納米金和適配體時，由于納米金表面吸附了適配體，不會在高鹽環(huán)境中發(fā)生凝聚，因此溶液仍為紅色；當(dāng)溶液中存在靶標(biāo)菌（腸炎沙門氏菌）時，適配體與靶標(biāo)細(xì)菌特異性結(jié)合，而未結(jié)合適配體的納米金即在高鹽環(huán)境下發(fā)生聚集，使溶液呈現(xiàn)深藍(lán)色。

圖1 適配體-納米金腸炎沙門氏菌檢測體系Fig.1 Aptamer nano gold detection system for Salmonella enteritidis

由圖1 及納米金溶液在高鹽環(huán)境下的凝聚顏色變化原理可知，管1 中包含靶標(biāo)細(xì)菌（腸炎沙門氏菌）、適配體和納米金，靶標(biāo)菌與適配體結(jié)合呈現(xiàn)的藍(lán)色與未結(jié)合適配體的納米金在高鹽環(huán)境下發(fā)生凝集，使藍(lán)色加深，呈現(xiàn)深藍(lán)色；管2 中只有靶標(biāo)菌及適配體，兩者結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色；管3 中僅有適配體和納米金，納米金在高鹽環(huán)境下呈現(xiàn)紅色。結(jié)果表明，當(dāng)測試溶液中包含靶標(biāo)菌時，該體系應(yīng)呈現(xiàn)深藍(lán)色。

2.2 最佳適配體濃度篩選

最佳適配體濃度篩選結(jié)果如圖2 所示。

圖2 最佳適配體濃度篩選Fig.2 Optimal aptamer concentration screening

由圖2 可知，當(dāng)腸炎沙門氏菌濃度為109CFU/mL時，分別測試添加0、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1 000 nmol/L 的適配體50 μL，隨著適配體濃度不斷升高，混合溶液的顏色逐漸加深，在200 nmol/L 時顏色最深（管7），其后增加適配體濃度，適配體數(shù)量多于菌數(shù)，多余的適配體與納米金結(jié)合，在高鹽溶液下呈紅色，至1 000 nmol/L 時適配體數(shù)量遠(yuǎn)多于菌數(shù)，溶液呈現(xiàn)紅色。因此選擇適配體200 nmol/L 為最佳適配體添加濃度。

2.3 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的檢測限

通過在523 nm 處吸光度與腸炎沙門氏菌濃度的線性分析結(jié)果見圖3。

圖3 腸炎沙門氏菌濃度與吸光度的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between Salmonella enteritidis concentration and absorbance value

由圖3 可知，在103～107CFU/mL 菌液濃度下，兩者有較好的線性關(guān)系，線性方程：y=0.187 8x-0.146（R2=0.991 3），檢測限為9.3×101CFU/mL。

3f 1H NMR(CDCl3) δ:7.91-7.79(m,2 H),7.77-7.75(m,1 H),7.56-7.53(m,1 H),7.37-7.33(m,2 H),7.27-7.16(m,1 H),2.43(s,6 H).

在體系中分別添加101～109CFU/mL 的腸炎沙門氏菌，其顏色變化在圖4 中顯示。

圖4 適配體-納米金溶液在腸炎沙門氏菌濃度不同時的顏色變化Fig.4 Color changes of aptamer nano gold solution at different concentrations of Salmonella enteritidis

由圖4 可知，當(dāng)沒有腸炎沙門氏菌存在時，混合溶液為紅色；當(dāng)溶液中有靶標(biāo)菌存在時，適配體與靶標(biāo)菌結(jié)合，部分納米金被未與靶標(biāo)菌結(jié)合的適配體保護(hù)，保持紅色，而未與適配體結(jié)合的納米金顆粒在鹽溶液環(huán)境下呈現(xiàn)藍(lán)色，最終使溶液呈現(xiàn)紫紅色；隨著靶標(biāo)菌數(shù)不斷增加，適配體完全與靶標(biāo)菌結(jié)合，納米金顆粒暴露在鹽溶液環(huán)境下凝集，最終使混合溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。

2.4 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的特異性

利用適配體-納米金溶液檢測大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及腸炎沙門氏菌，檢測反應(yīng)體系的特異性，試驗結(jié)果如圖5 所示。

圖5 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的特異性Fig.5 Specificity of aptamer nano gold solution for Salmonella enteritidis

由圖5 可知，腸炎沙門氏菌混合溶液出現(xiàn)顏色變化，其他兩種菌的混合溶液則依然為紅色。當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶標(biāo)菌時，由于適配體與靶標(biāo)菌結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色，納米金溶液在高鹽環(huán)境下呈現(xiàn)紅色，最終呈現(xiàn)出深藍(lán)色（管3）；而其他細(xì)菌與適配體無法特異性結(jié)合，納米金與適配體結(jié)合，從而在高鹽溶液下保護(hù)納米金顆粒，使混合溶液依舊為紅色（管1、管2）。

2.5 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌的適用溫度

適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌體系在不同溫度下的反應(yīng)見圖6。

圖6 適配體-納米金溶液腸炎沙門氏菌體系在不同溫度下的反應(yīng)Fig.6 Reaction of aptamer nano gold solution Salmonlla enteritidis system at different temperatures

如圖6 所示，在相同的添加量下，改變反應(yīng)體系的環(huán)境溫度，結(jié)果無明顯差異。表明該反應(yīng)體系在日常室溫條件下（15～35 ℃）可以使用，環(huán)境溫度變化對該反應(yīng)體系的檢測效果無明顯影響。

2.6 人工污染樣品檢測結(jié)果分析

表1 適配體-納米金溶液檢測腸炎沙門氏菌與平板計數(shù)法的對比Table 1 Comparison of Salmonella enteritis detection with plate counting method

由表1 可知，基于核酸適配體的納米金比色法檢測腸炎沙門氏菌的方法加標(biāo)回收率為93.68%～117.89%。與平板計數(shù)方法檢測腸炎沙門氏菌的結(jié)果沒有明顯差異，表明適配體-納米金溶液可以靈敏地檢測出食品中的腸炎沙門氏菌污染。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于核酸適配體的納米金比色法檢測腸炎沙門氏菌，本方法可以特異性檢測腸炎沙門氏菌，對其他食源性致病菌無特異反應(yīng)。通過條件優(yōu)化，在適配體濃度200 nmol/L 下，腸炎沙門氏菌的最低檢測限為9.3×101CFU/mL，其線性范圍為103～107CFU/mL，線性方程為y=0.187 8x-0.146（R2=0.991 3）。檢測人工污染樣品的加標(biāo)回收率為93.68%～117.89%。

本研究建立的快捷、可視的進(jìn)行腸炎沙門氏菌檢測的方法，利用納米金為顯色信號，無需連接信號轉(zhuǎn)換器，操作簡便，可應(yīng)用于現(xiàn)場分析檢測；對比平板計數(shù)方法，其結(jié)果無明顯差異，該方法可以特異、準(zhǔn)確地檢測食品中腸炎沙門氏菌污染情況，且無需進(jìn)行樣品采集、處理、培養(yǎng)等過程，操作時間大大縮短，技術(shù)要求降低，提升檢測效率；同時該方法通過選擇特異性識別菌種的核酸適配體，配合納米金在高鹽環(huán)境下的顏色變化，實現(xiàn)可視化檢測。此外，篩選識別不同食源性致病菌的適配體時，僅需調(diào)整改變檢測體系內(nèi)適配體，其他成分無需改變（成分濃度根據(jù)檢測靶標(biāo)菌特性調(diào)整），即可實現(xiàn)不同致病微生物的檢測，具有良好的通用性。