miR-614通過調(diào)控靶基因PSA表達(dá)抑制人肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力

律方 薛奇

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，而造成患者死亡的主要原因是發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，有效地控制肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移已成為當(dāng)前肺癌研究和治療的重要課題和難題。微小RNA（microRNA, miRNA）是一類長約22 nt的非編碼內(nèi)源性小RNA，可以與基因mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合，起到在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的作用[1,2]。

近年來，研究者們[3-6]發(fā)現(xiàn)miRNA在調(diào)控腫瘤分化、生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。已有研究[7]發(fā)現(xiàn)多種miRNA可通過不同的途徑調(diào)控肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，如miR-126、miR-183和let-7可分別通過作用于其各自的靶基因調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力[8-12]。因此，深入研究不同miRNAs家族成員對肺癌的作用對于闡明miRNAs在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的機(jī)制具有重要意義。

在前期研究工作中，我們應(yīng)用miRNA表達(dá)譜芯片檢測了具有高低不同轉(zhuǎn)移能力的肺癌細(xì)胞株P(guān)GCL3和PGLH7細(xì)胞，芯片結(jié)果顯示miR-614在PGCL3中低表達(dá)。因此，在本研究中，我們應(yīng)用實(shí)時定量PCR方法，驗證miR-614在PGCL3和PGLH7細(xì)胞中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步探討miR-614對肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用及其可能機(jī)制，為后續(xù)基于miRNAs的肺癌臨床生物治療的新靶點(diǎn)開發(fā)提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及細(xì)胞株 miRNA提取試劑盒（mirVana RNA Isolation Kit）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Taqman miRNA Reverse Transcripation Kit）、熒光實(shí)時定量PCR試劑盒（Taqman Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG）和內(nèi)參RNU6B MGB探針標(biāo)記的引物均購于美國ABI公司。miR-614類似物Pre-miR-614 mimics、抑制劑Anti-miR-614 inhibitor、miR-614類似物陰性對照Pre-miR-614 mimics control和抑制劑陰性對照Anti-miR-614 inhibitor control均購于美國ABI公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。人源性肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株P(guān)GCL3和PGLH7細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司，胎牛血清購于Gibco公司。CCK-8試劑盒購于南京凱基生物有限公司。5-溴2-脫氧尿苷（BrdU）、PI購于Sigma公司，BrdU單克隆抗體購于NeoMarkers，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗購于Sigma公司。Transwell小室購于Millipore公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和pMIR-GLO載體購于美國Promega公司。PSA、β-actin抗體購于Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的二抗購于Sigma公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人肺癌細(xì)胞株P(guān)GCL3和PGLH7細(xì)胞用含10%胎牛血清、1,000 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，于37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)，待單層細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，PBS沖洗1次后備用。將實(shí)驗細(xì)胞分為miR-614類似物轉(zhuǎn)染組、抑制物轉(zhuǎn)染組、類似物陰性對照轉(zhuǎn)染組、抑制物陰性對照轉(zhuǎn)染組和只加轉(zhuǎn)染試劑的空白對照組。細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞約50%-60%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔板加入25 pmol的類似物（抑制物及對照）和10 μL的轉(zhuǎn)染試劑，使模擬物的終濃度為10 pmol/mL，轉(zhuǎn)染后5 h換液。

1.3 miRNA的實(shí)時定量PCR檢測 收獲的細(xì)胞樣品按照ABI公司miRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時定量PCR試劑盒中說明書的方法進(jìn)行操作，以RNU6B作為內(nèi)參進(jìn)行相對定量，每組設(shè)置3個復(fù)孔，在 ABI 7500實(shí)時定量熒光PCR儀機(jī)器檢測。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗 將含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL加入Transwell的下室，在有預(yù)置Matrigel的上室中按照不同實(shí)驗分組分別加入經(jīng)消化處理的細(xì)胞不含血清的RPMI-1640稀釋的細(xì)胞懸液100 μL，置37oC、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去上層細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定15 min，并以0.5% Triton X-100處理3 min，蘇木素染核15 min。將培養(yǎng)小室倒置，在熒光倒置顯微鏡下觀察、照相，并每組隨機(jī)選取5個視野（200×）計數(shù)，取平均細(xì)胞數(shù)。

1.5 CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，每孔接種5,000個細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染1 d-6 d內(nèi)檢測。100 μL的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入10 μL的CCK8檢測試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔OD值，每組重復(fù)4次。相對增殖活力=處理組OD值/空白對照組OD值。

1.6 BrdU摻入實(shí)驗 將細(xì)胞接種在24孔平板中，轉(zhuǎn)染后換液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%匯合時在細(xì)胞中加10 μmol/L的BrdU，37oC下溫育4 h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，每次5 min。加入70%無水乙醇，4oC條件下固定10 min。棄去70%無水乙醇，PBS沖洗3次，每次5 min。加入2 mol/L的HCl，37oC下放置40 min，使細(xì)胞DNA變性。棄去HCl，PBS沖洗3次，每次10 min。在細(xì)胞上加入1.0%的BSA，在室溫條件下放置1 h，進(jìn)行封閉。PBS沖洗3次，每次5 min。吸干細(xì)胞表面的PBS，加入BrdU單克隆抗體（1:300稀釋，100 μL/孔），4oC條件下孵育過夜。次日加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗，在室溫條件下孵育2 h。用PI復(fù)染所有細(xì)胞的細(xì)胞核后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。隨機(jī)選擇10個非重疊視野（×100）計算BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，計算平均值。

1.7 生物信息學(xué)軟件靶基因預(yù)測 應(yīng)用在線生物信息學(xué)miRNA靶基因預(yù)測軟件miRanda（http://www.miRBase.org/）對miR-614的靶基因進(jìn)行預(yù)測。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測 克隆擴(kuò)增PSA基因的3’UTR區(qū)的全長，引物序列：Forward primer 5’-CACGAGCTCTA ATAAGGAAACATCヰTCATAGCC-3’，Reverse primer 5’-T TTCTCGAGTTCACATTGACATTTTTATTAACGC-3’，PCR產(chǎn)物克隆到pMIR-GLO（Promega）Luciferase基因下游的多克隆位點(diǎn)中，并針對生物信息學(xué)預(yù)測miR-614與嘌呤霉素敏感性氨肽酶基因的靶結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，表達(dá)海腎熒光素酶的pRL-TK載體用來作為內(nèi)參照調(diào)整細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異，miR-614類似物以及陰性對照分別和熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)入PGCL3細(xì)胞，按照Promega提供的方法進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測[13]。

1.9 Western blot 收集各實(shí)驗組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞后加入適量電泳上樣緩沖液，沸水中加熱10 min，在12%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜上，3%BSA在37oC條件下封閉2 h，分別加入鼠抗人PSA抗體（1:500）、鼠抗人β-actin抗體（1:500）4oC過夜，PBST洗滌3次，每次10 min：加HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1:4,000），37oC培育30 min，PBST洗3次，每次15 min。用化學(xué)發(fā)光試劑對膜進(jìn)行處理，于暗室中曝光、顯影與定影，并拍片記錄。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SD的方式顯示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-614在高轉(zhuǎn)移能力肺癌細(xì)胞中表達(dá)降低 實(shí)時定量PCR檢測高轉(zhuǎn)移能力肺癌細(xì)胞PGCL3和低轉(zhuǎn)移能力肺癌細(xì)胞PGLH7細(xì)胞中miR-614的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PGLH7細(xì)胞中miR-614的表達(dá)水平比PGCL3細(xì)胞中表達(dá)水平高（6.95±0.21）倍（P＜0.01），提示miR-614在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)降低可能與肺癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

圖1 miR-614對人肺癌細(xì)胞體外侵襲能力的影響。A：在PGCL3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 mimics和miR-614 mimics control，在PGLH7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor和miR-614 inhibitor control，應(yīng)用Transwell實(shí)驗檢測miR-614對肺癌細(xì)胞侵襲能力的作用；B：直方圖顯示侵潤的細(xì)胞數(shù)發(fā)生明顯變化，*P＜0.01。Fig 1 The effects of miR-614 on the invasion of human lung cancer cell lines in vitro. A: Lung cancer PGCL3 cells were transfected with miR-614 mimics and miR-614 mimics control and PGLH7 cells with miR-614 inhibitor and miR-614 inhibitor control and then subjected to tumor cell Transwell invasion assay; B: The histogram showed that the number of invasive cell was significantly changed. *P＜0.01.

2.2 miR-614表達(dá)異常改變了肺癌細(xì)胞的侵襲能力 為了進(jìn)一步證實(shí)miR-614能抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，我們用Transwell小室跨膜遷移實(shí)驗檢測了miR-614表達(dá)的異常對肺癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動能力的改變。在PGCL3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 mimics和miR-614 mimics control，在PGLH7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor和miR-614 inhibitor control。與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-614 mimics增加PGCL3細(xì)胞miR-614表達(dá)水平后，細(xì)胞侵襲運(yùn)動能力明顯降低（P＜0.01）；與之對應(yīng)，轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor降低PGLH7細(xì)胞miR-614表達(dá)水平后，細(xì)胞侵襲運(yùn)動能力明顯提高（P＜0.01）（圖1）。該結(jié)果表明，miR-614可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.3 miR-614表達(dá)異常改變了細(xì)胞的增殖能力 我們進(jìn)一步檢測了miR-614改變異常是否能夠影響細(xì)胞的增殖能力。在PGCL3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 mimics和miR-614 mimics control，在PGLH7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor和miR-614 inhibitor control。用CCK-8方法檢測細(xì)胞活力繪制增殖曲線，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor降低PGLH7細(xì)胞miR-614水平，與未處理組及陰性對照組相比，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）（圖2A）；與之對應(yīng)，轉(zhuǎn)染miR-614 mimics增加PGCL3細(xì)胞中miR-614的水平后，與未處理組及陰性對照組相比，細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.01）（圖2B）。我們又利用BrdU摻入實(shí)驗檢測了miR-614表達(dá)改變對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染miR-614 mimics增加PGCL3細(xì)胞miR-614水平后，細(xì)胞BrdU摻入明顯減少；與之對應(yīng)，轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor降低PGLH7細(xì)胞miR-614水平后，細(xì)胞BrdU摻入明顯增加（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，miR-614可抑制肺癌細(xì)胞的增殖。

2.4 嘌呤霉素敏感性氨肽酶是miR-614調(diào)節(jié)的下游靶基因 為了進(jìn)一步確定miR-614在肺癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)的下游靶基因，我們利用在線生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測發(fā)現(xiàn)嘌呤霉素敏感性氨肽酶的mRNA的3’UTR含有能和miR-614成熟序列結(jié)合的位點(diǎn)，提示PSA可能是miR-614的靶基因（圖4A）。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-614對肺癌細(xì)胞PSA表達(dá)的調(diào)節(jié)，我們檢測了肺癌細(xì)胞中miR-614和PSA表達(dá)水平之間的關(guān)系。在PGCL3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-614 mimics增加miR-614的表達(dá)水平后，與miR-614 mimics control組相比PSA蛋白表達(dá)明顯降低；在PGLH7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor降低miR-614的表達(dá)水平后，與miR-614 inhibitor control組相比PSA蛋白表達(dá)明顯增加（圖4B）。這一結(jié)果表明miR-614抑制了肺癌細(xì)胞中PSA的表達(dá)。為了進(jìn)一步明確miR-614通過與3’UTR結(jié)合調(diào)節(jié)PSA表達(dá)，我們構(gòu)建了含有PSA的3’UTR序列的熒光素酶報告基因表達(dá)載體WT-PSA，同時構(gòu)建了PSA 3’UTR區(qū)miR-614結(jié)合種子序列突變的載體Mut-PSA。PGCL3細(xì)胞中，表達(dá)野生型PSA的3’UTR序列的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-614 mimics上調(diào)miR-614的水平與轉(zhuǎn)染miRNA對照組相比熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01），說明miR-614抑制了熒光素酶的表達(dá)。轉(zhuǎn)染突變型PSA的3’UTR序列的細(xì)胞中，miR-614 mimics上調(diào)miR-614的水平與對照組相比熒光素酶活性無明顯差異，說明與miR-614是通過打靶并結(jié)合PSA的3’UTR來調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的（圖4C）。

圖2 CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞增殖能力。A：在PGLH7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor和miR-614 inhibitor control，應(yīng)用CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞活力；B：在PGCL3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 mimics和miR-614 mimics control，應(yīng)用CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞活力。Fig 2 The cell proliferation assay by CCK-8 kit. A: Lung cancer PGLH7 cells were transfected with miR-614 inhibitor and miR-614 inhibitor control for CCK-8 kit detection of cell viability; B: Lung cancer PGCL3 cells were transfected with miR-614 mimics and miR-614 mimics control for CCK-8 kit detection of cell viability.

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，而造成患者死亡的主要原因是肺癌很早就發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，有效地控制肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移已成為當(dāng)前肺癌研究和治療的重要課題和難題。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟的過程，是各種粘附分子、蛋白水解酶類、細(xì)胞因子和血管生成因子等多種因素共同參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。MicroRNA（miRNA）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類長度為18 nt-25 nt進(jìn)化上比較保守的、非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，它與靶基因mRNA 3’UTR區(qū)通過不完全配對結(jié)合抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，這類小分子物質(zhì)參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種重要細(xì)胞活動的調(diào)控[14,15]。近年來大量研究[16,17]表明，miRNAs與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移存在著密切關(guān)系。目前，與肺癌相關(guān)的miRNA研究也取得了一些進(jìn)展，但有哪些miRNA對肺癌發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用，其機(jī)制如何等等很多問題仍是未知的，還需要我們進(jìn)行大量全面、深入的研究工作。

在前期研究工作中，我們對具有高低不同轉(zhuǎn)移潛能的肺癌細(xì)胞株P(guān)GCL3和PGLH7細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析，篩選到了一些與肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的miRNA，其中miR-614在PGCL3細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于其在PGLH7細(xì)胞中表達(dá)水平，提示miR-614在肺癌細(xì)胞中的低表達(dá)可能與肺癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本研究中我們進(jìn)一步應(yīng)用real-time PCR方法在PGCL3和PGLH7細(xì)胞中驗證了miR-614的表達(dá)水平，其在高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞PGCL3中的表達(dá)水平明顯低于低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞PGLH7，與芯片檢測結(jié)果相吻合，提示miR-614高表達(dá)可能抑制肺癌細(xì)胞的侵襲。目前在國內(nèi)外研究中，還未見miR-614與肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的相關(guān)報道。為了研究miR-614是否影響肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，在本研究中，我們進(jìn)一步應(yīng)用Transwell實(shí)驗方法研究了miR-614對肺癌細(xì)胞侵襲的影響。實(shí)驗結(jié)果顯示，PGCL3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-614 mimics后細(xì)胞的穿膜能力明顯降低；PGLH7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor后細(xì)胞的穿膜能力明顯提高。表明miR-614可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲。

圖3 BrdU摻入實(shí)驗檢測細(xì)胞增殖能力。A：在肺癌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-614 mimics、miR-614 mimics control、miR-614 inhibitor和miR-614 inhibitor control，應(yīng)用BrdU摻入實(shí)驗檢測細(xì)胞增殖能力；B：直方圖顯示細(xì)胞增殖能力發(fā)生明顯變化，*P＜0.01。Fig 3 The cell proliferation determined by BrdU assay. A: Lung cancer cells were transfected with miR-614 mimics control, miR-614 mimics, miR-614 inhibitor control,or miR-614 inhibitor and subjected to BrdU incorporation assay; B:The histogram showed that the cell proliferation was significantly changed. *P＜0.01.

圖4 PSA是miR-614的靶基因。A：miRanda在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-614靶基因。B：miR-614對人肺癌細(xì)胞中PSA蛋白表達(dá)水平的影響。C：雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果。*P＜0.01。Fig 4 PSA as miR-614 targeting gene. A: Potential targeting gene of miR-614 predicted by miRanda online bioinformatics software; B: The effect of miR-614 on the protein expression of PSA on human lung cancer cell lines; C: Dual-luciferase reporter gene assay; *P＜0.01. PSA:puromycin-sensitive aminopeptidase.

為了全面了解miR-614對肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，我們進(jìn)一步應(yīng)用CCK8試劑盒和BrdU摻入方法研究了miR-614對肺癌細(xì)胞增殖的影響。Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。BrdU摻入方法也是一種很好的分析細(xì)胞周期的方法，并且其應(yīng)用范圍越來越廣泛。5-溴-2-脫氧尿苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）為DNA前體胸腺嘧啶核苷的類似物，在細(xì)胞增殖過程中，能選擇性的摻入到處于細(xì)胞周期S期（即DNA合成期）細(xì)胞的單鏈DNA核苷酸序列中。在活體中引用可示蹤DNA合成的前體物質(zhì)BrdU，使BrdU競爭性的替代胸腺嘧啶而摻入到增殖期的細(xì)胞中，成為細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志。摻入合成的BrdU的強(qiáng)度可直接顯示細(xì)胞增殖的能力，再取其相應(yīng)組織制作切片，應(yīng)用與BrdU特異反應(yīng)的單克隆抗體，對已完成了BrdU標(biāo)記的正?；虿±頎顟B(tài)下細(xì)胞的DNA復(fù)制進(jìn)行檢測，并可進(jìn)行定位觀察和統(tǒng)計學(xué)分析。我們研究發(fā)現(xiàn)，CCK-8和BrdU摻入方法實(shí)驗結(jié)果均顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-614 mimics后增殖能力減弱，轉(zhuǎn)染miR-614 inhibitor后增殖能力增強(qiáng)，表明miR-614可抑制肺癌細(xì)胞的增殖作用。

為了進(jìn)一步探討miR-614抑制肺癌細(xì)胞侵襲和增殖的作用機(jī)制，我們應(yīng)用在線生物信息學(xué)miRNA靶基因預(yù)測軟件miRanda對miR-614的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，軟件預(yù)測PSA可能為miR-614的靶基因。為了證明miR-614和PSA基因之間的調(diào)控關(guān)系，我們對肺癌細(xì)胞株進(jìn)行miR-614 mimics和inhibitor的轉(zhuǎn)染分別促進(jìn)和抑制miR-614的表達(dá)，并應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和Western印跡方法從基因和蛋白兩個水平驗證兩者之間的靶向調(diào)控關(guān)系，證明了miR-614可以直接調(diào)控PSA基因。目前，未見PSA在肺癌中作用的相關(guān)文獻(xiàn)報道，在后續(xù)研究中，我們將對PSA在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物功能進(jìn)行深入研究。并將進(jìn)一步研究在肺癌細(xì)胞中PSA作為miR-614的靶基因是否介導(dǎo)了miR-614對細(xì)胞侵襲和增殖能力的調(diào)節(jié)。

綜上所述，我們的研究表明肺癌細(xì)胞中miR-614的高表達(dá)抑制了細(xì)胞侵襲和增殖能力，PSA基因是miR-614調(diào)控的下游靶基因。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)深入探討miR-614在肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移中的作用及可能機(jī)制，以期為肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究以及臨床肺癌生物治療提供新的靶點(diǎn)。