保腎通絡方含藥血清對高糖培養(yǎng)足細胞Nephrin、Desmin蛋白表達及細胞凋亡的影響

崔方強,王悅芬,孟 元,蔡 朕,江心燦,趙文景

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是臨床常見疾病,是導致終末期腎臟病(End stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。蛋白尿是DN的典型臨床表現(xiàn),同時也是疾病進展的關鍵病理因素。高糖介導的足細胞損傷在DN蛋白尿的產(chǎn)生中起著至關重要的作用[2]。足細胞損傷表現(xiàn)為足細胞相關蛋白結構功能異常及足細胞凋亡[3]。腎病蛋白(Nephrin)是足細胞重要功能蛋白,結蛋白(Desmin)是足細胞損傷的標志蛋白[4]。高糖可以引起足細胞凋亡,進而導致濾過屏障破壞及蛋白尿[5]。保腎通絡方是首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科臨床協(xié)定處方,被廣泛用于DN的臨床防治,取得較好的臨床療效。但是保腎通絡方對于高糖培養(yǎng)下足細胞Nephrin蛋白、Desmin蛋白及足細胞凋亡的作用目前尚不清楚。因此,本研究探討保腎通絡方含藥血清對于高糖培養(yǎng)下足細胞Nephrin、Desmin蛋白表達及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:10只雄性SD大鼠,平均體重(200±20)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004。大鼠在12 h光照/黑暗循環(huán)、溫度(24±1)℃、濕度50%～70%條件下飼養(yǎng),并可自由進食進水。本實驗通過實驗動物倫理委員會批準,實驗過程嚴格遵守動物福利倫理原則。

1.1.2 實驗細胞:條件永生小鼠足細胞系,購于北納生物科技有限公司。

1.1.3 實驗試劑和藥物:CCK-8試劑盒(批號C40042,碧云天生物),胱天蛋白酶3(Caspase-3)抗體(批號ab13847,Abcam),Nephrin抗體(批號ab216341,Abcam),Desmin抗體(批號ab32362,Abcam),Hochest33258染料(批號C0021,Solarbio),FITC標記的羊抗小鼠IgG(批號KGAA25,凱基生物);保腎通絡方顆粒劑由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備。

1.1.4 實驗儀器:酶標儀(型號ZS-3,北京新風機電技術公司),離心機(型號3K18,美國Sigma),倒置顯微鏡(型號DMIL-PH1,德國Leica),凝膠化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(型號FUSION FX6 XT,法國Vilbe),激光共聚焦顯微鏡(型號TCS SP8 STED,德國Leica)。

1.2 實驗方法

1.2.1 保腎通絡方含藥血清制備:將SD大鼠隨機分為空白對照組、保腎通絡方含藥血清組,每組5只。各組大鼠均自由飲食及飲水。保腎通絡方含藥血清組大鼠灌服保腎通絡方1.0 g/ml(以生藥量計算濃度),2 ml/次,2次/d,空白對照組灌服等量蒸餾水,連續(xù)灌胃3 d,血藥濃度達峰值時,麻醉后開腹取血。分離血清后56 ℃水浴30 min,無菌濾器過濾除菌,-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 細胞分組及給藥:在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件永生小鼠足細胞系,待細胞生長至80%融合時,將足細胞分為正常對照組、模型組和保腎通絡方低、中、高劑量組。正常對照組足細胞予DMEM低糖培養(yǎng)基、24.5 mmol/L甘露醇和空白血清培養(yǎng),模型組足細胞予DMEM高糖培養(yǎng)基和空白血清培養(yǎng),保腎通絡方低、中、高劑量組在予DMEM高糖培養(yǎng)基的基礎上分別予5%、10%、15%保腎通絡方含藥血清培養(yǎng)。各組足細胞培養(yǎng)24 h后,對細胞進行固定或者收集,用于后續(xù)實驗。

1.2.3 CCK-8檢測足細胞活性:將消化好的足細胞懸液移入96孔板,保證每孔足細胞數(shù)目一致,并且細胞數(shù)目不少于1×104個。待細胞貼壁并生長狀態(tài)良好時,對不同組別足細胞進行干預。然后每孔加入10 μl的CCK-8溶液,孵育后用酶標儀檢測各孔OD值,并根據(jù)OD值檢測各組足細胞活性。細胞活性(%)=加藥細胞OD/對照細胞OD×100%。

1.2.4 免疫熒光檢測足細胞蛋白表達:將消化好的足細胞懸液移入12孔板,每孔細胞數(shù)目一致。待細胞80%融合且生長狀態(tài)良好,予不同干預措施。然后4%多聚甲醛固定,透膜后,予一抗4 ℃孵育過夜,后予二抗37 ℃孵育2 h,DAPI染核后封片。共聚焦顯微鏡觀察各組足細胞Nephrin、Desmin、Caspase-3蛋白表達情況。

1.2.5 RT-PCR檢測Nephrin、Desmin mRNA表達:提取各組足細胞總RNA,將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR儀對其進行擴增和熒光定量,采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析,實驗操作完全按照說明書操作步驟進行。利用Primer 5.0軟件設計引物序列,引物序列如下。Nephrin上游引物:5’-AATTGGCGGCTGGGTCTTAGGG-3’,下游引物:5’-AGGCGTGTGGGCGTGTATATGT-3’;Desmin上游引物:5’-AGACCTTCTCTGCTCTCAACTTCC-3’,下游引物:5’-CTCGCTGACAACCTCTCCATCC-3’。

1.2.6 Hochest33258染色檢測足細胞凋亡:將消化好的足細胞懸液移入12孔板,每孔細胞數(shù)目一致。待細胞80%融合并生長狀態(tài)良好后,予不同干預措施。4%多聚甲醛固定足細胞30 min,透膜后用Hochest33258染液染核30 min,甘油封片。共聚焦顯微鏡觀察各組足細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD檢驗;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組足細胞的細胞活性比較 見表1。與正常對照組比較,模型組足細胞的細胞活性明顯降低(P<0.05);與模型組比較,保腎通絡方低、中、高劑量組足細胞的細胞活性不同程度升高(均P<0.05)。

表1 各組足細胞的細胞活性比較(%)

2.2 各組足細胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表達比較 見表2(圖1)。與正常對照組比較,模型組足細胞Nephrin蛋白表達明顯降低,Desmi、Caspase-3蛋白表達顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,保腎通絡方低、中、高劑量組足細胞Nephrin蛋白表達明顯升高,Desmi、Caspase-3蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。

圖1 各組足細胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表達(免疫熒光染色,×400)

表2 各組足細胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表達比較

2.3 各組足細胞Nephrin、Desmi mRNA表達比較 見表3。與正常對照組比較,模型組足細胞Nephrin mRNA表達顯著降低,Desmin mRNA表達水平明顯升高(均P<0.05);與模型組比較,保腎通絡方低、中、高劑量組足細胞Nephrin mRNA表達顯著升高,Desmin mRNA表達水平明顯降低(均P<0.05)。

表3 各組足細胞Nephrin、Desmi mRNA表達比較

2.4 各組足細胞凋亡細胞數(shù)目比較 見表4(圖2)。與正常對照組比較,模型組足細胞凋亡數(shù)目明顯升高(P<0.05);與模型組比較,保腎通絡方低、中、高劑量組足細胞凋亡數(shù)目明顯減少(均P<0.05)。

表4 各組足細胞凋亡細胞數(shù)目比較(個)

3 討 論

DN是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥,也是導致ESRD重要的原發(fā)腎臟疾病[6]。與其他腎臟疾病比較,DN具有病情進展迅速的特點。蛋白尿是導致DN進展的關鍵病理因素[7]。腎小球濾過膜(Glomerular filtration barrier,GFB)是維持腎小球濾過功能和阻止蛋白尿產(chǎn)生的結構基礎。GFB由內(nèi)皮細胞、基底膜、足細胞三層結構組成,而足細胞是GFB中最為關鍵的結構[8]。足細胞又稱為腎小球上皮細胞,其包裹在基底膜外側,組成腎小球濾過膜最為重要的屏障[9-11]。高糖介導的足細胞損傷是DN蛋白尿產(chǎn)生及疾病進展的關鍵病理環(huán)節(jié)。減輕足細胞損傷可有效改善DN蛋白尿,延緩疾病進展[12]。

DN足細胞損傷主要表現(xiàn)為功能蛋白表達異常及足細胞凋亡。在DN中,高糖刺激會引起足細胞功能蛋白Nephrin表達下調(diào),損傷蛋白Desmin表達上調(diào),最終介導足細胞損傷[13-14]。Nephrin蛋白是足細胞特有的標志蛋白,同時也是非常重要的功能蛋白。Nephrin蛋白是一種跨膜蛋白,其胞外域分布在裂孔隔膜,并與相鄰足細胞的Nephrin蛋白相互交叉,在裂孔隔膜上組成特殊的拉鏈狀結構。這種特殊的拉鏈狀結構在維持腎小球濾過功能方面起著至關重要的作用。此外,Nephrin蛋白能夠介導足細胞系列信號傳導,并能維持足細胞正常的細胞骨架[15]。Desmin蛋白是細胞骨架的中間絲蛋白,在正常足細胞中不表達。而在足細胞損傷時,足細胞出現(xiàn)表型改變,并發(fā)生骨架重排。此時足細胞開始表達Desmin蛋白,并且其表達與足細胞損傷水平呈正相關[16]。因此,Desmin蛋白是足細胞損傷的標志蛋白。

DN患者中腎小球足細胞數(shù)量明顯減少[17]。高糖可介導足細胞凋亡,而足細胞凋亡會引起足細胞從腎小球基底膜上脫落,使足細胞數(shù)量及密度減少。足細胞是一種終末分化期細胞,失去了再生修復的能力。因此,足細胞凋亡是導致足細胞數(shù)量減少最為主要的原因[18-20]。足細胞凋亡病理機制十分復雜,涉及不同信號通路,其中Caspase-3蛋白是介導足細胞凋亡的關鍵蛋白[21]。Caspase-3位于細胞凋亡信號傳導通路的中心位置,活化后直接參與切割細胞多種結構蛋白和功能蛋白,導致細胞以凋亡的形式解體,是細胞凋亡中的關鍵蛋白酶[22]。

中醫(yī)藥防治DN具有獨特的優(yōu)勢,并顯示出多靶點效應[23]。DN屬于中醫(yī)“水腫”“尿濁”“關格”等范疇,不同醫(yī)家對其病因病機有不同的闡述。呂仁和等[24]認為DN的主要病機為痰濁瘀血積聚于腎絡,而形成癥瘕,因此提出了微型癥瘕的病機理論。南征教授認為,DN后期出現(xiàn)的痰濁、瘀血、水濕等病理產(chǎn)物都屬于內(nèi)生之毒,因此提出毒損腎絡的病機理論[25]。名中醫(yī)張炳厚認為DN初期多為氣陰兩虛、陰虛燥熱,繼而出現(xiàn)氣血凝滯,絡脈閉阻,日久耗傷腎之精氣,導致腎失封藏,精微下泄,因此提出“腎氣精兩虛,腎失封藏,腎絡閉阻”是DN的核心病機,并提出補腎活血通絡的治療原則。保腎通絡方即在上述治法指導下組方而成,由黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭、丹參等藥物組成。全方在補腎益氣藥物基礎上,加用蟲類藥物,共奏補腎活血通絡之功。臨床試驗已經(jīng)證實,保腎通絡方治療DN臨床療效甚佳[26]。但是,保腎通絡方防治DN的分子機制目前尚未闡明。

本實驗觀察了保腎通絡方對高糖培養(yǎng)足細胞細胞活性的影響。結果顯示,保腎通絡方含藥血清可提高高糖培養(yǎng)下足細胞細胞活性,減輕足細胞損傷,呈劑量依賴性。鑒于Nephrin、Desmin蛋白表達失調(diào)及細胞凋亡在足細胞損傷中的重要作用,本實驗進一步觀察保腎通絡方含藥血清對于高糖培養(yǎng)下足細胞Nephrin、Desmi表達及細胞凋亡的影響。實驗結果顯示,保腎通絡方可以上調(diào)高糖培養(yǎng)下足細胞Nephrin蛋白及mRNA表達,下調(diào)Desmin蛋白及mRNA表達。足細胞損傷早期表現(xiàn)為蛋白表達失調(diào),而到后期則會出現(xiàn)足細胞凋亡。因此,本實驗對不同組別足細胞凋亡及凋亡相關蛋白Caspase-3表達情況進行觀察。實驗結果顯示,高糖刺激可以引起Caspase-3蛋白表達上調(diào)及介導足細胞凋亡,保腎通絡方含藥血清可以明顯下調(diào)Caspase-3蛋白表達,抑制足細胞凋亡。

綜上所述,保腎通絡方可以減輕DN足細胞損傷,其機制可能與其上調(diào)足細胞Nephrin蛋白、下調(diào)Desmin蛋白表達,減輕足細胞凋亡有關。