牛乳纖溶酶及其活性影響因素研究進展

楊晉輝，錢文濤,*，李洪亮，王孟輝，趙婧茹，任曉敏

（1.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司，北京 101100；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500；3.蒙牛乳業(yè)（北京）有限責任公司，北京 101100）

隨著“健康中國2030”的推動實施，消費者對于攝入營養(yǎng)的關(guān)注度不斷提升。2009—2018年間，我國居民乳制品的平均攝入量從12.8 g/d增長至29.1 g/d，仍未達到膳食推薦標準，僅相當于歐美國家人均攝入量的1/15[1]。純牛乳是我國居民攝入乳制品的主要形式，其攝入量占比達到60%[2]。然而，貨架期內(nèi)牛乳的蛋白水解會引起偶然的產(chǎn)品苦包和蛋白絮凝[3]，嚴重影響消費者的飲乳體驗和消費欲望。

牛乳中能夠引起蛋白水解的酶包括內(nèi)源酶和嗜冷菌所分泌的胞外蛋白酶。牛乳中的內(nèi)源酶主要包括纖溶酶、彈性蛋白酶和組織蛋白酶，纖溶酶活性占總蛋白酶活性的60%左右[4]。纖溶酶所引起的酪蛋白水解是超高溫（ultra high temperature，UHT）滅菌乳在貯存期間出現(xiàn)凝膠和苦味的主要原因[3]。牛乳中的纖溶酶及其酶原來源于血液，其活性受到復(fù)雜的激活-抑制調(diào)控機制調(diào)節(jié)[5]。盡管纖溶酶水解酪蛋白對乳酪最終風味和質(zhì)量有著積極的影響[6]，但其誘導(dǎo)老化凝膠嚴重限制了牛乳產(chǎn)品的貨架期[3]。本文對牛乳中纖溶酶系組分、纖溶酶誘導(dǎo)牛乳老化凝膠、影響纖溶酶活性的因素和纖溶酶的檢測方法進行綜述，以期為牛乳纖溶酶的深入研究提供參考。

1 牛乳中的纖溶酶系統(tǒng)

纖溶酶系統(tǒng)是一套復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)的蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其組成包括纖溶酶、纖溶酶原、纖溶酶原激活劑、纖溶酶抑制劑、纖溶酶原激活劑抑制因子，其相互之間的調(diào)節(jié)關(guān)系如圖1所示。牛乳中纖溶酶及其酶原與血液中的纖溶酶和酶原性質(zhì)相一致，血液中的纖溶酶主要以酶原形式通過乳腺細胞的連接處進入牛乳中，然后在乳腺管腔內(nèi)或在貯存期間被激活[5]。

圖1 牛乳纖溶酶系統(tǒng)示意圖[6]Fig.1 Schematic diagram of milk plasmin system[6]

牛乳中纖溶酶為堿性絲氨酸蛋白酶，分子質(zhì)量為48 kDa，在pH 7.4～7.5和37 ℃條件下表現(xiàn)出最佳的類似胰蛋白酶活性[6]。牛乳中纖溶酶主要以纖溶酶原形式存在，纖溶酶原為糖基化蛋白質(zhì)，由786 個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為88 kDa[6]。纖溶酶原有5 個典型的環(huán)餅狀結(jié)構(gòu)域（kringles），每個結(jié)構(gòu)域有3 個二硫鍵參與維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，如圖2A所示，這些結(jié)構(gòu)域含有對賴氨酸親和力不同的結(jié)合位點，在調(diào)節(jié)酶原激活方面發(fā)揮重要的作用[6]。

圖2 纖溶酶原（A）和纖溶酶原激活劑（B）的域結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of the domain structure of plasminogen (A)and plasminogen activator (B)

纖溶酶原激活劑也屬于堿性絲氨酸蛋白酶，通過水解纖溶酶原的環(huán)餅狀結(jié)構(gòu)域5（K5區(qū)）與催化結(jié)構(gòu)域之間的Arg557-Ile558來激活酶原（圖2A）；此外，纖溶酶通過自催化剪切纖溶酶原Lys77-Arg78部分，釋放出77 個氨基酸殘基的預(yù)活化肽后，剩余Arg-纖溶酶原構(gòu)象發(fā)生改變，更容易被激活劑所激活[6,9]。纖溶酶也可以催化纖溶酶原激活劑由單鏈轉(zhuǎn)化為雙鏈（圖2B），極大提高激活劑的催化活性[5]。所有酪蛋白組分，特別是αs2-酪蛋白，能夠增強激活劑對纖溶酶原的活化作用[6]。牛乳中纖溶酶原激活劑主要有兩種，分別為組織型和尿激酶型。組織型激活劑來源于血液轉(zhuǎn)運，其活性與纖維蛋白數(shù)量顯著相關(guān)，與酪蛋白相連接；而尿激酶型激活劑來源于淋巴細胞的分泌，與生乳中的體細胞相連接[6]。尿激酶型激活劑可以從體細胞解離，并通過賴氨酸或靜電作用與酪蛋白相結(jié)合[5]。

纖溶酶原激活劑抑制因子和纖溶酶抑制劑均屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，分別抑制酶原激活劑和纖溶酶，兩者均分布在乳清相中，活性受pH值和溫度影響較大[5]。牛乳中鑒定出多種絲氨酸蛋白酶抑制劑，包括C1-抑制劑、抗凝血酶-III、間-α-胰蛋白酶抑制劑、α2-巨球蛋白、α1-蛋白酶抑制劑和α2-抗纖溶酶α，而α2-抗纖溶酶被認為是主要的纖溶酶抑制劑[6]。

2 纖溶酶誘導(dǎo)牛乳凝膠形成的過程

牛乳的凝膠老化主要是由乳清蛋白中的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-lg）和酪蛋白中κ-酪蛋白（casein，CN）相互結(jié)合形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的過程，表現(xiàn)為牛乳黏度上升和蛋白絮凝[3]。老化凝膠的形成主要分為3 個階段：1）熱加工過程中，β-lg和κ-CN內(nèi)的二硫鍵發(fā)生分子間交聯(lián)，形成β-lg-κ-CN復(fù)合物，并附著在酪蛋白膠束表面；2）貨架期內(nèi)，附著在酪蛋白膠束表面的β-lg-κ-CN復(fù)合物緩慢解離到乳清相中；3）乳清相中β-lg-κ-CN復(fù)合物形成交聯(lián)，并與蛋白結(jié)合在一起[3]。根據(jù)凝膠機理不同，牛乳的老化凝膠分為酶促凝膠和非酶凝膠，酶促凝膠是指由蛋白酶水解酪蛋白顆粒，將β-lg-κ-CN復(fù)合物釋放到乳清中，彼此交聯(lián)形成凝膠[3]。不同來源蛋白酶誘導(dǎo)牛乳老化凝膠差異比較如表1所示。非酶凝膠則是由于貯存過程中，解離κ-CN的膠束會由于重力作用緩慢聚集（儲存時間超過貨架期）形成凝膠[3]。除蛋白酶外，影響牛乳老化凝膠的因素還包括乳牛泌乳、熱加工強度和貯存溫度等，產(chǎn)品中鹽類添加劑會延遲或加速凝膠出現(xiàn)[10]。

表1 不同蛋白酶誘導(dǎo)牛乳老化凝膠的比較Table 1 Comparison of milk age gelation induced by different proteases

纖溶酶對賴氨酸和精氨酸具有親和性，可水解Lys-X和Arg-X鍵，優(yōu)先水解含賴氨酸的肽鍵，其對酪蛋白組分的水解優(yōu)先順序為β-、αs2-和αs1-CN，而對κ-CN和乳清蛋白的水解程度較小[6]，對不同酪蛋白的水解位點和水解產(chǎn)物如表2所示。β-CN的乳糖基化導(dǎo)致賴氨酸殘基的ε-氨基被封閉，構(gòu)象發(fā)生變化，纖溶酶無法識別并結(jié)合底物，這表明乳糖基化賴氨酸的形成會抑制纖溶酶的水解作用[15]。進一步研究表明，琥珀?；嚢彼嵬瑯幼柚沽死w溶酶對β-CN的識別結(jié)合作用[16]，因此，酪蛋白中完整賴氨酸殘基結(jié)構(gòu)對于纖溶酶水解至關(guān)重要。

表2 纖溶酶對酪蛋白的切割位點及其降解產(chǎn)物[6]Table 2 Cleavage sites of casein by plasmin and corresponding degradation products[6]

纖溶酶對乳清相酪蛋白的親水區(qū)域表現(xiàn)出較高的親和力，而對疏水或磷酸化區(qū)域的親和力最低，因此，纖溶酶可能通過水解酪蛋白-酪蛋白和酪蛋白-磷酸鈣相互作用位點使酪蛋白膠束失穩(wěn)[17]。纖溶酶的水解作用降低了酪蛋白的伴侶活性，促進了分子間β-折疊結(jié)構(gòu)的形成，使酪蛋白膠束粒徑增大[18]。酪蛋白膠束的解離降低了纖溶酶與酪蛋白結(jié)合的位阻效應(yīng)，有利于纖溶酶的進一步水解[16]。當大約60%的β-CN和αs1-CN被水解、水解度達到2.1%時，纖溶酶誘導(dǎo)軟凝膠便會出現(xiàn)[13]。有學者將纖溶酶誘導(dǎo)凝膠形成過程分為以下幾個階段：1）纖溶酶快速水解β-和αs-CN；2）酪蛋白之間的疏水互作、酪蛋白與磷酸鈣的結(jié)合力、酪蛋白與離子鹽之間的相互作用，均明顯減弱，酪蛋白膠束微觀結(jié)構(gòu)破壞；3）酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)表觀凝膠現(xiàn)象；4）纖溶酶繼續(xù)水解酪蛋白膠束，表觀上形成半透明清亮液體[13]。

纖溶酶通過水解αs-CN和β-CN使得乳脂球表面的酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)解體，從而導(dǎo)致乳脂球相互融合、上浮，在產(chǎn)品表面形成乳油層[19]。牛乳中纖溶酶和纖溶酶原的添加可降低牛乳乳油層的硬度，增加其延展性，并增強感官指標中的結(jié)構(gòu)和表觀特性[20]。與正常牛乳相比，內(nèi)源酶的水解會使牛乳粒徑分布同時增大和減小，形成3 個粒徑峰，這不同于外源酶水解所形成的雙峰分布[13]。直接加熱的UHT牛乳的貨架期貯存實驗結(jié)果表明，纖溶酶水解酪蛋白所釋放的肽段中有1/3為苦味肽[17]，這可能是凝膠產(chǎn)品中苦味物質(zhì)的主要來源。此外，貨架期內(nèi)牛乳中纖溶酶的激活會導(dǎo)致色澤參數(shù)L、a、b值均緩慢降低[21]。

3 影響纖溶酶活性的因素

3.1 動物

3.1.1 種類和品種

不同品種泌乳動物之間乳中纖溶酶活性存在差異。盡管駱駝乳（（31.76±3.64）U/mL）和牛乳（（24.77±3.42）U/mL）中的纖溶酶活力無顯著差異，但駱駝乳（（23.69±2.12）U/mL）中的纖溶酶原活力遠低于牛乳（（44.40±2.39）U/mL）[22]。牛乳、綿羊乳和山羊乳的比較中，3 種乳酪蛋白部分纖溶酶活力無顯著差異，而綿羊乳乳清部分纖溶酶活力分別是山羊乳和牛乳乳清部分的4.5 倍和11.5 倍；牛乳酪蛋白部分的纖溶酶原活力最高，分別為綿羊乳和山羊乳部分的16.4 倍和8.2 倍，牛乳乳清部分纖溶酶原活力是綿羊乳的3 倍，山羊乳中乳清部分纖溶酶原活性極低[23]。水牛泌乳前7 周內(nèi)乳中纖溶酶活力為1.37～13.44 U/mL，纖溶酶原活力為12.06～54.98 U/mL[24]。

牛乳中的纖溶酶及其酶原的活力會也受到乳牛品種的影響，國內(nèi)的一項研究中纖溶酶活力在各實驗乳牛品種中的排序是：荷斯坦乳牛＞水牛＞娟姍牛[25]；而國外另一項研究卻給出相反的結(jié)果：娟姍牛＞瑞典紅牛＞荷斯坦乳牛，同時娟姍牛乳中的纖溶酶原活性也高于其他兩種牛乳[26]；但也有研究觀察到纖溶酶及其酶原活性在不同的乳牛和綿羊品種之間不存在差異[27-28]。不同乳牛品種間纖溶酶含量的差異可能與乳中酪蛋白相關(guān)，通過調(diào)整合成底物和酪蛋白比例以消除酪蛋白干擾后，品種間的纖溶酶活性差異得以抵消[6]。

3.1.2 泌乳階段和胎次

隨著泌乳期的推進，乳牛乳腺的血乳屏障受損，上皮細胞通透性增加，來自血液的纖溶酶原和激活劑數(shù)量增加，纖溶酶原活化比例增加，導(dǎo)致泌乳后期通常伴隨著較高的纖溶酶活性[6]。然而，綿羊乳中纖溶酶活性的變化與乳牛并不一致，泌乳初期或中期綿羊乳中纖溶酶、酶原和酶原激活劑活性要高于泌乳后期[28-30]。水牛乳中也有相類似的趨勢，前4 周內(nèi)纖溶酶活性增加，隨后降低，并在第7周以后趨于穩(wěn)定；而纖溶酶原在泌乳開始后便逐漸下降，并在4 周后穩(wěn)定[24]。與泌乳階段變化相似，泌乳動物胎次的增加也會導(dǎo)致乳腺組織不可逆損傷程度增加，通透性增加，從而導(dǎo)致乳中纖溶酶活性可能隨胎次增加而逐漸增加[6]。纖溶酶活性隨乳牛胎次呈二次性變化，第2、3胎乳牛的纖溶酶活性高于初產(chǎn)和第4胎乳牛[25]，此外經(jīng)產(chǎn)綿羊乳中纖溶酶活性是初產(chǎn)綿羊乳的1.5～2.2 倍[30]。

3.2 牛乳質(zhì)量

3.2.1 體細胞數(shù)

在體細胞數(shù)低于50萬 個/mL和高于100萬 個/mL的兩個綿羊群比較中，高體細胞數(shù)羊乳中的纖溶酶活性顯著高于低體細胞數(shù)羊乳，纖溶酶原也具有類似的變化，但會受到泌乳階段的影響[29]。有關(guān)乳牛的研究也表明，體細胞數(shù)和纖溶酶活性呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)0.567），但與纖溶酶原活性的相關(guān)性不顯著（相關(guān)系數(shù)為－0.516）[22]。乳房炎的發(fā)生使得體細胞的主要成分由單核細胞向多核細胞轉(zhuǎn)變，中性粒細胞數(shù)量大幅增加[31]。綿羊乳中體細胞數(shù)從30萬 個/mL增長至200萬 個/mL時，其中淋巴細胞的比例下降6.2%，多形核白細胞上升5.1%[4]。炎癥可誘導(dǎo)活化的免疫細胞分泌尿激酶型纖溶酶原激活劑，促進纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)化，纖溶酶活性增加[6]。與低體細胞數(shù)（＜30萬 個/mL）綿羊乳相比，高體細胞數(shù)使得纖溶酶原激活劑和纖溶酶活性顯著增加，纖溶酶原活性無顯著變化，纖溶酶原/纖溶酶比值下降[28]。尿激酶型酶原激活劑能夠從體細胞上解離下來，并與酪蛋白相結(jié)合，而牛乳中的體細胞數(shù)、體細胞在牛乳中的時長以及牛乳的熱處理等因素，都能影響該解離過程[9]。

3.2.2 微生物酶

生乳中的嗜冷菌在貯運過程所分泌的蛋白酶具有干擾纖溶酶系統(tǒng)的作用。熒光假單胞桿菌所分泌的胞外蛋白酶會引起纖溶酶從酪蛋白膠束解離到乳清相中，從而影響牛乳產(chǎn)品特性[32]，其中，熒光假單胞桿菌M3/6的蛋白酶還能激活纖溶酶原激活劑，使得尿激酶型激活劑催化活力增加4 倍，纖溶酶原衍生活力（纖溶酶原被激活為纖溶酶后酶活力的增加值）增加2.5 倍[33]。乳房鏈球菌在感染期間能分泌的PauA和PauB也表現(xiàn)出纖溶酶原激活劑的活性[34]。由大腸桿菌分泌的大腸桿菌素能夠有效抑制絲氨酸蛋白酶的水解作用，其對血液蛋白酶和尿激酶型纖溶酶原激活劑表現(xiàn)出抑制作用[35]。多黏芽孢桿菌分泌的蛋白酶能夠水解纖溶酶原，形成類似纖溶酶的水解活性[36]。

3.3 加工工藝

如前所述，二硫鍵在維持纖溶酶、酶原及其激活劑的空間構(gòu)象和催化活性方面起著重要作用。β-lg是牛乳乳清蛋白的主要成分，其受熱變性后釋放游離巰基，通過分子間二硫鍵交聯(lián)來抑制纖溶酶活性，而天然的β-lg對纖溶酶也表現(xiàn)出抑制作用；對β-lg的游離巰基進行修飾后，其對纖溶酶的抑制作用消失[6]。在同樣的加熱條件下，隨著體系中β-lg含量的增加，纖溶酶和纖溶酶原的殘留活性逐漸降低[37]。有研究認為，β-lg通過二硫鍵交換與纖溶酶原結(jié)合形成復(fù)合物，降低了酶原與尿激酶型激活劑之間的親和力，抑制酶原激活過程[38]。乳清蛋白表現(xiàn)出對纖溶酶原激活劑活性的促進作用，天然、變性的α-la處理組以及變性β-lg處理組的酶原激活速率常數(shù)分別是對照組的7.07、2.85 倍和2.27 倍[39]。總之，乳清蛋白對纖溶酶系的影響與乳清蛋白種類、變性程度和數(shù)量有關(guān)；而完整的酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)能夠發(fā)揮位阻效應(yīng)，保護纖溶酶免受β-lg的抑制作用[40]。加工工藝對纖溶酶體系的影響與乳清蛋白和酪蛋白膠束變化均有關(guān)系。

3.3.1 熱處理

由于纖溶酶系組分的耐熱性有所不同，不同加熱條件下，最終所表現(xiàn)出的纖溶酶活性會有所不同。巴氏殺菌（75 ℃、15 s）條件下，纖溶酶抑制劑耐熱性優(yōu)于纖溶酶原激活劑抑制因子，兩者的失活率分別為35.8%和81.1%[41]。巴氏殺菌熱處理（72～75 ℃、15 s）或直接UHT前的預(yù)處理（80～85 ℃、30 s）可滅活牛乳中的纖溶酶原激活劑抑制因子和纖溶酶抑制劑，減少對酶原激活的抑制和纖溶酶的抑制作用，使得牛乳在貨架期內(nèi)的纖溶酶活性上升[11,41-42]。

相比之下，纖溶酶、酶原及其激活劑的耐熱性較高（表3）。生乳中纖溶酶原質(zhì)量濃度為0.8～2.8 μg/mL，是纖溶酶（0.1～0.7 μg/mL）的2～30 倍[43]。巴氏殺菌乳中纖溶酶原和纖溶酶的質(zhì)量濃度分別為0.55～2.75 μg/mL和0.14～0.73μ g/mL[6,44]。生乳中纖溶酶活力為7.4～18.6 U/mL，經(jīng)過巴氏殺菌后，牛乳中纖溶酶活力下降約25%左右[25]。纖溶酶的活性在不同的溫度區(qū)間段表現(xiàn)不同：纖溶酶原的變性溫度為50～62 ℃，此溫度區(qū)間內(nèi)加熱，部分環(huán)餅狀結(jié)構(gòu)域展開造成構(gòu)象改變，暴露出Lys77-Arg78，使得纖溶酶原更容易被激活[38]；纖溶酶從65～70 ℃開始逐漸滅活；巴氏殺菌加熱段區(qū)間（75～85 ℃）纖溶酶及其酶原的失活被纖溶酶原激活所掩蓋；在90 ℃左右，纖溶酶活性迅速降低；而95 ℃以上時，纖溶酶活性緩慢降低[11]。溫度低于90 ℃時，酶活性呈現(xiàn)出溫度依賴性；溫度高于90 ℃，酶活性與加熱維持時間有關(guān)[11]。纖溶酶在90 ℃上下表現(xiàn)出不同的變化可能涉及不同的滅活機制，這與β-lg中活性巰基對纖溶酶及其酶原的影響有關(guān)[37]。溫度在低于和高于90～95 ℃各溫度段中，β-lg變性的限速反應(yīng)分別為肽鏈展開和蛋白聚集[45]，這與纖溶酶活性隨溫度變化的趨勢相印證。與組織型激活劑相比，尿激酶型激活劑的催化活性更高[46]，更耐受熱加工，其熱穩(wěn)定性甚至高于纖溶酶和纖溶酶原[37]，75～85 ℃、15～30 s加熱條件下，纖溶酶原激活劑失活率在50%～75%之間[47]。

表3 纖溶酶、纖溶酶原和纖溶酶原激活劑的滅活動力學參數(shù)[37]Table 3 Inactivation kinetic parameters of plasmin,plasminogen and plasminogen activator[37]

直接式UHT牛乳中，纖溶酶和纖溶酶原的滅活率分別為80%和60%；而間接式UHT工藝中，緩慢的加熱和冷卻過程導(dǎo)致了較高的纖溶酶及其酶原滅活率，分別為100%和80%[11]。為了保證貨架期內(nèi)直接UHT產(chǎn)品的穩(wěn)定性，可以加入UHT前的預(yù)熱步驟，例如90 ℃加熱180 s，這可以導(dǎo)致乳中99.7%纖溶酶滅活[11]。

3.3.2 高壓

當高壓加工壓力小于300 MPa時，牛乳中纖溶酶活力降低幅度低于10%；但當加工壓力為400 MPa時，纖溶酶活力殘留70%～75%；加工壓力為600 MPa時，纖溶酶殘留活力為25%～36%，并且隨著加工時間的延長，殘留活力會逐漸降低[48]。室溫條件下400 MPa的壓力使得纖溶酶原衍生活力降低20%～30%；高壓導(dǎo)致酪蛋白膠束崩解，纖溶酶原和纖溶酶均釋放到乳清相中，盡管結(jié)構(gòu)破壞的酪蛋白更易被纖溶酶水解，然而釋放到乳清相中的纖溶酶也更容易被抑制劑所抑制，因此高壓處理并未導(dǎo)致酪蛋白水解程度的增加[49]。室溫下600 MPa高壓處理的纖溶酶活性并未降低，而較高溫度下的高壓處理會促進纖溶酶失活：與室溫處理相比，60 ℃高壓加工纖溶酶的失活率達到86.5%[50]。與β-lg相比，纖溶酶及其酶原對加工壓力的耐受性較高，壓力低于600 MPa的加工條件下纖溶酶失活率低于50%，壓力低于500 MPa的加工下纖溶酶原失活率低于20%，牛乳中殘留的纖溶酶活力和β-lg含量呈現(xiàn)類似邏輯斯蒂曲線[51]。

傳統(tǒng)的均質(zhì)加工也能降低纖溶酶活力（降幅達4 0%～4 6%）和纖溶酶原衍生活力（降幅達46%～54%）：隨著均質(zhì)壓力（50～100 MPa）的提高，纖溶酶活性滅活率提高；此外，分段高壓均質(zhì)比單階段的高壓均質(zhì)滅活率更高[52]。

3.3.3 膜濃縮

利用超濾膜濃縮牛乳生產(chǎn)乳酪時，天然乳清蛋白被濃縮，纖溶酶活性受到抑制，β-和α-CN的水解程度降低[53]。當用滲濾去除乳清蛋白后，纖溶酶的濃縮比顯著高于纖溶酶原、酪蛋白或脂肪；滲濾過程中纖溶酶原和纖溶酶抑制劑的濃縮影響了纖溶酶的活性，β-lg和α-la濃度下降時，纖溶酶活性增加，纖溶酶活性與β-lg和α-la的濃度間接相關(guān)[54]。

3.4 貯存條件

熱處理后纖溶酶原的激活通常發(fā)生在貨架期內(nèi)，纖溶酶活力需要3 d至數(shù)周時間達到最大[55-56]；隨著貯存時間的延長，纖溶酶因自水解或活性的不可逆抑制而出現(xiàn)活性下降[11]。但也有學者報道，直接UHT牛乳在貨架期（10～120 d）內(nèi)纖溶酶活性伴隨著αs1-CN含量的下降而增加[57]。低溫貯存時，β-CN和纖溶酶會從酪蛋白膠束中解離出來，纖溶酶的自水解起主導(dǎo)作用，5 d內(nèi)纖溶酶活力下降20%；而37 ℃貯存時，纖溶酶原的激活作用在2 d內(nèi)占主導(dǎo)作用，4～10 d后纖溶酶活力由于自水解作用而下降65%[58]。冷藏時溫度越低，酪蛋白膠束中膠體磷酸鈣溶解增加，乳清相中Ca2+濃度增加，纖溶酶原的活化和纖溶酶活性增加，乳清Ca2+有可能通過競爭性抑制機制來影響纖溶酶原激活劑對酶原的親和力[59]。

牛乳中外源添加4、8、12 U/L的纖溶酶后，室溫條件下分別貯存5、4、3 周時便會出現(xiàn)凝膠，而在高溫貯藏條件下凝膠會提前1～2 周出現(xiàn)[13]。脫脂乳中添加2.5 U/L纖溶酶在37 ℃貯存3 周后，出現(xiàn)了鏈狀蛋白團聚和纖維狀蛋白橋，而在23 ℃條件下僅出現(xiàn)蛋白顆粒凝集；當外源纖溶酶添加量增加至15 U/L時，23 ℃貯存3 周后出現(xiàn)致密的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當貯存溫度升至37 ℃時，蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)解體[18]。

4 纖溶酶活力的檢測

纖溶酶的水解活力既可以通過檢測蛋白水解度及其水解產(chǎn)物來確定，也可以直接測定。可以通過檢測水解肽段、蛋白條帶以及pH 4.6下可溶非蛋白氮或游離氨基酸含量的變化來判定蛋白水解發(fā)生程度。有研究比較了三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）、反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、凝膠電泳和熒光胺4 種方法檢測纖溶酶水解牛乳的靈敏性：TNBS、熒光胺和RP-HPLC等方法對pH 4.6下可溶物和6%三氯乙酸可溶物中的檢測結(jié)果呈現(xiàn)較高的相關(guān)性（r＞0.93），凝膠電泳適用于定性分析，熒光胺的檢測限最低，RP-HPLC檢測靈敏度最高，從檢測準確性、可靠性和便捷程度考慮，推薦TNBS作為常規(guī)實驗室檢測纖溶酶活力的方法[60]。高分辨超聲光譜也被用于開發(fā)檢測纖溶酶誘導(dǎo)的β-CN水解，非線性反應(yīng)曲線與經(jīng)典的逆米氏模型曲線趨于一致，當?shù)孜铴?CN質(zhì)量濃度在1.0～8.6 mg/mL范圍內(nèi)，曲線擬合所得的最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）分別為（6.30±2.21）×10－5mol/（kg·min）和（10.33±3.50）mg/mL；當β-CN質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，最大斷裂肽鍵數(shù)為5～6（水解度2.7%）[61]。纖溶酶原的檢測方法與纖溶酶相一致，先檢測樣品中纖溶酶活力，然后向樣品中加入酶原激活劑進行孵育，孵育后再次進行纖溶酶活力檢測，兩次纖溶酶活力檢測值之差即為纖溶酶原衍生活力[6]。有研究將夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）應(yīng)用于乳中纖溶酶及其酶原的檢測，方法的線性范圍低至5～75 ng/mL，變異系數(shù)為5%～8%，不需要預(yù)處理即可檢測，且與其他乳蛋白不存在交叉反應(yīng)，但由于酪蛋白的干擾作用，檢測準確率較低（60%～90%）[62]。為避免酪蛋白的干擾，可以用檸檬酸鈉或ε-氨基己酸將纖溶酶解離到乳清中進行測定；為避免乳清中纖溶酶抑制劑對纖溶酶活力檢測的影響，可以用超速離心將酪蛋白和乳清蛋白分離后再檢測[6]。表4列出最近關(guān)于纖溶酶檢測生物傳感器的報道，均是基于纖溶酶對底物的特異性剪切，通過引起光、電、機械振動或表面張力等信號的變化進行檢測，檢測限可以達到0.032～0.860 nmol/L。

表4 檢測牛乳纖溶酶含量的生物傳感器研究匯總Table 4 Summary of biosensors for milk plasmin detection

5 結(jié)語

纖溶酶是牛乳中最主要的內(nèi)源蛋白酶，其對液體乳產(chǎn)品質(zhì)量有著重要的影響。巴氏殺菌乳在低溫下冷藏且銷售周期短，間接UHT產(chǎn)品中纖溶酶滅活程度較高，兩類產(chǎn)品出現(xiàn)纖溶酶誘導(dǎo)的老化凝膠風險較低；而直接UHT產(chǎn)品中蛋白變性程度較低，纖溶酶殘留活性較高。隨著消費者對乳中活性物質(zhì)關(guān)注度的上升，活性蛋白保留成為了乳品工藝改良的新方向。乳清蛋白和美拉德反應(yīng)對纖溶酶活性具有抑制作用，因此，如何在最大程度保留活性蛋白和減少美拉德反應(yīng)的同時，抑制纖溶酶的水解作用，成為了乳品加工工藝優(yōu)化，特別是直接UHT工藝改良的重要課題。目前纖溶酶的檢測方法主要在實驗室研究階段，生物傳感器等快速檢測方法離商業(yè)應(yīng)用尚有一段距離，開發(fā)纖溶酶的快速檢測方法對于產(chǎn)品的線下檢測和快速診斷有著重要的意義。因此，針對纖溶酶的滅活工藝優(yōu)化和快速檢測應(yīng)該成為乳業(yè)研究的重要課題，而纖溶酶的調(diào)控和作用機制也需進一步明確，為保證牛乳產(chǎn)品質(zhì)量夯實理論基礎(chǔ)。