果酒增香釀造技術(shù)研究進(jìn)展

王 飛，王曉宇,2,3，趙擎豪，趙越凡，劉 炎，杜國(guó)榮，趙鵬濤,2,3,*

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.國(guó)家蘋果加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，陜西 西安 710119；3.西部果品高值利用教育部工程研究中心，陜西 西安 710119；4.西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065）

果酒因其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的口感深受消費(fèi)者青睞。然而，多數(shù)果酒存在香氣寡淡、風(fēng)味典型性不足的問題，極大影響了果酒的感官品質(zhì)，制約著我國(guó)果酒產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。根據(jù)香氣產(chǎn)生的釀造階段，果酒香氣可以分為品種香、發(fā)酵香和陳釀香。微生物在果酒釀造的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用，其生長(zhǎng)代謝、產(chǎn)酶類型和產(chǎn)酶活力以及菌種間相互作用均對(duì)果酒風(fēng)味形成有較大影響[1-3]。因此，深入解析釀酒微生物、酶和發(fā)酵前冷浸漬等工藝處理對(duì)果酒香氣的影響機(jī)制，創(chuàng)制基于微生物香氣化合物調(diào)控技術(shù)，對(duì)于提高果酒香氣質(zhì)量具有重要意義。

本文通過剖析釀酒微生物、酶及發(fā)酵前冷浸漬等工藝處理對(duì)果酒香氣化合物生成的影響，闡明主要香氣化合物的生成機(jī)理，并探討優(yōu)良產(chǎn)香酵母選育的研究進(jìn)展。最后，對(duì)未來果酒風(fēng)味的研究方向進(jìn)行展望，旨在為果酒增香釀造技術(shù)的創(chuàng)制提供一定理論支持。

1 果酒香氣

香氣是果酒最重要的感官品質(zhì)指標(biāo)。果酒中發(fā)現(xiàn)的香氣物質(zhì)超過1 000 種，主要是在微生物生長(zhǎng)代謝過程中形成，其產(chǎn)生機(jī)制如圖1所示。來源于水果的品種香是果酒香氣的重要組成部分，有利于果酒典型風(fēng)味的塑造，然而大多品種香氣化合物在釀酒及貯藏過程中會(huì)發(fā)生一系列變化，果香特征減弱[4]；乙醇發(fā)酵過程產(chǎn)生的發(fā)酵香氣構(gòu)成了果酒香氣的基本骨架，對(duì)果酒最終風(fēng)味形成具有決定作用；陳釀過程中品種香氣與發(fā)酵香氣進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，使果酒整體香氣更加平衡和諧。

圖1 果酒微生物產(chǎn)香機(jī)制Fig.1 Mechanism of microbial aroma production in fruit wine

1.1 果酒香氣形成機(jī)制

在發(fā)酵過程中，以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在于水果中的非揮發(fā)性香氣前體物質(zhì)在釀酒酵母相關(guān)酶的作用下解離出游離態(tài)香氣，主要包括一些硫醇類和萜烯類化合物，這些物質(zhì)貢獻(xiàn)了果酒主要的品種香氣，賦予果酒獨(dú)特的風(fēng)味。

總體來說，果酒芳香大部分由發(fā)酵香氣組成，構(gòu)成了果酒香氣的主體部分，香氣化合物包括酯類、醇類、有機(jī)酸類、醛酮類、含硫化合物以及萜烯類等[5]。乙醇發(fā)酵過程中由釀酒酵母代謝產(chǎn)生的香氣化合物貢獻(xiàn)了果酒的主要發(fā)酵香氣。糖酵解產(chǎn)生一些直接或次級(jí)代謝物如甘油、乙醇等，構(gòu)成了果酒的基本香氣骨架。氨基酸代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要是高級(jí)醇以及與其相關(guān)的酯類物質(zhì)，還包括少量的醛類物質(zhì)。乙醇發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵，在降酸的同時(shí)生成雙乙酰和一些酯類化合物，有助于果酒風(fēng)味的進(jìn)一步提升。

陳釀過程中果酒的芳香成分遷移轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步提升了果酒的香氣復(fù)雜性。關(guān)于果酒的陳釀增香機(jī)理，一般認(rèn)為與氧有關(guān)：一是“氧化說”，如葡萄酒陳釀期間氧氣通過橡木桶的微孔進(jìn)入酒液，使醇、醛類物質(zhì)緩慢氧化，高級(jí)醇類含量降低；二是“酯化說”，即醇類物質(zhì)氧化成相應(yīng)的酸，酸與乙醇反應(yīng)形成酯，使酯香增強(qiáng)。陳釀香氣會(huì)隨陳釀周期的變化呈現(xiàn)不同的結(jié)果。蒲彪等[6]研究了枇杷果酒陳釀期間香氣成分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)醇類含量總體減少，酯類含量總體增加，酯香復(fù)雜濃郁，且陳釀3 個(gè)月后特征香氣由辛酸乙酯更替為癸酸乙酯?；诖?，果酒陳釀增香的研究方向應(yīng)為促進(jìn)醇的氧化和酯的形成。目前果酒催陳方法有電化學(xué)催陳、微波催陳、超高壓催陳、氧化催陳等[7]。

1.2 主要風(fēng)味化合物的合成及調(diào)控機(jī)理

高級(jí)醇類和酯類物質(zhì)是發(fā)酵香氣的重要組成部分，幾乎存在于所有發(fā)酵果酒中。因此，研究其合成機(jī)理有利于從分子水平上精確調(diào)控化合物的含量，提升果酒香氣的強(qiáng)度和復(fù)雜度[8]。

1.2.1 高級(jí)醇類物質(zhì)

高級(jí)醇類物質(zhì)主要由酵母在α-酮酸發(fā)酵過程中形成，與Ehrlich途徑降解氨基酸有關(guān)[8]。高含量的高級(jí)醇會(huì)產(chǎn)生威士忌等異味，而低含量的高級(jí)醇則會(huì)賦予酒青草香、果香等香氣[9]。因此，可以通過調(diào)節(jié)Ehrlich途徑調(diào)控高級(jí)醇的生成。酵母生長(zhǎng)階段、相關(guān)酶活力和氨基酸含量等因素均會(huì)影響Ehrlich途徑的代謝過程，從而影響果酒香氣成分組成。如與Ehrlich途徑相關(guān)的基因BAT1在酵母指數(shù)生長(zhǎng)期優(yōu)先表達(dá)，而BAT2在穩(wěn)定生長(zhǎng)期過表達(dá)，這兩個(gè)基因的過表達(dá)會(huì)使異丁醇和異戊醇含量顯著增加[10]。

1.2.2 酯類物質(zhì)

酯類物質(zhì)是在果酒中發(fā)現(xiàn)的最豐富的香氣化合物，包括乙酸酯和乙酯兩類[11]，它們由酵母通過不同的代謝機(jī)制形成，但均具有類似水果的芳香，如草莓、甜果、青蘋果、香蕉等氣味[12]。乙酸酯的形成依賴于乙酸和高級(jí)醇，也受釀酒酵母中ATF基因編碼的兩種醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的影響[8]。例如，葡萄酒發(fā)酵過程中過表達(dá)ATF1基因會(huì)導(dǎo)致乙酸酯的產(chǎn)量增加約10～200 倍[13]，但酵母過表達(dá)ATF1生產(chǎn)乙酸乙酯會(huì)對(duì)酒中的其他酯類以及揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生抑制作用，從而掩蓋葡萄酒的品種香氣，并產(chǎn)生清漆或指甲油等不良?xì)馕禰14]。

乙酯的生物合成受乙醇含量的影響較大[15]，較低含量的乙醇有利于乙酯的生成，因此研究人員特別重視降低葡萄酒中乙醇的水平[16-18]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，通過推動(dòng)碳通量生產(chǎn)甘油能夠減少乙醇的生成[19]，然而，這種方法會(huì)造成醋酸的積累，使揮發(fā)性酸度處于很高水平，導(dǎo)致釀酒故障。另一種能夠有效降低乙醇產(chǎn)量的方法是從分子水平去除乙醛脫氫酶基因（ALD6）[20]。與酵母代謝相關(guān)的主要化合物的合成如圖2所示。

圖2 與酵母代謝相關(guān)的主要化合物的合成[8]Fig.2 Synthesis of major compounds related to yeast metabolism[8]

2 果酒增香發(fā)酵

2.1 釀酒微生物對(duì)香氣的影響

2.1.1 酵母對(duì)香氣的影響

產(chǎn)香酵母又稱產(chǎn)酯酵母，是一類能夠改善發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的酵母。自20世紀(jì)60年代開始用于白酒生產(chǎn)，之后陸續(xù)應(yīng)用于黃酒、醬油、食醋、葡萄酒、果酒等行業(yè)，用于彌補(bǔ)香氣不足的缺點(diǎn)。產(chǎn)香酵母能分泌豐富的糖苷酶類，在代謝過程中產(chǎn)生大量酯類、醇類等香氣物質(zhì)，使酒體協(xié)調(diào)，賦予酒體濃郁的發(fā)酵香味。果酒中常見的產(chǎn)香酵母包括克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、鐵紅假絲酵母（Candida pulcherrima）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）等[21]。

2.1.1.1 克魯維畢赤酵母

克魯維畢赤酵母具有很強(qiáng)的產(chǎn)酯能力，特別是乙酸苯乙酯和辛酸乙酯[22-23]，能夠賦予酒類特色的果味、玫瑰味、甜味和蜂蜜味。如由克魯維畢赤酵母發(fā)酵的蘋果酒具有濃郁的熱帶水果味[24]。同時(shí)，有研究證明克魯維畢赤酵母能夠增強(qiáng)β-裂解酶活性，從而促進(jìn)揮發(fā)性硫醇的釋放，克魯維畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵產(chǎn)生的硫醇含量為釀酒酵母單發(fā)酵的7 倍[25]。但在含有克魯維畢赤酵母的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了戊酸（腐臭氣味）含量的增加和硫化氫（臭雞蛋味）的產(chǎn)生，對(duì)酒體產(chǎn)生不利影響[26]。然而，它們的來源尚不確定，有待進(jìn)一步研究。

2.1.1.2 葡萄汁有孢漢遜酵母

葡萄汁有孢漢遜酵母的主要特征之一是高產(chǎn)乙酸酯[27]。Ciani等[28]檢測(cè)到由葡萄汁有孢漢遜酵母發(fā)酵的白葡萄酒中乙酸乙酯含量約為釀酒酵母發(fā)酵的9 倍。Romano等[29]比較葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母生產(chǎn)香氣化合物的能力，發(fā)現(xiàn)葡萄汁有孢漢遜酵母發(fā)酵的酒中乙酸平均質(zhì)量濃度約為2 g/L，遠(yuǎn)高于釀酒酵母發(fā)酵酒（0.6 g/L）。但是與釀酒酵母相比，用葡萄汁有孢漢遜酵母發(fā)酵葡萄酒產(chǎn)生的總脂肪酸含量和總高級(jí)醇含量要少得多，這有利于減少酒精味、指甲油味、脂肪味等不良?xì)馕禰30]。

2.1.1.3 其他產(chǎn)香酵母

鐵紅假絲酵母與酒中高含量酯的產(chǎn)生有關(guān)。在純培養(yǎng)條件下，鐵紅假絲酵母產(chǎn)生的乙酸異戊酯含量顯著高于其他非釀酒酵母，當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.001 g/L時(shí)，呈現(xiàn)糖果味、水果味和香蕉味[15]。而與釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生較高水平的乙酸乙酯以及一些與不良風(fēng)味有關(guān)的揮發(fā)性物質(zhì)，當(dāng)乙酸乙酯質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí)，葡萄酒的果味與乙酸乙酯呈強(qiáng)相關(guān)[31]。季也蒙有孢漢遜酵母與酒中玫瑰和蜂蜜味有關(guān)[32]，而Hanseniaspora vineae是果香椰子和香草味形成的主要原因[33]，此外，Hanseniaspora vineae中支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（BAT2）和醇?；D(zhuǎn)移酶（EEB1）基因的缺失會(huì)導(dǎo)致高級(jí)醇、脂肪酸和乙酯產(chǎn)量的減少[8]。東方伊薩酵母的存在會(huì)導(dǎo)致酒中乙酸乙酯（220～730 mg/L）的過量生成，但其較強(qiáng)的蘋果酸降解能力對(duì)于發(fā)酵是有利的[34]。

2.1.2 混菌發(fā)酵對(duì)香氣的影響

目前果酒工業(yè)生產(chǎn)采用釀酒酵母單菌發(fā)酵，其發(fā)酵速率快、效率高，但生產(chǎn)的果酒缺乏風(fēng)味復(fù)雜性。非釀酒酵母雖然發(fā)酵性能差，但在發(fā)酵過程中可以通過酶和風(fēng)味代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生改善發(fā)酵酒的芳香特性。因此，利用釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵提升果酒感官質(zhì)量是一種可行的辦法。

2.1.2.1 混菌發(fā)酵菌種的選擇

相較于傳統(tǒng)的發(fā)酵方式，利用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)改善果酒的風(fēng)味和口感具有積極作用。尹雪林等[35]利用釀酒酵母與戴爾凱氏有孢圓酵母混合發(fā)酵獼猴桃酒，共檢出23 種揮發(fā)性物質(zhì)，遠(yuǎn)多于純種發(fā)酵，豐富了獼猴桃酒的香氣成分，其中β-大馬士酮、香茅醇、α-松油醇等萜烯類物質(zhì)大量生成，使得獼猴桃酒的花果香更加濃郁。張文文等[36]對(duì)釀酒酵母和東方伊薩酵母混合發(fā)酵楊梅酒產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙酯類和乙酸酯類物質(zhì)含量較釀酒酵母單發(fā)酵分別提高了18.52%和57.34%，同時(shí)提高了發(fā)酵效率，降低了釀酒酵母單發(fā)酵產(chǎn)生的酵母味和癸酸乙酯帶來的澀味。采用不同種類的非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵黃桃果酒，產(chǎn)生的香氣化合物具有較大的差異，Lachancea thermotolerans組和Metschnikowia pulcherrima組分別有利于苯乙醇和甘油的生成。H.uvarum/S.cerevisiae組的乙酸乙酯含量最高，而T.delbrueckii組高級(jí)醇和脂肪酸含量降低，從而減弱了酒中刺鼻的氣味[37]。不同果酒混菌發(fā)酵的香氣特點(diǎn)如表1所示。

表1 不同果酒混菌發(fā)酵的香氣特點(diǎn)Table 1 Aroma characteristics of different fruit wines produced by mixed fermentation

2.1.2.2 接種方式的選擇

在混合發(fā)酵過程中，接種策略也會(huì)影響酒體香氣特征。研究發(fā)現(xiàn)順序接種發(fā)酵比同時(shí)接種發(fā)酵效果更好，因?yàn)轫樞蚪臃N時(shí)非釀酒酵母在發(fā)酵開始階段能進(jìn)行更高程度的代謝表達(dá)[48-49]。在櫻桃酒發(fā)酵中，順序接種比同時(shí)接種發(fā)酵產(chǎn)生更多的酯類和高級(jí)醇類，包括3-甲基-1-丁醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、β-苯乙醇和芳樟醇等，這可能是由于同時(shí)接種導(dǎo)致與釀酒酵母的氮競(jìng)爭(zhēng)，抑制了戴爾凱氏有孢圓酵母的生長(zhǎng)[50]。然而，在龍眼酒中顯示了與之矛盾的結(jié)果，同時(shí)接種發(fā)酵產(chǎn)生了最高含量的總酯和苯乙醇[45]。

接種比例也是一個(gè)必須要考慮的問題。據(jù)報(bào)道，以1∶1同時(shí)接種釀酒酵母和拜氏接合酵母有利于生產(chǎn)乙酯，包括乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。然而，當(dāng)接種比例為1∶100或1∶1 000時(shí)會(huì)生成過量的乙酸乙酯，產(chǎn)生不良?xì)馕禰51]。張文靜等[39]采用本土克魯維畢赤酵母與釀酒酵母分別以1∶1、10∶1、20∶1的比例混合接種發(fā)酵赤霞珠葡萄酒，發(fā)現(xiàn)克魯維畢赤酵母接種比例的增加有利于葡萄酒中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醇和乳酸乙酯等香氣物質(zhì)含量的提高。Canonico等[52]比較了在曝氣條件下，3 種非釀酒酵母與釀酒酵母順序接種發(fā)酵對(duì)葡萄酒揮發(fā)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)只有拜氏接合酵母能稍許增加酯類的產(chǎn)量。與釀酒酵母單發(fā)酵相比，接種拜氏接合酵母的葡萄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)降低了約2%[53]；同時(shí)花青素含量增加了36%，改善了葡萄酒的顏色，這可能是由于酵母細(xì)胞壁中花青素吸附能力的差異[54]。

此外，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等技術(shù)逐漸運(yùn)用到提升果酒風(fēng)味方面。Giorello等[8]利用全基因組測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)2-苯乙酸酯和2-苯乙醇含量的增加可能與芳香氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（ARO8和ARO9）和苯丙酮酸脫羧酶基因的復(fù)制有關(guān)。Kondo等[55]通過在釀酒酵母中過表達(dá)2-酮酸脫羧酶基因（KDC）和醇脫氫酶基因（ADH6、ADH7），檢測(cè)到更高含量（13 倍）的異丁醇。另外，通過改變纈氨酸生物合成的碳通量和敲除丙酮酸脫羧酶基因（PDC1），可進(jìn)一步提高異丁醇的產(chǎn)量。ATF1和ATF2基因雙缺失會(huì)導(dǎo)致乙酸異戊酯無法合成[56]，而IRC7基因是影響葡萄酒中4-巰基-4-甲基-2-戊酮形成的關(guān)鍵基因[57]。

2.1.3 蘋果酸-乳酸發(fā)酵對(duì)香氣的影響

蘋果酸-乳酸發(fā)酵是乳酸菌將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸和CO2的過程。該過程除了能夠降低酒液酸度外，還可以調(diào)節(jié)酒的香氣和口感。酒酒球菌、乳桿菌和片球菌等可以通過糖苷酶水解香氣前體物質(zhì)影響酒體香氣特征。Spano等[58]報(bào)道了β-葡萄糖苷酶基因在乳桿菌中的表達(dá)情況，其受到乙醇含量、pH值以及菌株等因素的影響。Olguín等[59]推斷，在中等乙醇體積分?jǐn)?shù)（8%～10%）條件下可能會(huì)誘導(dǎo)酒酒球菌中bgl基因的表達(dá)。然而，β-葡萄糖苷酶活性與基因表達(dá)之間的關(guān)系尚不清楚，還需要更多的研究。此外，菌種間糖苷酶活性的差異會(huì)影響香氣化合物的含量，Michlmayr等[60]報(bào)道，酒酒球菌組糖苷酶處理葡萄酒中產(chǎn)生的芳樟醇和香茅醇含量明顯高于乳桿菌組。此外，乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵對(duì)酯類的含量有顯著影響，最近一項(xiàng)研究顯示，混合接種發(fā)酵使乙醇發(fā)酵與蘋果酸-乳酸發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，縮短發(fā)酵時(shí)間的同時(shí)提升了果酒香氣，乙酯含量顯著增加，尤其是乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯[61]。

綜上，發(fā)酵香氣的形成不再單一地依賴釀酒酵母，利用釀酒酵母、非釀酒酵母以及乳酸菌等多菌種間的相互作用調(diào)控果酒風(fēng)味品質(zhì)將受到更多關(guān)注，今后對(duì)多菌種間的分子相互作用機(jī)理應(yīng)作深入研究。

2.2 風(fēng)味相關(guān)生物酶對(duì)香氣的影響

果酒釀造過程可將水果果實(shí)中以糖苷鍵合態(tài)形式存在的風(fēng)味物質(zhì)解離釋放到酒中。釀酒微生物能夠代謝產(chǎn)生一些風(fēng)味酶，包括糖苷酶、果膠酶、蛋白酶等，這些酶能夠水解香氣前體物質(zhì)，從而促進(jìn)香氣化合物的釋放。在釀造前加入外源糖苷酶、果膠酶和糖基水解酶可提高果酒的風(fēng)味品質(zhì)[62]。

2.2.1 糖苷酶

糖苷酶可以促進(jìn)水果中糖苷香氣前體物質(zhì)的釋放，主要包括萜烯類和一些多酚類化合物，從而增強(qiáng)和豐富果酒的風(fēng)味。糖苷鍵合態(tài)前體物質(zhì)本身不具有香氣活性，但可以在β-糖苷酶等香氣形成關(guān)鍵酶作用下轉(zhuǎn)化為具有香味的香氣物質(zhì)。萜類糖苷鍵合態(tài)前體物一般由單葡萄糖或雙葡萄糖和萜類糖苷配基組成，其中葡萄糖可以進(jìn)一步與其他糖配基結(jié)合，例如α-L-阿拉伯呋喃糖基、α-L-鼠李糖基、β-D-吡喃木糖基，以及β-呋喃芹糖基等[63]。在葡萄冷浸漬中，萜類物質(zhì)和C13-降異戊二烯類物質(zhì)通過生物代謝途徑，如糖苷鍵合態(tài)前體的水解或生成，這一過程可能受到葡萄果實(shí)中β-糖苷酶的活性變化影響。

一些非釀酒酵母包括假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）等均表現(xiàn)出良好的β-葡萄糖苷酶活性[64]。例如，葡萄酒中萜烯類以及降異戊二烯類物質(zhì)含量的增加與葡萄汁有孢漢遜酵母中β-葡萄糖苷酶的活性密切相關(guān)[65]。Liu Xiaozhu等[66]從刺梨中篩選出Wickerhamomyces anomalusC4菌株的β-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)，為釀酒酵母X16的1.65 倍，并且體積分?jǐn)?shù)15%的乙醇、5 g/100 mL葡萄糖、Cu2+等因素均會(huì)抑制其活性。來源于不同菌株的β-葡萄糖苷酶活性及產(chǎn)香能力也有明顯差異。Hu Kai等[67]應(yīng)用半定量比色法篩選了來自中國(guó)3 個(gè)不同地區(qū)的酵母菌——H.uvarum、P.membranifaciens、Rhodotorula mucilaginosa，發(fā)現(xiàn)來自H.uvarum中的β-葡萄糖苷酶活性最高，且對(duì)C13-正異戊二烯和一些萜烯的芳香糖苷物質(zhì)具有催化特異性，豐富了葡萄酒中新鮮花香、漿果和堅(jiān)果等香氣。

2.2.2 果膠酶與蛋白酶

果膠酶可破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，將果膠聚合物降解為半乳糖醛酸，從而促進(jìn)果汁澄清過濾。同時(shí)，在果酒發(fā)酵前的浸漬過程中，果膠酶可以將糖苷鍵合的風(fēng)味前體切割成芳香活性苷元，從而增強(qiáng)果酒的風(fēng)味特性。例如，Rollero等[68]從設(shè)拉子葡萄汁中篩選出一株具有高果膠酶活性的酵母Kluyveromyces marxianus，此菌株可促進(jìn)葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生更多的苯乙醇和苯乙酸乙酯，而且還能夠增加多酚和花青素的含量。

蛋白酶主要通過為酵母提供氮源影響果酒香氣的形成。非釀酒酵母是蛋白酶的重要來源，在最近的一項(xiàng)研究中，將來自美極梅奇酵母異源表達(dá)的天冬氨酸蛋白酶MpAPr1添加到長(zhǎng)相思葡萄汁中[69]。結(jié)果表明，該酶在發(fā)酵過程中具有活性，并在一定程度上降解了葡萄酒蛋白[70]，促進(jìn)氨基酸水解，為釀酒酵母的生長(zhǎng)提供更好的氮源，從而對(duì)香氣化合物產(chǎn)生有利影響[71]。此外，E3泛素-蛋白連接酶被證明可通過增加Ehrlich通路相關(guān)基因ARO9和BAT1以及去甲基化通路基因STR3表達(dá)，抑制ARO10、PDC1、PDC5和PDC6基因表達(dá)，調(diào)節(jié)高級(jí)醇的生成[72]。這兩種途徑的控制為工業(yè)應(yīng)用提供了巨大的潛力，包括乙醇生產(chǎn)過剩和風(fēng)味質(zhì)量控制。然而，目前為止仍未找到合適的控制Ehrlich途徑和去甲基化途徑的方法。

2.2.3 其他酶

關(guān)鍵的單萜和降異戊二烯香氣化合物在釀酒過程中被酵母和產(chǎn)香細(xì)菌分泌的糖苷酶、酯酶、C—S裂合酶和脫羧酶等降解為游離態(tài)釋放[62]。目前，提高單帖類化合物策略主要有以下兩種：一種是在發(fā)酵過程中或發(fā)酵后添加來自其他微生物的外源性酶制劑以改善糖基化結(jié)合物的水解，商業(yè)酶制劑一般包含果膠酶、葡聚糖酶和木聚糖酶，主要從曲霉中獲得，然而這些酶缺乏特異性，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)風(fēng)味不利的二次反應(yīng)；另一種是采用少數(shù)非釀酒酵母，如葡萄汁有孢漢遜酵母的水解酶活性較高，能夠促進(jìn)與糖苷結(jié)合的單帖類物質(zhì)前體水解，導(dǎo)致單萜類物質(zhì)含量增加[73]。

從以上研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中添加風(fēng)味胞外酶和某些非釀酒酵母可以有效改善成酒的品種香氣。其主要原理是利用外源酶或非釀酒酵母分泌的高活性糖苷酶水解水果果皮中的香氣糖苷前體，從而釋放游離態(tài)品種香氣成分，增強(qiáng)果酒的典型風(fēng)味。

2.3 發(fā)酵前處理工藝對(duì)香氣的影響

在葡萄破碎期間，酶促氧化反應(yīng)、β-胡蘿卜素物質(zhì)（其他類胡蘿卜素）的降解被認(rèn)為能夠產(chǎn)生多種類型的降異戊二烯類物。這類化合物主要包括β-大馬士酮（奇異水果的香氣）、β-紫羅蘭酮（紫羅蘭花的香氣）、3-氧代-β-紫羅蘭酮（煙草氣味）和Vitispirane（新鮮的花香果香和/或異國(guó)花卉和泥質(zhì)木本植物的香氣）等。低溫冷浸漬工藝可以保留小分子香氣化合物，增加香氣復(fù)雜性。有研究表明，在冷浸漬和低溫發(fā)酵過程中，醇類、酯類、烷烴類物質(zhì)等發(fā)酵香氣也會(huì)有所增加，脂肪味和化學(xué)味有所下降[74]。在釀酒酵母與畢赤酵母混合發(fā)酵過程中，適度延長(zhǎng)冷浸漬時(shí)間（3 d），3-甲基丁醇、乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量會(huì)明顯增加。此外，如芳樟醇、α-萜品醇和β-香茅醇等萜烯類香氣成分主要來源于果皮，說明通過冷浸漬工藝可以充分浸提果皮中的芳香類物質(zhì)，提高果酒的品種香氣，從而增加果酒的香氣濃郁度。

由于天然酵母、微生物和相關(guān)酶的作用，較高含量的己醇、順-6-壬烯醇主要是在浸漬過程中形成[75]。冷浸漬過程中一些耐低溫的產(chǎn)香酵母可以使葡萄酒的主香氣成分含量增加[76]。研究發(fā)現(xiàn)，通常當(dāng)溫度超過25 ℃時(shí)就會(huì)抑制非釀酒酵母的生長(zhǎng)。有時(shí)低溫更有利于其發(fā)酵作用，如檸檬型克勒克酵母在10 ℃較25 ℃時(shí)發(fā)酵更好，該酵母可產(chǎn)大量的甘油，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位，使葡萄酒具有更好的柔和性，這種甘油含量高的葡萄酒在新西蘭、澳大利亞都很受歡迎。

3 產(chǎn)香酵母的選育

酵母產(chǎn)香能力直接影響成酒的風(fēng)味質(zhì)量，因此酵母的選育備受重視。酵母的選育方法主要包括自然突變菌株的選育、雜交育種、基因工程育種、誘變育種等[77]。傳統(tǒng)的育種方法以自然突變?yōu)橹?，從不同原料（水果、土壤）中篩選并分離出具有特殊性能的新菌株。例如，吳卓凡等[78]從自然界中篩選出發(fā)酵能力強(qiáng)且風(fēng)味優(yōu)良的枇杷果酒專用釀酒酵母，測(cè)定并分析了其風(fēng)味物質(zhì)組成，相比商業(yè)菌株，醇類、酯類和酸類物質(zhì)含量分別高31%、86%和25%，總揮發(fā)性物質(zhì)增加了45%，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。馮濤等[79]從不同地區(qū)的葡萄園土壤中篩選分離出產(chǎn)香性能良好的釀酒酵母，測(cè)定并比較了其與商業(yè)酵母在產(chǎn)香方面的差異，證實(shí)了篩選出的酵母可以顯著提升發(fā)酵酒的整體香氣。

雜交育種可以將兩個(gè)或多個(gè)優(yōu)良性狀結(jié)合，構(gòu)建具有優(yōu)良性狀的新菌株。Wang Zhouli等[80]通過原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建了基于釀酒酵母和乙醇念珠菌的新型重組融合酵母，在釀造香氣濃郁且低酒精度的蘋果酒方面有巨大潛力?；蚬こ逃N由于外源基因的安全性一直未得到認(rèn)可，其在酵母選育中應(yīng)用受到很大限制。

誘變育種方法可以使生物突變率顯著升高，但要獲得性狀優(yōu)良的正向突變菌株需要花費(fèi)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，并且優(yōu)良酵母選育涉及到較多的釀酒工藝學(xué)指標(biāo)（如產(chǎn)乙醇能力、發(fā)酵速率、高糖耐受性、pH耐受性等），需要進(jìn)行多年、多點(diǎn)的生產(chǎn)試驗(yàn)，篩選進(jìn)程相對(duì)較慢。近幾年常壓室溫等離子體誘變技術(shù)的出現(xiàn)有效地解決了這一難題，并廣泛用于篩選優(yōu)良產(chǎn)香酵母。Tian Tiantian等[81]通過一種聯(lián)合策略，包括常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)、高通量篩選技術(shù)以及適應(yīng)性進(jìn)化策略，從突變庫(kù)中獲得了一株耐酸性強(qiáng)、產(chǎn)香和遺傳穩(wěn)定性良好的菌株ET008-c54，將該菌株用于發(fā)酵青梅酒，使關(guān)鍵風(fēng)味化合物的總質(zhì)量濃度由17.8 mg/L提升至27.0 mg/L，提高了51.9%，特征香氣物質(zhì)安息香醛質(zhì)量濃度由1.8 mg/L提升到2.8 mg/L，解決了青梅酒風(fēng)味不足和典型性不突出的問題。馮鵬鵬等[82]同樣采用常壓室溫等離子體誘變方法獲得了低產(chǎn)高級(jí)醇的誘變菌株，提高了成酒的風(fēng)味品質(zhì)。

4 結(jié)語

本文綜述了釀酒微生物、酶對(duì)果酒香氣的影響，盡管利用產(chǎn)香酵母提高葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性越來越普遍，但非釀酒酵母在其他果酒生產(chǎn)中的應(yīng)用仍然很少。且果酒中部分關(guān)鍵風(fēng)味化合物的合成途徑及微生物代謝通路仍需要進(jìn)一步研究。當(dāng)前，果酒釀造過程中釀酒酵母與非釀酒酵母分子相互作用機(jī)制仍不清晰，高通量技術(shù)可用于揭示微生物的相互作用，從而有利于更好地設(shè)計(jì)混合培養(yǎng)物，提升混菌發(fā)酵的控制水平。此外，果酒陳釀周期較長(zhǎng)，但目前催陳技術(shù)仍不成熟，有待進(jìn)一步研究。未來，在全基因組測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展的帶動(dòng)下，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及風(fēng)味組學(xué)的相關(guān)技術(shù)也將促進(jìn)對(duì)微生物合成風(fēng)味化合物代謝途徑的認(rèn)識(shí)和對(duì)風(fēng)味代謝物質(zhì)調(diào)控機(jī)理的探索，為創(chuàng)制果酒增香釀造技術(shù)奠定基礎(chǔ)。