溫陽(yáng)振衰顆粒調(diào)控miR-155/p38MAPK途徑減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷機(jī)制研究

張 馳,李?yuàn)W博,王心怡,王沛昕

(1.北京大學(xué)第三醫(yī)院,北京 100621;2.北京豐臺(tái)右安門(mén)醫(yī)院,北京 100069;3.北京豐臺(tái)醫(yī)院,北京 100071)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是指缺血心肌獲得血流再灌注后發(fā)生的損傷,常見(jiàn)于冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)、急性心肌梗死介入手術(shù)等,可增加手術(shù)后再發(fā)心肌梗死、惡性心律失常、心源性猝死的風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此,防治MIRI成為了心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近些年,中醫(yī)藥在心血管疾病治療中的價(jià)值受到越來(lái)越多關(guān)注,溫陽(yáng)振衰顆粒是湖南中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)的中藥顆粒劑,由附子、干姜、甘草、紅參等組成,有扶陽(yáng)破陰、逐寒救逆的功效,已經(jīng)在慢性心衰、阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷模型中被證實(shí)其能夠減輕心肌損傷,并且通過(guò)調(diào)控miR-155/p38MAPK通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用[2-3]。但溫陽(yáng)振衰顆粒在MIRI中的應(yīng)用價(jià)值及作用機(jī)制尚不清楚。miR-155靶向抑制p38MAPK的作用已經(jīng)在樹(shù)突狀細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞中被證實(shí)[4-5];而在腎臟、心肌等組織缺血再灌注的過(guò)程中,p38MAPK通路的激活介導(dǎo)了促炎因子腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的釋放,進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大[6-7]?；诖?推測(cè)miR-155/p38MAPK軸可能在MIRI過(guò)程中起重要作用,能夠調(diào)控miR-155/p38MAPK軸的溫陽(yáng)振衰顆?？赡茉贛IRI過(guò)程中起治療作用。故本研究建立大鼠MIRI模型,具體分析溫陽(yáng)振衰顆粒調(diào)控miR-155/p38MAPK途徑減輕MIRI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:成年雄性SD大鼠64只,購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司,10～12周齡,體重200～250 g,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0012。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:溫陽(yáng)振衰顆粒由制附子、干姜、茯苓、紅參、麥冬、五味子、甘草組成,購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院;miR-155抑制劑、模擬物及陰性對(duì)照序列購(gòu)自上海吉瑪公司;磷酸肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)公司;miRNA提取及檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根公司;蛋白裂解液購(gòu)自北京索萊寶公司;p-p38MAPK一抗購(gòu)自CST公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-tek公司;凝膠電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)購(gòu)自上海牧德如公司;熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模、分組及干預(yù):①miR-155/p38MAPK通路在心肌MIRI損傷中的作用:32只大鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陰性對(duì)照+MIRI組、miR-155抑制劑+MIRI組、miR-155模擬物+MIRI組,每組8只;四組大鼠予30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開(kāi)胸腔,暴露心臟,分別在左心室前壁6個(gè)點(diǎn)給予陰性對(duì)照腺病毒、miR-155抑制劑腺病毒、miR-155模擬物腺病毒1×109PFU局部注射。4 d后造模,陰性對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)操作,30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開(kāi)胸腔,暴露心臟,分離左冠狀動(dòng)脈前降支并穿線,但不結(jié)扎;其余各組均進(jìn)行MIRI造模,30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開(kāi)胸腔,暴露心臟,分離左冠狀動(dòng)脈前降支并穿線,將1.5 mm乳膠管放置在縫線與冠脈之間,結(jié)扎縫線使心肌缺血30 min,而后取出乳膠管,使心肌再灌注12 h,然后收集心肌及血樣進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。②溫陽(yáng)振衰顆粒通過(guò)miR-155/p38MAPK途徑減輕心肌MIRI損傷:32只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MIRI組、中藥組、中藥+miR-155抑制劑組,每組8只。對(duì)照組和MIRI組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液灌胃,中藥組和中藥+miR-155抑制劑組給予2.88 g/(kg·d)溫陽(yáng)振衰顆粒灌胃,連續(xù)灌胃14 d;中藥+miR-155抑制劑組在灌胃第10 d時(shí)予30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后打開(kāi)胸腔,暴露心臟,在左心室前壁6個(gè)點(diǎn)給予miR-155抑制劑的腺病毒1×109PFU局部注射。末次灌胃后次日進(jìn)行造模,對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)操作,其余三組進(jìn)行MIRI造模,收集心肌及血樣進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 血清心肌酶含量檢測(cè):取血清樣本,采用ELISA試劑盒檢測(cè)CK-MB、LDH含量,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 心肌miR-155表達(dá)水平檢測(cè):取缺血再灌注部位的心肌組織適量,采用miRNA提取分離試劑盒提取組織樣本中的miRNA,而后將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的cDNA,最后采用miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA中的miR-155及U6進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 2 μl,試劑盒內(nèi)的Mixture 10 μl,上游引物0.6 μl,通用下游引物0.6 μl,去離子水補(bǔ)足至20.0 μl。PCR反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s重復(fù)40個(gè)循環(huán),根據(jù)循環(huán)曲線以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-155的表達(dá)量。

1.2.4 心肌p-p38MAPK表達(dá)檢測(cè):取缺血再灌注部位的心肌組織適量,加入蛋白裂解液提取蛋白樣本,測(cè)定蛋白濃度后,將含有30 μg蛋白的樣本用于Western blot檢測(cè),加入預(yù)先配制的聚丙烯酰胺凝膠后進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,1∶1000稀釋的p-p38MAPK一抗或1∶4000稀釋的β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜;次日,1∶2000稀釋的二抗室溫孵育2 h,最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到p-p38MAPK和β-actin,以β-actin蛋白條帶的灰度值作為內(nèi)參計(jì)算p-p38MAPK表達(dá)水平。

1.2.5 心肌炎癥因子含量檢測(cè):取缺血再灌注部位的適量心肌組織,采用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6水平,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)表達(dá)及敲低miR-155對(duì)MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK通路的影響 見(jiàn)表1(圖1)。與陰性對(duì)照組比較,陰性對(duì)照+MIRI組大鼠心肌組織miR-155表達(dá)明顯降低,p-p38MAPK表達(dá)明顯增加(均P<0.05);與陰性對(duì)照+MIRI組比較,miR-155抑制劑+MIRI組大鼠心肌miR-155表達(dá)明顯降低,p-p38MAPK表達(dá)明顯增加(均P<0.05);與陰性對(duì)照+MIRI組比較,miR-155模擬物+MIRI組大鼠心肌miR-155表達(dá)明顯增加,p-p38MAPK表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織p-p38MAPK表達(dá)電泳圖

表1 各組大鼠心肌組織miR-155、p-p38MAPK表達(dá)比較

2.2 過(guò)表達(dá)及敲低miR-155對(duì)MIRI大鼠血清心肌酶含量的影響 見(jiàn)表2。與陰性對(duì)照組比較,陰性對(duì)照+MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05);與陰性對(duì)照+MIRI組比較,miR-155抑制劑+MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05),miR-155模擬物+MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯降低(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血清CK-MB、LDH含量比較(U/L)

2.3 過(guò)表達(dá)及敲低miR-155對(duì)MIRI大鼠心肌p38MAPK下游炎癥因子的影響 見(jiàn)表3。與陰性對(duì)照組比較,陰性對(duì)照+MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05);與陰性對(duì)照+MIRI組比較,miR-155抑制劑+MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05),miR-155模擬物+MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯降低(均P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量比較(ng/mg prot)

2.4 溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)MIRI大鼠血清心肌酶含量的影響 見(jiàn)表4。與對(duì)照組比較,MIRI組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05);與MIRI組比較,中藥組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯降低(均P<0.05);與中藥組比較,中藥+miR-155抑制劑組大鼠血清CK-MB、LDH含量明顯增加(均P<0.05)。

表4 各組大鼠血清CK-MB、LDH含量比較(U/L)

2.5 溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK途徑的影響 見(jiàn)表5(圖2)。與對(duì)照組比較,MIRI組大鼠心肌miR-155表達(dá)明顯降低,p-p38MAPK表達(dá)明顯增加(均P<0.05);與MIRI組比較,中藥組大鼠心肌miR-155的表達(dá)明顯增加,p-p38MAPK表達(dá)明顯降低(均P<0.05);與中藥組比較,中藥+miR-155抑制劑組大鼠心肌miR-155表達(dá)明顯降低,p-p38MAPK表達(dá)明顯增加(均P<0.05)。

圖2 各組大鼠心肌p-p38MAPK表達(dá)電泳圖

表5 各組大鼠心肌miR-155、p-p38MAPK表達(dá)比較

2.6 溫陽(yáng)振衰顆粒對(duì)MIRI大鼠心肌p38MAPK下游炎癥因子的影響 見(jiàn)表6。與對(duì)照組比較,MIRI組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05);與MIRI組比較,中藥組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯降低(均P<0.05);與中藥組比較,中藥+miR-155抑制劑組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明顯增加(均P<0.05)。

表6 各組大鼠心肌TNF-α、IL-6含量比較(ng/mg prot)

3 討 論

缺血再灌注損傷是冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)、急性心肌梗死介入手術(shù)等過(guò)程中心肌必經(jīng)的病理生理過(guò)程,受到炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡、自噬等因素的影響,可出現(xiàn)MIRI,并增加多種心血管危重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[8-11]。近年來(lái),中醫(yī)藥在MIRI防治中的價(jià)值受到了越來(lái)越多關(guān)注。有研究報(bào)道,補(bǔ)陽(yáng)還五湯、益氣降濁湯、雙參通脈顆粒等中藥均能在大鼠MIRI中起到保護(hù)作用[12-15]。

溫陽(yáng)振衰顆粒是以附子、干姜、甘草、紅參為主要成分的中藥顆粒劑。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),溫陽(yáng)振衰顆粒在慢性心衰、阿霉素誘導(dǎo)損傷、膿毒癥誘導(dǎo)損傷的模型中具有心肌保護(hù)作用[2,16-17]。溫陽(yáng)振衰顆粒含藥血清通過(guò)調(diào)控miR-155/p38MAPK途徑減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[3]。miR-155對(duì)p38MAPK的靶向調(diào)控作用與其抑制MAP3K10、MKK3、MKK6等的激活有關(guān),miR-155靶向抑制p38MAPK的激活能夠削弱p38MAPK介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),減少TNF-α、IL-6生成[18-19]。本實(shí)驗(yàn)分析MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK通路的變化可知:MIRI組大鼠心肌miR-155表達(dá)降低,p-p38MAPK表達(dá)及其下游TNF-α、IL-6含量增加,表明miR-155/p38MAPK通路在MIRI過(guò)程中發(fā)生改變,下游炎癥反應(yīng)明顯激活。在加用溫陽(yáng)振衰顆粒灌胃干預(yù)后,中藥組大鼠心肌miR-155表達(dá)增加,大鼠心肌miR-155表達(dá)及其下游TNF-α、IL-6含量降低,表明溫陽(yáng)振衰顆粒參與MIRI過(guò)程中miR-155/p38MAPK通路的調(diào)控,這可能是溫陽(yáng)振衰顆粒減輕MIRI的分子機(jī)制。

中醫(yī)理論認(rèn)為MIRI屬于胸痹范疇,病機(jī)在于陰乘陽(yáng)位、胸陽(yáng)痹阻所造成的血脈運(yùn)行不暢[20-23]。溫陽(yáng)振衰顆粒能夠針對(duì)MIRI病機(jī)發(fā)揮扶陽(yáng)破陰、逐寒救逆的作用,在MIRI中起心肌保護(hù)作用[24-25]。本實(shí)驗(yàn)采用溫陽(yáng)振衰顆粒灌胃的方式進(jìn)行干預(yù),灌胃14 d后進(jìn)行MIRI造模,MIRI組血清心肌酶含量較對(duì)照組增加,而中藥組血清心肌酶含量較MIRI組降低,表明溫陽(yáng)振衰顆粒能夠在MIRI過(guò)程中起保護(hù)作用、減輕心肌損傷的程度,與該顆粒劑在其他模型中介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用吻合[26-27]。為闡明溫陽(yáng)振衰顆粒是否通過(guò)miR-155/p38MAPK通路減輕MIRI,本研究驗(yàn)證了miR-155在MIRI中的作用。在MIRI造模前分別在心肌局部注射miR-155的抑制物和模擬物,造模后觀察心肌損傷程度,結(jié)果顯示抑制miR-155表達(dá)后,MIRI加重且p38MAPK進(jìn)一步激活,下游TNF-α及IL-6生成進(jìn)一步增多;而上調(diào)miR-155表達(dá)后,MIRI減輕且p38MAPK激活減弱,下游TNF-α及IL-6生成減少。以上結(jié)果表明miR-155在MIRI中起保護(hù)作用,并且能夠靶向抑制p38MAPK的激活及下游炎癥因子的釋放。最后,本研究還通過(guò)局部注射miR-155抑制物的方式驗(yàn)證溫陽(yáng)振衰顆粒減輕MIRI的機(jī)制,在溫陽(yáng)振衰顆粒灌胃過(guò)程中給予miR-155抑制物心肌局部注射,而后進(jìn)行MIRI造模,造模后觀察到抑制miR-155表達(dá)能夠削弱溫陽(yáng)振衰顆粒減輕MIRI的作用,由此證實(shí)溫陽(yáng)振衰顆粒減輕MIRI的作用與上調(diào)miR-155表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,溫陽(yáng)振衰顆粒通過(guò)調(diào)控miR-155/p38MAPK途徑減輕大鼠MIRI,并且miR-155能夠在心肌MIRI過(guò)程中靶向p38MAPK,抑制炎癥并減輕心肌損傷。