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    高效液相色譜法測定雞血漿中L-肉堿含量

    2023-08-12 06:36:54孫雯可王佳璐劉鼎闊李源于曉雪李留安
    食品研究與開發(fā) 2023年15期
    關(guān)鍵詞:峰形庚烷肉堿

    孫雯可,王佳璐,劉鼎闊,李源,于曉雪*,李留安*

    (1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300392;2.鼎正新興生物技術(shù)(天津)有限公司,天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300383)

    L-肉堿(L-carnitine),又名肉毒堿、左卡尼汀,化學(xué)式為C7H15O3N,相對分子質(zhì)量為162.2,常溫下為白色,呈結(jié)晶粉末狀,在植物中含量少,主要存在于動物肝臟和骨骼肌內(nèi)[1]。L-肉堿具有多種生理功能:L-肉堿作為轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸到線粒體內(nèi)的載體,可通過促進(jìn)脂肪酸的β-氧化,降低機(jī)體內(nèi)多余的脂肪含量[2-3];L-肉堿可清除過氧化氫、超氧陰離子,保護(hù)內(nèi)源抗氧化酶系統(tǒng),起到抗氧化作用[4-5];外源補(bǔ)充L-肉堿可以減少氨基酸類添加劑和維生素的用量,提高飼料蛋白質(zhì)的利用率,從而動物體內(nèi)多余的氨基酸和相關(guān)活性離子可用來供給動物體其他生理活動。有研究證明,蛋雞日糧添加L-肉堿可改善生長期蛋雞的生產(chǎn)性能,提高產(chǎn)蛋量、雞蛋蛋品質(zhì)和種蛋的孵化率[6];肉雞日糧添加L-肉堿有助于提髙肉雞的飼料利用率、降低死亡率[7]。L-肉堿在畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用日益廣泛,建立準(zhǔn)確、快速、高靈敏度檢測生物樣品中L-肉堿含量的方法,具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

    目前,L-肉堿的檢測方法有酶法測定法、分光光度色譜法、毛細(xì)管電泳色譜法[8]、液相色譜法等[9]。酶法測定方法易受干擾,影響結(jié)果準(zhǔn)確性;分光光度色譜法重復(fù)性差,不適合大批量樣本檢測[10];毛細(xì)管電泳色譜法的操作程序復(fù)雜性較高[11]。目前,常用高效液相色譜法來檢測L-肉堿,但L-肉堿極性強(qiáng),不易在色譜柱上保留,故本試驗(yàn)采用反向色譜分離技術(shù),通過優(yōu)化流動相組成和比例,改變流速及樣品提取方法,建立一種測定雞血漿中L-肉堿含量的高效液相色譜法,以期能夠快速簡便地檢測出雞血漿中的L-肉堿。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    1.1.1 材料與試劑

    雞血漿由華北柴雞翅下采血,抗凝處理,4 000 r/min離心取上清液獲得,-80 ℃凍存;乙腈、甲醇(均為色譜純):德國Merck 公司;L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品:北京索萊寶生物科技有限公司;庚烷磺酸鈉:上海吉至生化科技有限公司;磷酸(分析純):天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    高效液相色譜儀(1260):美國安捷倫公司;色譜柱ACE Excel 5 Super C18(250 mm×4.6 mm,5 μm):廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司;超聲波清洗機(jī)(SB-100D):昆山市超聲儀器有限公司;離心機(jī)(H1850R):長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司;0.22 μm濾膜:天津市南開區(qū)青創(chuàng)儀器儀表銷售商行。

    1.2 反向色譜條件

    色譜柱:ACE Excel 5 Super C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-5mmol/L 庚烷磺酸鈉(加入0.1%磷酸)水溶液(15∶85,體積比);流速0.6 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長210 nm;進(jìn)樣量20 μL。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 流動相的選擇

    考察3 種不同流動相對L-肉堿檢測結(jié)果的影響:1)乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉水溶液=10∶90(體積比);2)乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉(加入0.1%磷酸)水溶液=10∶90(體積比);3)乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉(加入0.1%磷酸)水溶液=15∶85(體積比)。

    1.3.2 流速的選擇

    0.4 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品在流速為0.6 mL/min 和0.7 mL/min 時分別進(jìn)樣,考察流速對L-肉堿分離效果的影響。

    1.3.3 樣品處理方法

    處理方法1:取200 μL 血漿,加入2 mL 乙腈,4 000 r/min 離心,取上清液于5 mL 容量瓶中,用純水定容,抽取1 mL 溶液經(jīng)0.22 μm 的有機(jī)濾膜注射入進(jìn)樣瓶中,備用。

    處理方法2:取200 μL 血漿,加入2 mL 乙腈甲醇混合液(9∶1,體積比),后續(xù)步驟同處理方法1。

    1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    取20 mg L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品,用20 mL 純水溶解,制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。準(zhǔn)確吸取不同量標(biāo)準(zhǔn)品儲備液分別至于5 mL 容量瓶中,加純水稀釋至刻度并搖勻,分別配制成濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,取20 μL 進(jìn)樣,測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Microsoft Office Excel 軟件處理,數(shù)據(jù)為3 次測定的平均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 流動相選擇

    不同流動相對色譜峰的影響如圖1 所示。

    圖1 不同流動相條件試驗(yàn)色譜圖Fig.1 Chromatograms of different mobile phase conditions

    圖1A、B 可知,流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉水溶液=10∶90(體積比)時,0.1 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為4.364 min,但在此條件下檢測不出樣品中L-肉堿;圖1C、D 可知,當(dāng)流動相為乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸鈉(加入0.1%磷酸)水溶液=10∶90(體積比)時,0.1 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為11.278 min,但檢測不出樣品中L-肉堿;圖1E、F 可知,當(dāng)流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉(加入0.1%磷酸)水溶液=15∶85(體積比)時,0.1 mg/mL L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為10.039 min,檢測樣品中L-肉堿峰形良好;圖1G、H可知,在乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉(加入0.1%磷酸)水溶液=15∶85(體積比)的流動相條件下,標(biāo)準(zhǔn)品溶劑和樣品溶劑在10 min 處均無峰。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉(加入0.1%磷酸)水溶液=15∶85(體積比)為流動相。

    2.2 流速選擇

    不同流速對色譜峰的影響如圖2 所示。

    圖2 不同流速對L-肉堿色譜峰的影響Fig.2 Influence of different flow rates on the chromatographic peak of L-carnitine

    由圖2 可知,在流速為0.6 mL/min 時,L-肉堿保留時間為10.094 min,峰形良好且能與雜峰完全分離;在流速為0.7 mL/min 時,L-肉堿保留時間為8.708 min,峰形不好,拖尾嚴(yán)重,故流速選定為0.6 mL/min。

    2.3 不同前處理?xiàng)l件優(yōu)化

    不同前處理?xiàng)l件對色譜圖的影響結(jié)果見圖3。

    圖3 不同前處理方法提取L-肉堿對色譜峰的影響Fig.3 Effect of L-carnitine extraction by different pretreatment methods on chromatogram

    由圖2 可知,用處理方法1 提取樣品,檢測出樣品中L-肉堿保留時間為10.075 min,峰面積響應(yīng)值為2.732 mAU;用處理方法2 提取樣品,檢測出樣品中L-肉堿保留時間為10.118 min,峰面積響應(yīng)值為4.076 mAU,峰形好,與雜質(zhì)完全分離。處理方法2 比處理方法1 提取的L-肉堿量高,故本試驗(yàn)采用處理方法2:乙腈甲醇混合液(9∶1,體積比)進(jìn)行樣品處理。

    2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

    對配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行高效液相色譜法檢測,線性試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

    圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The diagram of standard curve

    由圖4 可知,L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=402.35x-0.228 3(R2=0.999 8),表明L-肉堿在0.01~0.60 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

    2.5 檢出限與定量限

    L-肉堿的檢出限為0.005 mg/mL,定量限為0.017 mg/mL。

    2.6 精密度

    相同色譜條件下將0.6 mg/mL 的L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6 次,檢測精密度,結(jié)果見表1。

    表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision test results

    如表1 所示,本方法精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.8%(n=6),精密度良好。

    2.7 回收率

    將加標(biāo)濃度為0.01、0.02、0.05 mg/mL 的雞血漿樣品分別進(jìn)樣3 次,結(jié)果見表2。

    表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery rates

    由表2 可知,L-肉堿的平均回收率在97.393%~98.703%,表明該前處理方法具有較高的回收率,能更準(zhǔn)確地反映血漿中肉堿的含量。

    2.8 穩(wěn)定性

    穩(wěn)定性結(jié)果如表3 所示。

    表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability

    由表3 可知,該方法穩(wěn)定性RSD 為0.056%(n=5),表明該方法穩(wěn)定性良好。

    2.9 樣品分析

    采用上述建立的方法對分離的血漿進(jìn)行前處理和分析,測得雞血漿中L-肉堿含量為0.284 mg/mL。

    3 討論

    3.1 檢測條件的優(yōu)化

    L-肉堿的極性較強(qiáng),在常規(guī)色譜系統(tǒng)中不易保留,但在酸性條件下,L-肉堿可以和離子對試劑反應(yīng)生成離子對,延長在色譜柱上的保留時間,且在波長為210 nm 時,檢測出最大吸收峰[12-13]。本試驗(yàn)在考察流動相的pH 值對L-肉堿出峰時間的影響時,發(fā)現(xiàn)在酸性條件下,L-肉堿保留時間更長且檢測樣品中L-肉堿峰形良好,這與周文清[9]試驗(yàn)結(jié)果相似,其研究發(fā)現(xiàn),改變流動相pH 值能夠改變物質(zhì)出峰時間,改善峰形,防止目標(biāo)峰拖尾。有機(jī)試劑洗脫能力強(qiáng),在色譜系統(tǒng)中,有機(jī)相比例增大會縮短物質(zhì)保留時間。莫紫梅等[14]在檢測口服液中L-肉堿含量時發(fā)現(xiàn),L-肉堿的保留時間隨著有機(jī)相比例增大而縮短,與本研究結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈比例為10%時,L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為11.278 min,當(dāng)乙腈比例為15%時,L-肉堿保留時間為10.039 min,但是在乙腈比例為10%時,檢測不出樣品中L-肉堿峰,乙腈比例為15%時,樣品中L-肉堿峰峰形良好,無雜峰干擾。綜合考慮峰形、物質(zhì)分離度、保留時間等因素,最終選擇流動相條件為乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸鈉(0.1%磷酸)水溶液(15∶85,體積比)。

    流速主要影響柱壓和出峰時間,提升流速會使出峰時間提前,整體分析時間變短,但柱壓也會隨之上升,柱壓過高則會導(dǎo)致漏液,并且目標(biāo)峰與雜峰不能很好地分離[15]。本試驗(yàn)考察0.6 mL/min 和0.7 mL/min流速對L-肉堿出峰時間的影響,分析在不同流速進(jìn)樣時,L-肉堿峰形及出峰時間的區(qū)別。結(jié)果表明,流速變化對分離效果有明顯影響,當(dāng)流速為0.7 mL/min時L-肉堿保留時間為8.708 min,峰形拖尾;流速為0.6 mL/min 時,L-肉堿保留時間為10.094 min,峰形良好。綜合考慮峰形、柱壓和干擾峰等因素,最終選擇流速為0.6 mL/min。

    3.2 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

    L-肉堿具有良好的水溶性,易溶于甲醇、乙腈、乙醇等有機(jī)試劑[16-17],且甲醇、乙腈具有沉淀蛋白的作用,可在去除雞血漿中蛋白質(zhì)的同時有效提取L-肉堿,但單一試劑提取效果不好[18],因此本試驗(yàn)比較了純乙腈和乙腈甲醇(9∶1,體積比)混合液兩種前處理方法,分析不同處理對L-肉堿提取量及峰形的影響。結(jié)果顯示,用純乙腈提取時,L-肉堿提取濃度為0.146 mg/mL,峰形拖尾且與雜峰距離較近;用乙腈甲醇(9∶1,體積比)混合液提取時,L-肉堿提取濃度為0.284 mg/mL,峰形好,能與雜質(zhì)完全分離。樣品處理時間影響檢測樣品數(shù)量,處理時間越短,檢測樣品數(shù)量越多,可大幅提高工作效率。目前提取血漿中L-肉堿的方法多為衍生化處理,步驟繁瑣,分析時間較長。唐笑等[19]在檢測羅非魚血漿中L-肉堿時,經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)后,用衍生試劑反應(yīng)90 min;丁峰等[20]、謝根英等[21]在提取病患血液中L-肉堿時,均采用衍生法進(jìn)行提取,反應(yīng)時間在1.5 h 左右。本試驗(yàn)處理方法簡便且所用時間較短,綜合考慮提取量、峰形及分析時間,最終選擇樣品用乙腈甲醇混合液(9∶1,體積比)進(jìn)行處理。

    4 結(jié)論

    采用乙腈甲醇混合液(9∶1,體積比)提取雞血漿中L-肉堿,經(jīng)過色譜條件優(yōu)化,確定流動相為乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸鈉(0.1%磷酸)水溶液(15∶85,體積比),流速為0.6 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長210 nm,進(jìn)樣量20 μL 的色譜條件,該方法精密度、回收率、穩(wěn)定性高,適合于雞血漿中L-肉堿的檢測。

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