納米二氧化硅的肺毒性的研究進(jìn)展

戴春 黃云超 周永春

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米二氧化硅（nanoparticles silicon dioxide, nano-SiO2）作為納米材料中的重要一員，其應(yīng)用已擴(kuò)展到疾病生物標(biāo)記、生物運(yùn)輸載體、DNA運(yùn)輸載體等諸多領(lǐng)域。在日常生活中nano-SiO2也無處不在，其不但是新興材料包括塑料、橡膠、陶瓷、涂料、粘合劑等的主要成分，也是煤、石油等礦物質(zhì)燃燒的產(chǎn)物[1]。人類在nano-SiO2懸浮環(huán)境中的暴露可分為職業(yè)暴露和自然暴露。職業(yè)暴露包括陶瓷、橡膠、裝潢等行業(yè)從業(yè)人員的暴露；自然暴露包括煤、石油燃燒的產(chǎn)物、空氣污染等。nano-SiO2進(jìn)入人體產(chǎn)生肺毒性主要經(jīng)過呼吸道，晶體SiO2可導(dǎo)致矽肺，肺癌等肺部疾病，對(duì)肺部的損傷毋庸置疑[2]，但SiO2與肺部腫瘤的相關(guān)性尚不明確。在1997年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer, IARC）把SiO2界定為人類的致癌因子[3]。但這個(gè)結(jié)論仍存在爭議，因?yàn)楫?dāng)時(shí)對(duì)暴露在SiO2環(huán)境中的人群進(jìn)行的研究未排除吸煙和其他致癌因子等干擾因素的影響。而在歐洲7個(gè)國家聯(lián)合進(jìn)行的INCO Copernicus study研究[4]提示人類暴露在SiO2環(huán)境中可明顯提升肺癌的發(fā)病率，鑒于該項(xiàng)研究全面考慮了潛在的混雜因素，如吸煙和職業(yè)暴露，因此更具說服性。但由于SiO2與肺部腫瘤的相關(guān)性及其機(jī)制仍不明確，該領(lǐng)域成為近年來的研究熱點(diǎn)。本文通過對(duì)納米顆粒的概述及nano-SiO2的性狀描述、環(huán)境分布和致癌機(jī)制等方面的綜述，以期為nano-SiO2肺毒性的相關(guān)研究提供參考。

1 納米顆粒的肺毒性與進(jìn)入人體的途徑

1.1 納米顆粒的肺毒性概述 納米顆粒是一種大小不超過100 nm的微型顆粒，在自然界中以乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒等形式呈現(xiàn)?，F(xiàn)今納米顆粒正越來越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、防曬化妝品中，而環(huán)境中也懸浮大量的納米顆粒物。由于粒徑較小，納米顆粒能夠滲透到細(xì)胞中，并沿神經(jīng)細(xì)胞突觸、血管和淋巴血管傳播。與此同時(shí)，納米顆粒有選擇性地積累在不同的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。納米顆粒的強(qiáng)滲透性不僅僅為藥物的使用提供了可能性，同時(shí)，也對(duì)人體健康構(gòu)成了威脅。2009年8月19日中國研究人員在“周三報(bào)告”中顯示，在納米涂料廠工作數(shù)月的多名中國年輕女性在沒有適當(dāng)保護(hù)措施的情況下罹患了永久性肺損傷，其中有兩人死亡，這項(xiàng)研究首次記錄了納米技術(shù)對(duì)人類造成的健康損傷，檢查發(fā)現(xiàn)，在這些女工的工作場(chǎng)所、支氣管肺泡灌洗液、胸水和肺活檢組織中均找到直徑為30 nm的顆粒。Cha等[5]通過體外試驗(yàn)和大鼠的體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)納米級(jí)鋅（nano-Zn）、鐵（nano-Fe）、硅（nano-Si）的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果肯定了這三種納米顆粒的細(xì)胞毒性。該實(shí)驗(yàn)采用的體外試驗(yàn)細(xì)胞分別是肝細(xì)胞（Huh-7）、腦細(xì)胞（A-172）、胃細(xì)胞（MKN-1）、肺細(xì)胞（A-549）和腎細(xì)胞（HEK293），納米顆粒分別是Zn（300 nm）、Fe（100 nm）以及Si（10 nm-20 nm, 40 nm-50 nm, 90 nm-110 nm）。將這些細(xì)胞分別置入到納米顆粒的環(huán)境中72 h后通過Mヰ比色法測(cè)量其細(xì)胞中線粒體的活性和DNA的含量，結(jié)果顯示在不同納米顆粒環(huán)境中線粒體活性與對(duì)照組相比均明顯下降，同時(shí)伴隨DNA含量出現(xiàn)0%-20%的下降，尤其在肝細(xì)胞和腦細(xì)胞中下降較胃細(xì)胞和肝細(xì)胞更明顯，通過大鼠體內(nèi)試驗(yàn)也得出了相同的結(jié)論。由此可見納米顆粒對(duì)細(xì)胞的殺傷作用是客觀存在的，但至今仍缺乏納米顆粒對(duì)人體健康危害的充分研究，其具體致病過程尚未闡明。

1.2 納米顆粒進(jìn)入人體的途徑 納米顆粒存在于大氣環(huán)境中，其主要通過以下途徑進(jìn)入人體產(chǎn)生損害。

1.2.1 呼吸系統(tǒng) 呼吸道是納米顆粒進(jìn)入人體的主要途徑[6]，納米顆?？梢詰腋∮诳諝猱?dāng)中，且其擴(kuò)散速度與納米顆粒的直徑成反比，在空氣中漂浮的時(shí)間越長，被機(jī)體吸入的機(jī)會(huì)也就越多。研究[7]發(fā)現(xiàn)納米顆粒可在動(dòng)物的呼吸道各部位及肺泡內(nèi)沉積，雖然被吸入體內(nèi)的納米顆粒質(zhì)量濃度并不高，但由于其粒徑極小、數(shù)量大，從而為納米顆粒致肺臟損傷提供了可能。

1.2.2 消化系統(tǒng) 消化道也是納米顆粒進(jìn)入人體的重要途徑之一，由于納米材料在食品及藥品中廣泛應(yīng)用，也為其通過消化系統(tǒng)進(jìn)入人體提供了可能；此外，吸入的納米顆粒也可通過人體的吞咽動(dòng)作進(jìn)入胃腸道。經(jīng)消化道進(jìn)入人體的納米顆粒大部分可通過糞便排出體外，但少量的納米顆?？杀幌勒衬の眨M(jìn)入消化道毛細(xì)淋巴管，再引起胃腸道粘膜細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)其也通過粘膜下層進(jìn)入毛細(xì)血管網(wǎng)并到達(dá)全身各組織器官形成再次分布[8]。

1.2.3 皮膚 皮膚是人體阻擋外界的物理和化學(xué)刺激的重要屏障系統(tǒng)，對(duì)絕大部分損傷物質(zhì)具有初始隔離作用，但納米顆粒由于粒徑微小，經(jīng)簡單擴(kuò)散或滲透等形式既可通過皮膚角質(zhì)層進(jìn)入皮下組織進(jìn)而被人體吸收[9]。大氣及生產(chǎn)環(huán)境中的納米顆粒是與皮膚接觸的主要途徑，而納米材料在化妝品、紡織品及藥物等領(lǐng)域的應(yīng)用同樣增加了納米顆粒通過皮膚進(jìn)入人體的機(jī)會(huì)。

1.2.4 血液系統(tǒng) 納米材料在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用，也為其提供了進(jìn)入人體新的途徑。如醫(yī)學(xué)影像技術(shù)、藥物的緩釋控釋、靶向載藥、腫瘤的診斷及治療等方面的應(yīng)用，都增加了納米顆粒通過靜脈血液系統(tǒng)進(jìn)入人體的機(jī)會(huì)[10]。由于納米材料粒徑較小、理化性質(zhì)特殊，進(jìn)入人體后不易控制等原因，故此種途徑進(jìn)入人體后其危險(xiǎn)性不容忽視。

由此可知，納米顆粒包括nano-SiO2主要通過呼吸道、消化道、皮膚進(jìn)入機(jī)體，并可以通過各種途徑進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)而后分布到全身，到達(dá)潛在的敏感靶位點(diǎn)，進(jìn)而產(chǎn)生一系列致病作用。這些也成為近年對(duì)納米顆粒肺毒性的研究熱點(diǎn)和防治重點(diǎn)。

2 nano-SiO2的性質(zhì)及其暴露的環(huán)境

2.1 nano-SiO2的性質(zhì) nano-SiO2是一種直徑介于1 nm-100 nm之間的SiO2粒子，因早期研究認(rèn)為其對(duì)生命體不會(huì)造成直接的危害而被認(rèn)為是安全的納米生物材料，已被廣泛用于疾病診斷、生物分析和成像、藥物載體等研究中[11]。由于nano-SiO2的性質(zhì)與其他材料不同，從而導(dǎo)致它具有不同的物理和化學(xué)特性。nano-SiO2有很高的表面積，該特性能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)nano-SiO2的吸收，從而對(duì)肺、大腦、骨髓、淋巴結(jié)和心臟產(chǎn)生細(xì)胞、亞細(xì)胞、蛋白質(zhì)和基因水平的損害。由于這些潛在的毒性作用，nano-SiO2對(duì)人類健康的影響正是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域。

2.2 nano-SiO2的暴露環(huán)境 日常生活中nano-SiO2存在于油漆、涂料、塑料、合成橡膠、粘合劑及密封劑中，亦存在于煤、石油等礦物質(zhì)的燃燒產(chǎn)物中。男性從事磚瓦工、木匠和建筑工人等職業(yè)都暴露于SiO2粉塵，這些職業(yè)暴露因素都增加了肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且這些因素和吸煙對(duì)肺癌的影響是獨(dú)立的。一項(xiàng)歐洲的多中心研究（multicentre casereferent study）發(fā)現(xiàn)，綜合考慮了性別、年齡等因素后暴露于SiO2粉塵中的非吸煙者的癌癥發(fā)病率顯著提高[12]。1979年-2006年印度的肺癌流行病學(xué)研究也顯示：暴露在二氧化硅環(huán)境中的患者肺癌的發(fā)病率接近普通未暴露在SiO2環(huán)境中患者肺癌發(fā)病率的兩倍[13]。而在國內(nèi)，中國云南省宣威地區(qū)是世界非吸煙女性肺癌發(fā)病率最高的地區(qū)之一，既往研究[14,15]表明，宣威地區(qū)女性肺癌高發(fā)與當(dāng)?shù)亻_采和使用的C1煙煤及其燃燒產(chǎn)物（底灰和煙塵）中含有的大量超細(xì)SiO2顆粒物緊密聯(lián)系，目前該課題組正在深入探討其作用機(jī)制。

由此可見nano-SiO2不僅存在于生物材料中，其也在自然界中廣泛分布。所以人體不僅在職業(yè)生產(chǎn)過程中會(huì)暴露于SiO2環(huán)境中，其在日常生活中也會(huì)暴露于SiO2環(huán)境中，加之nano-SiO2顆粒直徑小，可懸浮在空氣中，從而增加了人體的暴露風(fēng)險(xiǎn)。以上實(shí)驗(yàn)也同時(shí)證明了nano-SiO2的肺毒性。

3 nano-SiO2致病機(jī)理的研究進(jìn)展

目前對(duì)nano-SiO2的肺毒性的致病機(jī)理的研究主要集中在細(xì)胞水平和基因水平。細(xì)胞水平主要是破壞細(xì)胞膜、損傷細(xì)胞器及改變細(xì)胞的生長周期而基因水平的損傷則主要通過氧化應(yīng)激系統(tǒng)（reactive oxygen species, ROS）損傷遺傳物質(zhì)。

3.1 細(xì)胞水平危害的相關(guān)研究 納米級(jí)SiO2很容易進(jìn)入細(xì)胞膜，并在細(xì)胞質(zhì)中積累，從而破壞細(xì)胞的新陳代謝、誘導(dǎo)細(xì)胞功能障礙、癌變、甚至死亡[16-18]。nano-SiO2對(duì)細(xì)胞的損害已得到大量實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，而nano-SiO2的直徑是否與其損傷程度成相關(guān)性，不同的學(xué)者得到了不同的結(jié)論。

Kasper等[19]通過檢測(cè)細(xì)胞毒性因子以及炎癥反應(yīng)因子來測(cè)定不同大小nano-SiO2（30 nm, 70 nm, 300 nm）對(duì)肺上皮細(xì)胞NCI H441細(xì)胞株和內(nèi)皮細(xì)胞的ISO-HAS-1細(xì)胞的毒性作用，研究顯示flotillin蛋白介導(dǎo)了細(xì)胞對(duì)nano-SiO2的吞噬。在該項(xiàng)研究中，去除flotillin蛋白的H441細(xì)胞對(duì)不定形nano-SiO2的吸收明顯減少，與對(duì)照組相比，去除flotillin蛋白的細(xì)胞暴露在nano-SiO2環(huán)境中的生存率也明顯下降；同時(shí)該研究也證實(shí)了納米顆粒大小對(duì)細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即納米顆粒的直徑越小對(duì)細(xì)胞造成有害影響就越大。

Duan等[20]通過實(shí)驗(yàn)及形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過15 nm、30 nm、100 nm和微米級(jí)SiO2粒子10 g/mL接觸24 h的HaCaT細(xì)胞的生長明顯被抑制，細(xì)胞失去細(xì)胞壁變得萎縮，甚至死亡，被15 nm和30 nm SiO2浸潤的細(xì)胞比微粒SiO2浸潤的細(xì)胞形態(tài)的變化更明顯。此外，有研究[21]也顯示：SiO2誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可以通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起細(xì)胞膜損傷。值得一提的是，有研究測(cè)定了暴露在無定形納米（10 nm、80 nm）SiO2中48 h的A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性（通過MMT和LDH測(cè)定）和氧化應(yīng)激反應(yīng)（ROS水平，膜脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽水平和活動(dòng)的谷胱甘肽代謝酶），結(jié)果提示：nano-SiO2主要通過ROS和膜脂質(zhì)過氧化作用對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，而不是消耗谷胱甘肽（glutathione, GSH）[22]。也有相反的研究不支持nano-SiO2粒徑與肺損傷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，如Cha等[5]用MTT比色法測(cè)量了暴露在nano-SiO2環(huán)境中肺細(xì)胞的活性，但結(jié)果提示10 nm-20 nm、40 nm-50 nm、90 nm-110 nm的SiO2均可使肺細(xì)胞發(fā)生不同程度的損傷，而損傷程度與nano-SiO2的直徑無直接關(guān)系。

綜上所述，nano-SiO2對(duì)機(jī)體的毒作用機(jī)制有氧化損傷及炎癥反應(yīng)、影響細(xì)胞凋亡改變細(xì)胞周期、細(xì)胞膜毒性以及DNA損傷等多個(gè)方面。雖然國內(nèi)外已有相關(guān)研究，但對(duì)nano-SiO2顆粒如何進(jìn)入線粒體并導(dǎo)致線粒體損傷的機(jī)理，以及等劑量同濃度的不同顆粒直徑的納米顆粒對(duì)機(jī)體毒性作用等方面還有待深入研究。

3.2 基因水平危害的相關(guān)研究 有研究[23]顯示nano-SiO2可對(duì)細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、增殖，在一定條件下可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，也可造成主要靶器官肺臟及脾臟的損傷。nano-SiO2的基因毒性主要由炎癥反應(yīng)中的ROS途徑介導(dǎo)，加之染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變異、溶酶體釋放脫氧核糖核酸酶，從而產(chǎn)生了損傷細(xì)胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的復(fù)雜誘導(dǎo)物[24]。

Musa等[25]通過彗星實(shí)驗(yàn)和小鼠淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（mouse lymphoma assay, MLA）檢測(cè)了小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞和人肺支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）在nano-SiO2環(huán)境下的基因毒性，結(jié)果提示nano-SiO2能夠引起細(xì)胞毒性和初級(jí)DNA損傷而不會(huì)導(dǎo)致染色體水平的刪除及變異Gerloff等[26]將結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞模型）暴露在nano-SiO2中24 h后可引起DNA的損傷和總GSH的耗竭，并最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

Cha等[5]測(cè)量暴露在nano-SiO2環(huán)境中細(xì)胞核DNA的含量（將具有熒光性的雙苯酰亞胺H33258植入到染色體中從而測(cè)量DNA的含量），其結(jié)果提示10 nm-20 nm、40 nm-50 nm、90 nm-110 nm的SiO2均可使DNA發(fā)生改變。

以上研究提示：體積小和高表面積的nano-SiO2能導(dǎo)致難以預(yù)測(cè)的基因毒性，人體的氧化應(yīng)激系統(tǒng)參與了nano-SiO2對(duì)人體遺傳物質(zhì)的損傷，而且不同粒徑的nano-SiO2對(duì)DNA的損傷程度存在差異，而在細(xì)胞代謝、信號(hào)通路及與其他物質(zhì)伴隨作用等方面的機(jī)制仍具有廣泛的研究前景。

4 nano-SiO2的肺毒性的研究總結(jié)及展望

nano-SiO2廣泛存在于油漆、涂料、塑料、合成橡膠、粘合劑及密封劑中，亦存在于煤、石油等礦物質(zhì)的燃燒產(chǎn)物中，可通過呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等途徑對(duì)人體產(chǎn)生損傷，其與肺癌的相關(guān)性已經(jīng)得到肯定[27]，但具體致癌機(jī)制尚不清楚。如：Kasper等[19]對(duì)flotillin蛋白介導(dǎo)nano-SiO2的內(nèi)吞作用提出了假設(shè)，但未對(duì)其具體過程進(jìn)行論證。Cha等[5]通過對(duì)染色體的測(cè)定也觀察到nano-SiO2對(duì)基因有明顯的損傷，但也未闡明其損傷機(jī)制。這些都為我們研究nano-SiO2對(duì)人體呼吸系統(tǒng)的損害機(jī)制提供指導(dǎo)和切入點(diǎn)。