針灸預(yù)處理對(duì)急性胃黏膜損傷大鼠GRP78/Caspase-12/CHOP信號(hào)通路的影響

霍新慧,周知然,韋 芳,李 盼,蘭永利

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830001;2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院消化科,新疆 烏魯木齊 830099)

急性胃黏膜損傷(Acute gastric mucosal lesion,AGML)是指在內(nèi)外部不良刺激的作用下,如顱內(nèi)病變、嚴(yán)重外傷、大手術(shù)、休克,導(dǎo)致機(jī)體胃黏膜損傷,出現(xiàn)胃黏膜糜爛、潰瘍甚至出血的急性應(yīng)激性病變。近年來,胃黏膜損傷的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。臨床上通常采用藥物治療,但存在不良反應(yīng),不適合長(zhǎng)期使用。近年來,“治未病”逐漸成為研究熱點(diǎn),針灸在該領(lǐng)域中占據(jù)著非常重要的作用[1]。本課題組前期研究已證實(shí),針灸足三里穴、中脘穴可以加強(qiáng)胃黏膜微循環(huán)屏障,改善胃黏膜損傷[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是炎癥的特征之一,各種應(yīng)激狀態(tài)均可導(dǎo)致ERS[3]。炎癥參與AGML的發(fā)生發(fā)展,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78)作為ERS的標(biāo)志性蛋白,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的受體分子伴侶[4]。在機(jī)體ERS時(shí),GRP78表達(dá)上調(diào),從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)是C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族中的一種重要蛋白,其在C/EBP基因中的作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,所以CHOP蛋白表達(dá)水平可在一定程度反映ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程度[5]。研究表明,半胱氨酸蛋白水解酶-12(Cysteine protein hydrolase-12,Caspase-12)基因表達(dá)水平在ERS誘發(fā)的凋亡過程中起著重要的促進(jìn)作用,也是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的另一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中具有關(guān)鍵作用[6-7]。因此,本研究通過建立急性胃黏膜損傷動(dòng)物模型,進(jìn)一步研究針灸預(yù)處理對(duì)急性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜組織病理學(xué)及GRP78/Caspase-12/CHOP信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)健康大鼠52只,清潔級(jí),雌雄各半,體重(180±20)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào):SYXK(新)2018-0003。常規(guī)飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)室溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度55%～60%,光照明暗交替12 H/D,自由飲食、飲水。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處置方式與《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》以及相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)要求一致。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器:一次性針灸針(0.25 mm×13 mm,華佗牌);特制香煙型純艾條(4 mm×120 mm,南陽漢醫(yī)艾絨公司);懸灸支架(蘄春上工記艾灸器具公司);阿司匹林腸溶片(國(guó)藥準(zhǔn)字HJ20160685,拜耳醫(yī)藥公司);大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(批號(hào)ZK-6601,上海臻科生物科技);大鼠白介素-1β(IL-1β) ELISA試劑盒(批號(hào)ZK-6601,上海臻科生物科技);大鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2) ELISA試劑盒(批號(hào)ZK-6601,上海臻科生物科技);DAB顯色液(批號(hào)2040A1012,北京中杉金橋);酶標(biāo)分析儀(型號(hào)Infinite F50,上海生物科技);顯微鏡(型號(hào)BX51T-PHD-J11,日本奧林巴斯);切片機(jī)(型號(hào)RM2016,德國(guó)徠卡)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與干預(yù):52只健康大鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,然后隨機(jī)分為正常組、模型組、艾灸預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組,每組13只。正常組和模型組大鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng),將大鼠自然固定于鼠板上,每次20 min,每日1次,共7 d。艾灸預(yù)處理組將大鼠仰臥位固定于鼠板上,參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]中常用動(dòng)物(大鼠)穴位定位法選取足三里穴(雙側(cè))、中脘穴進(jìn)行艾灸治療。操作方法:取穴后用彎剪剪去施灸點(diǎn)局部毛發(fā),然后用記號(hào)筆標(biāo)記穴位,將隔熱貼打孔,孔徑為0.5 cm,貼于選取的穴位及對(duì)照點(diǎn)處,艾條點(diǎn)燃后放置于艾灸架上,正對(duì)施灸部位,保持距離2 cm左右,3個(gè)穴位同時(shí)開始施灸,施灸溫度42 ℃左右,每次艾灸20 min,每日1次,共7 d。針刺預(yù)處理組:大鼠固定方式、所選穴位、治療時(shí)間和艾灸預(yù)處理組相同,針刺方法為指切進(jìn)針法,操作者左手食指按壓所刺腧穴位置旁邊部位,用右手持針,緊靠左手指甲面快速進(jìn)針,間隔5 min進(jìn)行提插捻轉(zhuǎn)。每次均由同一人對(duì)大鼠進(jìn)行操作。

1.2.2 模型的建立:參照課題組前期實(shí)驗(yàn)制備AGML模型[9]。第7天艾灸預(yù)處理結(jié)束后,四組大鼠禁食不禁水24 h,第9天開始對(duì)各組大鼠進(jìn)行無水乙醇聯(lián)合阿司匹林混懸液灌胃,建立AGML模型。按0.6 ml/100 g的劑量用灌胃針頭將無水乙醇注入模型組、艾灸預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組大鼠胃內(nèi),1 h后再將200 mg/kg阿司匹林混懸液0.1 ml/100 g注入大鼠胃內(nèi),連續(xù)造模7 d。

1.2.3 取材:造模結(jié)束后,各組大鼠禁食24 h,禁水8 h,用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉,麻醉滿意后,暴露腹腔,取腹主動(dòng)脈血,常溫靜置后,離心機(jī)離心取上清液,檢測(cè)相關(guān)因子水平。將大鼠全胃取出,用冰0.9%氯化鈉溶液沖洗,肉眼觀察胃黏膜損傷情況,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察其組織病理學(xué)改變。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 —般情況:每日定時(shí)觀察各組大鼠毛發(fā)光澤、飲食水量、大小便、精神狀態(tài)及活動(dòng)情況,定期監(jiān)測(cè)大鼠體重。

1.3.2 胃黏膜損傷指數(shù)(UI):按GUTH法計(jì)算評(píng)定UI[10]。損傷長(zhǎng)度≤1 mm為1分;1 mm<損傷長(zhǎng)度≤2 mm為2 分;2 mm<損傷長(zhǎng)度≤3 mm為3分;3 mm<損傷長(zhǎng)度≤4 mm為4分;損傷長(zhǎng)度>4 mm為5分;損傷寬度>2 mm者計(jì)分加倍。每只大鼠的UI為各分值累計(jì)相加。

1.3.3 AGML大鼠組織病理學(xué)觀察:取1.0 cm×0.5 cm大小的胃黏膜組織,4%多聚甲醛固定標(biāo)本、脫水、石蠟包埋、切片,HE染色后光鏡下觀察大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)。

1.3.4 ELISA檢測(cè)血清炎癥因子水平:將大鼠血液標(biāo)本常溫靜置10～15 min,4 ℃,3000 r/min離心20 min,提取上清液置于EP管中,-80 ℃冰箱保存待檢。ELISA法檢測(cè)胃黏膜損傷大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠胃黏膜組織GRP78/Caspase-12/CHOP通路蛋白表達(dá):檢測(cè)過程中嚴(yán)格遵照試劑盒說明書操作,常規(guī)石蠟包埋、組織切片經(jīng)抗原修復(fù)后,滴加正常山羊血清液室溫封閉,滴加一抗工作液,4 ℃過夜,PBS洗滌3次后,滴加生物素化第二抗體、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,DAB顯色,復(fù)染,常規(guī)樹脂封片,鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間方差齊時(shí)采用單因素方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 在造模前、艾灸預(yù)處理及針刺預(yù)處理期間,四組大鼠毛發(fā)光澤,飲食水量、大小便、精神等一般狀態(tài)均正常,體重增加。在造模后,與正常組大鼠比較,模型組大鼠毛發(fā)無光澤,飲食水量減少,大便稀溏,精神不振,蜷縮懶動(dòng),狀態(tài)差,體重下降(P<0.05);與模型組比較,艾灸預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組大鼠一般情況有明顯改善,體重增加(均P<0.05),且艾灸預(yù)處理組較針刺預(yù)處理組大鼠體重改善更明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重比較(g)

2.2 各組大鼠UI評(píng)分比較 見表2(圖1)。正常組大鼠胃黏膜光滑完整;模型組大鼠胃黏膜可見斑點(diǎn)狀破潰出血灶,UI評(píng)分顯著高于正常組(P<0.05);艾灸預(yù)處理、針刺預(yù)處理組大鼠胃黏膜僅見少量斑點(diǎn)狀出血點(diǎn),UI評(píng)分明顯低于模型組(均P<0.05);與針刺預(yù)處理組比較,艾灸預(yù)處理組大鼠UI評(píng)分顯著降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠UI評(píng)分比較(分)

2.3 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)觀察 光鏡下,正常組大鼠胃黏膜表面上皮結(jié)構(gòu)清晰完好,細(xì)胞排列整齊有序,未發(fā)現(xiàn)充血、紅染、脫落等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。模型組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞分布錯(cuò)亂無序,細(xì)胞內(nèi)可見明顯充血,表現(xiàn)出紅染的征象,出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),胃黏膜組織損傷明顯。針刺、艾灸預(yù)處理組大鼠胃黏膜損傷征象明顯減輕,胃黏膜結(jié)構(gòu)比較清晰,細(xì)胞部分有脫落,細(xì)胞內(nèi)充血、紅染等病理征象明顯改善,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少,且艾灸預(yù)處理組大鼠胃黏膜損傷減輕更明顯,可見新生的肉芽組織。見圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)改變(HE染色,×400)

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平比較 見表3。與正常組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平顯著升高(均P<0.05)。與模型組比較,艾灸預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平顯著降低(均P<0.05),且艾灸預(yù)處理組降低更明顯(均P<0.05)。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平比較

2.5 各組大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP表達(dá)情況比較 與正常組比較,模型組GRP78、Caspase-12、CHOP呈強(qiáng)陽性表達(dá),細(xì)胞內(nèi)充滿大量棕黃色顆粒;與模型組比較,針刺、艾灸預(yù)處理組大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP結(jié)果陽性細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒減少,表達(dá)減弱,呈弱陽性,艾灸預(yù)處理組減少更明顯。見圖3。

圖3 各組大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP水平比較(免疫組化染色,×200)

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,AGML是臨床常見的急癥,而炎癥反應(yīng)是胃黏膜損傷難以改善和易反復(fù)發(fā)作的主要原因[11]。炎性因子TNF-α、IL-6是炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志物,可用于評(píng)價(jià)胃黏膜損傷的炎癥反應(yīng)程度[12-13]。TNF-α、IL-6與胃黏膜損傷密切相關(guān),TNF-α不僅能活化炎性細(xì)胞,加重炎癥反應(yīng),還是導(dǎo)致潰瘍愈合困難、反復(fù)發(fā)作的重要原因[14]。COX-2是消化道疾病發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素[15],也是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一,在正常組織細(xì)胞中或者炎癥反應(yīng)程度較低的組織中,COX-2含量極低或不表達(dá);但當(dāng)細(xì)胞受到炎癥等刺激時(shí),其在炎癥細(xì)胞中會(huì)迅速合成并釋放,含量可升高至正常水平的10～80倍[16],導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷。且有研究發(fā)現(xiàn),COX-2水平在胃潰瘍組織中呈高表達(dá),通過抑制COX-2可減少胃酸分泌,促進(jìn)胃潰瘍愈合,減少?gòu)?fù)發(fā)[17-19]。胃黏膜在受到一定程度損傷后,可激活機(jī)體修復(fù)功能,其機(jī)制主要通過損傷后的上皮細(xì)胞增生來實(shí)現(xiàn),多種保護(hù)因子參與了胃黏膜的細(xì)胞增殖修復(fù)過程,從而提高了胃黏膜的保護(hù)及防御功能,促進(jìn)胃黏膜修復(fù),避免損傷向深層發(fā)展[20-21];而應(yīng)激狀態(tài)下,胃黏膜細(xì)胞糜爛充血導(dǎo)致表面上皮細(xì)胞再修復(fù)能力下降,促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-6、COX-2分泌,降低了黏膜自身的防御修復(fù)作用[22]。

研究表明,針灸預(yù)處理對(duì)胃黏膜具有一定的保護(hù)作用[23]。如明代高武在《針灸聚英》中首次提出“逆針灸”,即在疾病尚未發(fā)生時(shí)采用針灸治療,能扶助正氣,防止疾病發(fā)生。艾灸作為中醫(yī)的一種外治療法,對(duì)胃脘系疾病具有比較好的預(yù)防及治療作用[24]。在機(jī)體尚未發(fā)病時(shí),通過艾灸對(duì)某些腧穴進(jìn)行溫?zé)岽碳?以激發(fā)人體經(jīng)脈之氣,提高身體抵抗力和應(yīng)變能力,降低免疫細(xì)胞對(duì)炎癥的反應(yīng),促進(jìn)炎癥消除和組織的恢復(fù),從而達(dá)到預(yù)防和治療的目的[25-26]。大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明,艾灸能啟動(dòng)抗炎、抑制凋亡、促修復(fù)等一系列抗胃黏膜損傷效應(yīng)[27-28]。

胃黏膜損傷性疾病根據(jù)其臨床表現(xiàn)和特點(diǎn)可歸屬于中醫(yī)“胃脘痛”范疇。足陽明胃經(jīng)與胃腑疾病有著密切的關(guān)系。足三里穴為足陽明胃經(jīng)的合穴及胃之下合穴,具有益氣養(yǎng)血、調(diào)節(jié)胃腸功能、提高免疫力的作用[29-30]。故治療胃脘部疾病可首選足三里穴。歷代文獻(xiàn)對(duì)足三里穴的主治記載甚廣,曾有“三里功多數(shù)不清”之說?！夺樉拇笕吩?“能通心腹脹,善治胃中寒,腸鳴并泄瀉”,《靈樞》中指出:“合治內(nèi)府”,《養(yǎng)生類纂》說:“三里,五臟六腑也,溝渠也,常欲宣通,即無風(fēng)疾”等,均可以采用針灸足三里穴治療胃脘部疾病。中脘穴位于任脈上,在心蔽骨與臍連線的正中,是足陽明胃經(jīng)的募穴,特定穴中八會(huì)穴的腑會(huì),也是手太陽經(jīng)、手少陽經(jīng)、足陽明經(jīng)、任脈之會(huì)。中脘穴位于胃的中部,是養(yǎng)胃的重要穴位,具有疏肝養(yǎng)胃、和胃降逆、健脾利濕之效,主治一切腑病,尤胃腑優(yōu)先[31-32]。足三里穴與中脘穴之配伍,屬于“合募配穴”,合用擅長(zhǎng)治療胃病,調(diào)理胃腑。故本實(shí)驗(yàn)選取了“足三里”“中脘”兩個(gè)穴位,均能治療胃部疾病,聯(lián)合使用效果更好。

本研究結(jié)果所示,無水乙醇結(jié)合阿司匹林混懸液灌胃建立大鼠AGML模型,模型組大鼠出現(xiàn)飲食水量減少,精神活動(dòng)等一般狀態(tài)不佳,體重下降。HE染色結(jié)果可見大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、胃黏膜組織損傷明顯等病理征象,血清中促炎性細(xì)胞因子濃度升高。預(yù)先給予艾灸、針刺足三里和中脘穴的大鼠,促炎因子濃度低于模型組,可明顯減輕大鼠胃黏膜損傷,上皮細(xì)胞表面部分脫落,細(xì)胞內(nèi)充血明顯改善,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少,胃黏膜結(jié)構(gòu)比較清晰,且作用較針刺預(yù)處理明顯。這可能與針灸能調(diào)節(jié)和恢復(fù)胃腸功能、增強(qiáng)自身防御、抑制ERS、降低炎性因子有關(guān)。

GRP78、Caspase-12、CHOP作為ESR的標(biāo)志物,能釋放大量促炎因子,AGML在應(yīng)激狀態(tài)下能使GRP78、Caspase-12、CHOP陽性細(xì)胞增加,從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通路。本研究采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠胃黏膜組織,結(jié)果可見模型組GRP78、Caspase-12、CHOP細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽性,針刺、艾灸預(yù)處理組大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP表達(dá)減弱,艾灸預(yù)處理組減少更明顯,提示針灸能減輕大鼠胃黏膜炎癥反應(yīng),抑制血清中促炎因子水平,釋放抗炎因子,促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)愈合,發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用。

綜上所述,針灸預(yù)處理可減輕AGML大鼠炎癥反應(yīng),其作用機(jī)制可能是通過抑制ERS,基于GRP78/Caspase-12/CHOP信號(hào)通路預(yù)防大鼠胃黏膜損傷。