十全育真湯對早期活動性強直性脊柱炎患者外周血Th17/Treg細胞平衡的影響

吳琪 秦桂福 鄭毅 宋玉

【摘 要】目的：觀察十全育真湯對早期活動性強直性脊柱炎患者疾病活動指標、Th17/Treg相關細胞因子、Th17/Treg細胞百分比，及相關基因RORC、FoxP3 mRNA表達的影響，初步從分子水平探討十全育真湯治療強直性脊柱炎的機制。方法：將60例強直性脊柱炎患者采用隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組，每組30例。治療組給予十全育真湯治療，對照組給予柳氮磺吡啶腸溶片治療。對2組患者治療前后疾病活動指標、Th17/Treg相關細胞因子水平、Th17及Treg亞群占CD4+T細胞百分比、RORC和

FoxP3mRNA基因表達進行統(tǒng)計分析。結果：治療后，2組視覺模擬評分法（VAS）評分、Bath強直性脊柱炎活動指數(shù)（BASDAI）、Bath強直性脊柱炎功能指數(shù)（BASFI）、Bath強直性脊柱炎總體指數(shù)（BAS-G）、紅細胞沉降率（ESR）、C-反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-8、IL-17均明顯降低，轉化生長因子-β（TGF-β）、IL-10水平均顯著升高（P < 0.05或

P < 0.01）；除BASDAI外，治療組上述指標均優(yōu)于對照組（P < 0.05或P < 0.01）。治療后，2組Th17亞群

CD4+CD45RO+CCR6+細胞百分比均明顯降低，治療組Treg亞群CD4+CD25+FoxP3+細胞百分比明顯升高

（P < 0.05或P < 0.01）；且治療組均優(yōu)于對照組（P < 0.05或P < 0.01）。治療后，2組RORC mRNA表達

顯著下降，F(xiàn)oxP3 mRNA表達顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）；且治療組優(yōu)于對照組（P < 0.05或P < 0.01）。結論：十全育真湯可顯著控制早期活動性強直性脊柱炎炎癥，減輕臨床癥狀，其機制可能與抑制促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17）表達，促進抑炎因子（TGF-β、IL-10）釋放，通過抑制RORC基因表達，促進FoxP3基因表達，調整Th17/Treg細胞數(shù)量，糾正Th17/Treg免疫失衡有關。

【關鍵詞】 強直性脊柱炎；早期；活動性；十全育真湯；Th17/Treg細胞；免疫穩(wěn)態(tài)調節(jié)

Effect of Shiquan Yuzhen Tang（十全育真湯）on Th17/Treg Cell Balance in Peripheral Blood of Patients with Early Active Ankylosing Spondylitis

WU Qi，QIN Gui-fu，ZHENG Yi，SONG Yu

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Shiquan Yuzhen Tang（十全育真湯）on disease

activity indicators，Th17/Treg related cytokines，Th17/Treg cell percentage，and expression of related genes RORC and FoxP3 mRNA in patients with early active ankylosing spondylitis，and preliminary explore the mechanism of Shiquan Yuzhen Tang in treating ankylosing spondylitis at the molecular level.Methods：Sixty patients

with ankylosing spondylitis were randomly divided into a treatment group and a control group，with

30 cases in each group.The treatment group was treated with Shiquan Yuzhen Tang，while the control group was treated with sulfasalazine enteric coated tablets.Statistical analysis was conducted on disease activity indicators，levels of Th17/Treg related cytokines，percentage of Th17

and Treg subsets in CD4+ T cells，and expre-

ssion of RORC and FoxP3 mRNA genes before and after treatment in both groups.Results：After treatment，VAS，BASDAI，BASFI，BAS-G，ESR，CRP，TNF- α，IL-6，IL-8，IL-17 were significantly reduced，and TGF-β and the levels of IL-10 significantly increased（P < 0.05 or P < 0.01）.Except BASDAI，the above indicators in the treatment group were better than those in the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.After treatment，the percentage of CD4+CD45RO+CCR6+ in the Th17 subgroup decreased significantly in both groups，while the percentage of CD4+CD25+FoxP3+ in the Treg subgroup increased significantly in the treatment group（P < 0.05

or P < 0.01）;and the treatment group was better than the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.After treatment，the expression of RORC mRNA decreased significantly in both groups，while the expression of FoxP3 mRNA increased significantly（P < 0.05 or P < 0.01）;and the treatment group was superior to the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.Conclusion：Shiquan Yuzhen Tang can significantly control the inflammation of early active ankylosing spondylitis and alleviate clinical symptoms，and its mechanism may be related to the inhibition of inflammatory factors（TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17）expression，promoting the release of anti-inflammatory factors TGF-β and IL-10，promoting FoxP3 gene expression by inhibiting RORC gene expression，adjusting Th17/Treg cell count，and correcting Th17/Treg immune imbalance.

【Keywords】 ankylosing spondylitis;early;activity;Shiquan Yuzhen Tang（十全育真湯）;Th17/Treg cells;

immune homeostasis regulation

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）好發(fā)于40歲以下青壯年男性，國內發(fā)病率為0.23%［1］。

由于本病早期臨床癥狀及實驗室檢查缺乏特異性，晚期出現(xiàn)不可逆性脊柱融合僵直是青壯年致殘的重要原因［2］，有報道提示早期干預是治療AS的關

鍵［3-4］。目前，治療目的不再是單純地緩解癥狀，而是阻止疾病發(fā)展［5］。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細胞17

（Th17）/調節(jié)性T細胞（Treg）比例失衡在AS發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用，調整Th17細胞和Treg細胞亞群的免疫格局成為治療AS的重要靶點［6］。

十全育真湯出自張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》，主治陰虛勞熱，為氣陰兩傷兼血瘀型虛勞而設，“虛”與“瘀”為其主要病機?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，十全育真湯具有抗腫瘤、抗衰老、調節(jié)免疫功能，清除氧自由基等作用［7-8］。本研究測定血清中Th17相關細胞因子含量，檢測外周血Th17/Treg細胞表型比例，研究十全育真湯對RORC、FoxP3 mRNA表達的影響，探討其對Th17/Treg免疫穩(wěn)態(tài)的調控作用，為十全育真湯臨床治療AS提供理論依據。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2020年1月至2022年1月在湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院就診的早期活動性AS患者60例，采用隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組，每組30例。治療組男18例，女12例；年齡18～56歲，平均（37.85±8.36）歲；病程1～6年，平均（2.61±0.94）年。對照組男16例，女14例；年齡20～58歲，平均（39.43±6.52）歲；病程1～

8年，平均（3.42±0.63）年。2組患者在性別、年齡、病程等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 診斷標準 按照1984年美國風濕病學會（ACR）修訂的AS紐約標準［9］，活動期按照2009年國際脊柱關節(jié)炎協(xié)會ASDAS疾病活動度

標準［10］。

1.3 納入標準 ①符合上述診斷標準；②入組前1周停用非甾體抗炎藥、改善病情抗風濕藥和生物制劑等；③患者自愿且簽署知情同意書。

1.4 排除標準 ①妊娠期、哺乳期婦女或有生育要求者；②疾病晚期脊柱強直、嚴重關節(jié)畸形者；③合并急性眼炎需用腎上腺皮質激素治療者；④合并有心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病者。

2 方 法

2.1 治療方法 治療組給予十全育真湯，藥物組成：野臺參12 g、生黃芪12 g、生山藥12 g、知母12 g、玄參12 g、生龍骨（搗細）12 g、生牡蠣（搗細）12 g、丹參6 g、三棱4.5 g、莪術4.5 g。煎液由湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供。每日1劑，分早、晚溫服。對照組給予柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號309378，規(guī)格

0.25 g），每次1 g，每日2次，口服。2組均以

2周為1個療程，連續(xù)治療3個療程。

2.2 AS疾病活動指標測定 觀察治療前后AS患者疾病活動指標，包括視覺模擬評分法（VAS）評分、Bath強直性脊柱炎活動指數(shù)（BASDAI）、Bath強直性脊柱炎功能指數(shù)（BASFI）、Bath強直性脊柱炎總體指數(shù)（BAS-G）、紅細胞沉降率（ESR）和

C反應蛋白（CRP）。

2.3 ELISA法檢測血清炎性細胞因子含量 研究對象清晨空腹采集外周靜脈血4 mL，離心機以3000 r·min-1離心10 min，離心半徑8 cm，收集培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書操作，最后用酶標儀450 nm測OD值，根據標準曲線計算上清液中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β、IL-10的含量。

2.4 流式細胞表面抗原檢測 分離外周血單個核細胞（PBMCs），PBS洗滌后以2×106細胞濃度重懸，取100 mL細胞懸液，加入FITC標記的抗人CD4抗體、APC標記的抗人CCR6抗體、APC標記的抗人CD25抗體和PE標記CD45RO、FoxP3抗體，4 ℃共育30 min，用PBS洗去游離的抗體重懸，用流式細胞儀檢測Th17

表型CD4+CD45RO+CCR6+和Treg表型CD4+CD25+

FoxP3+ T細胞的比例。

2.5 實時熒光定量PCR檢測RORC、FoxP3 mRNA表達量 血液樣本按1∶3加入紅細胞裂解液，裂解后，按照Trizol法提取總RNA，逆轉錄成cDNA，反應條件：50 ℃逆轉錄15 min；

85 ℃滅活逆轉錄酶5 s；4 ℃保持10 min。將cDNA用無菌ddH2O做8倍稀釋后進行PCR擴增，反應體系（20 μL）：cDNA 4 μL，正向引物

（10 μmmol·L-1）、反向引物（10 μmmol·L-1）各0.4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，H2O 4.8 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，

60 ℃退火延伸60 s，共循環(huán)40次。采用QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.1軟件繪制溶解曲線，以GAPDH為內參，按2-ΔΔCt法計算RORC、FoxP3 mRNA的表達水平，并以正常對照組為標準計算相對表達量。引物序列及產物長度見表1。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗。以

P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 2組患者治療前后疾病活動指標比較 治療后，2組VAS評分、BASDAI、BASFI、BAS-G、ESR、CRP較治療前均明顯下降（P < 0.05或

P < 0.01）；且治療組VAS評分、BASFI、BAS-G、

ESR、CRP降低較對照組更明顯（P < 0.05或

P < 0.01）。見表2。

3.2 2組患者治療前后Th17/Treg相關細胞因子水平比較 治療后，2組TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17水平較治療前明顯降低，治療組TGF-β、IL-10水平較治療前明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）；且治療組TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β、IL-10水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

3.3 2組患者治療前后外周血Th17及Treg亞群占CD4+T細胞百分比比較 Th17檢測方案包括FITC-CD4、PE-CD45RO、APC-CCR6，Treg檢測方案包括FITC-CD4、APC-CD25、PE-FoxP3，利用FSC/SSC雙參數(shù)散點圖圈出淋巴細胞，設P1門。經過流式檢測結果顯示，與治療前比較，對照組Th17亞群細胞百分比明顯降低（P < 0.05），而對于Treg亞群的影響差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；治療組Th17亞群細胞百分比明顯降低，Treg亞群細胞百分比明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）。與對照組治療后比較，治療組Th17亞群細胞百分比降低更明顯，Treg亞群細胞百分比升高更明顯（P < 0.05或P < 0.01）。見表4。

3.4 2組患者治療前后Th17/Treg相關基因表達比較 治療后，2組RORC mRNA表達明顯降低，F(xiàn)oxP3 mRNA表達明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）；與對照組比較，治療組RORC mRNA表達水平更低，F(xiàn)oxP3 mRNA表達水平更高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表5。

4 討 論

Th17來源于初始CD4+T細胞的Th細胞亞群，可分泌多種炎性細胞因子，如IL-17、IL-6、IL-21、

TNF-α，廣泛參與炎癥反應，介導多種免疫性疾病及炎性疾病的持續(xù)和發(fā)展［11］。

Treg細胞是一類具有免疫調節(jié)功能的CD4+T細胞亞群，通過分泌TGF-β、IL-10加強免疫抑制因子表達，使致炎因子和免疫抗體分泌減少發(fā)揮免疫調節(jié)作用［12］。AS是一種慢性進行性炎性疾病，炎癥是AS發(fā)展過程中的初始典型病理改變［13］。研究提示，AS的發(fā)生與免疫失調引起的促炎因子大量釋放及抑制炎癥因子釋放不足有關［14］。研究證實，部分中藥及中藥復方可通過調節(jié)免疫細胞功能網絡平衡、干預炎癥介質、影響免疫細胞分化、介導免疫應答過程等多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎作用［15-16］。本研究結果顯示，與本組治療前比較，十全育真湯治療后TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17明顯降低，而TGF-β、IL-10明顯升高，提示該方可能具有調節(jié)炎性細胞因子的作用。與柳氮磺吡啶腸溶片治療后相比，十全育真湯治療后降低VAS、BASFI、BAS-G、ESR、CRP、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17更明顯，且能明顯升高TGF-β、IL-10水平，提示十全育真湯可顯著控制早期活動性AS炎癥、減輕臨床癥狀，在AS治療中有一定潛力。

Th17細胞表型為CD4+CD45RO+CCR6+，初始CD4+T細胞被TCR信號活化，通過TGF-β和IL-6的誘導協(xié)同作用，驅動CD4+T細胞表面高表達IL-23R，趨化因子CCR6及特征性轉錄因子

RORC［17-18］。通過IL-23R信號通路激活STAT3，協(xié)同轉錄因子IRF4和BATF共同參與RORC基因表達。Treg免疫表型為CD4+CD25+FoxP3+，根據Treg的來源不同，主要為2種亞型：天然性T細胞（nTreg）和獲得性T細胞（iTreg）。nTreg通過激活TCR/CD3復合物和CD28介導的共刺激信號在胸腺中發(fā)育成熟并釋放，iTreg可通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β抑制免疫活

化［19-20］。研究表明，Th17/Treg細胞數(shù)量在AS患者外周血中與健康者有差別，AS患者存在Th17/Treg平衡失調，細胞格局向Th17偏移［21-22］。本研究結果顯示，與柳氮磺吡啶腸溶片比較，十全育真湯降低Th17亞群細胞百分比更明顯，且顯著升高Treg亞群細胞百分比，提示十全育真湯可能通過增加Treg細胞數(shù)量并減少Th17數(shù)量，使Th17/Treg向Treg一側漂移，糾正Treg/Th17失衡，達到調節(jié)AS免疫紊亂，恢復免疫功能平衡的作用；RORC mRNA表達水平更低，且FoxP3 mRNA表達水平更高，說明十全育真湯可通過抑制RORC基因表達，促進FoxP3基因表達，使Th17/Treg亞群細胞趨于平衡。

綜上所述，十全育真湯可顯著控制早期活動性AS炎癥，減輕臨床癥狀，在AS治療中有一定潛力。其機制可能與抑制促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17）表達，促進抑炎因子（TGF-β、IL-10）

釋放；通過抑制RORC基因表達，促進FoxP3基因表達，調整Th17/Treg細胞數(shù)量，糾正Th17/Treg免疫失衡有關。

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收稿日期：2023-02-11；修回日期：2023-03-27