兩個菜心CBL 基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其表達(dá)特性分析

朱云娜，符質(zhì)，馮慧敏，王斌，沈雪晴，湯婉君，劉建國

(1.廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

鈣作為第二信使在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要調(diào)控作用[1，2]。 鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)、類鈣調(diào)蛋白(CaM-likeprotein，CML)、類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like protein，CBL)和鈣依賴型蛋白激酶(Ca2＋-dependentproteinkinase，CDPK)是植物體內(nèi)常見的鈣感受器種類[3，4]。 除CDPK 中含有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域外，其他3 個鈣感受器都不含激酶結(jié)構(gòu)域，必須與靶蛋白結(jié)合形成復(fù)合體才能傳遞鈣信號[4，5]。

CBL 起源于綠藻和苔蘚，現(xiàn)廣泛存在于被子植物和裸子植物中，是一種古老的鈣感受器[6]，具有典型的結(jié)合Ca2＋結(jié)構(gòu)域——EF 手臂(EFhand)[1]。 類鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白激酶(CBLsinteracting protein kinases，CIPK)是CBL 特異結(jié)合的蛋白激酶，通過形成CBL-CIPK 復(fù)合體參與調(diào)控植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)[1，4，5]。 不同植物CBL 成員數(shù)量不同，擬南芥[1，7]、煙草[8]、黃瓜[9]、大白菜[10]中分別有10、20、6、13 個CBLs 成員。

植物CBLs 參與種子發(fā)芽、花粉管萌發(fā)等生長發(fā)育過程[1，2]，也參與響應(yīng)高鹽、低溫、干旱等逆境脅迫[1，4，11-13]。 CIPK23 在調(diào)控礦質(zhì)營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白方面具有重要作用[1，4，11-14]。 低鉀脅迫下，AtCBL1/AtCBL9 可將AtCIPK23 定位到質(zhì)膜，使其通過磷酸化激活鉀離子通道蛋白(ArabidopsisK＋transporter 1，AKT1)，從而增加擬南芥細(xì)胞對K＋的吸收[15]。 近年來的研究表明，水稻早期氮響應(yīng)因子在蛋白質(zhì)磷酸化等方面富集[16]，而氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性也依賴于外界氮信號所觸發(fā)的磷酸化[17]，因此，蛋白磷酸化在氮信號傳導(dǎo)、氮代謝方面發(fā)揮重要作用。 如:CBL-CIPK 復(fù)合體通過調(diào)控氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白磷酸化水平調(diào)控擬南芥氮信號通路[18-20]；AtCBL1/9-AtCIPK23 通過磷酸化修飾，調(diào)控擬南芥硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nitrate transporter 1.1，NRT1.1)親和性的轉(zhuǎn)變，以適應(yīng)不同濃度硝酸鹽(NO-3) 條件下對NO-3的吸收[18]；在高銨(NH＋4)脅迫下，AtCBL1-AtCIPK23 可調(diào)控銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ammonium transporter，AMT)AMT1.1 和AMT1.2 的磷酸化，使其失去活性，避免吸收過量NH＋4[19，21]。 我們最近研究發(fā)現(xiàn)，菜心銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BcAMT1s 可與CIPK23 互作[22]，菜心CIPK23表達(dá)受氮素水平和氮素形態(tài)的影響(待發(fā)表)。 不同CBLs 可能參與同一種非生物脅迫，相同CBL可能參與不同非生物脅迫響應(yīng)[1]。 為此，本文選擇可與CIPK23 互作的CBL1、CBL9 為研究對象，采用同源克隆法獲得菜心CBL1和CBL9的全長序列，并分析其生物學(xué)特性、組織表達(dá)特性以及對不同氮素形態(tài)的響應(yīng)，以期為提高菜心氮素吸收利用的作用機(jī)理研究提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

供試菜心(Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)品種為‘油綠501’(由廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育)，于2021 年3—5 月在廣東省韶關(guān)市韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院生態(tài)園玻璃溫室內(nèi)培養(yǎng)。 將菜心種子用7.5%的NaClO消毒10 min，用無菌水清洗4 ～5 次，然后播種于海綿塊上進(jìn)行育苗，待幼苗長至三葉一心時移植到改良霍格蘭營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。 之后根據(jù)不同試驗要求進(jìn)行處理、取樣。

1.1.1 基因表達(dá)組織特異性分析的樣品采集菜心幼苗移栽后生長30～40 d，待角果結(jié)莢后，分別取根、莖、葉、花、葉柄、莢果、花蕾、薹莖等組織樣品，用于基因表達(dá)的組織特異性分析。 每個樣品設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)取4 ～6 株，液氮速凍后保存在-80℃冰箱中備用。

1.1.2 不同水平氮素處理試驗的樣品處理 菜心移苗后在1 個劑量的改良霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d，取出用蒸餾水沖洗根部，然后轉(zhuǎn)移到缺氮營養(yǎng)液中再培養(yǎng)4 d，將菜心苗分苗移栽到1、4、8 mmol/L NH4Cl/NaNO3營養(yǎng)液中處理2 h，分別對葉片和根系進(jìn)行取樣，每個樣品設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)取4～6 株，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取及cDNA 合成

采用Eastep?Super 植物總RNA 提取試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]提取總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 菜心CBLs 基因克隆

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtCBL1、AtCBL9的基因序列，然后在大白菜(Brassica rapa)基因組進(jìn)行BLAST 比對，得到與其同源性最高的BrCBL1(XM_009138607.3)、BrCBL9(XM_009130690.3)基因序列。 菜心是大白菜的一個變種，親緣關(guān)系較近，因此根據(jù)大白菜BrCBL1、BrCBL9基因序列設(shè)計同源引物用于克隆菜心相應(yīng)的基因。 利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。 設(shè)置20 μL PCR 反應(yīng)體系:Primer star Max primer 10 μL，cDNA 模板鏈1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。 PCR 反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性5 min；98℃20 s，58℃20 s，72℃1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸1 min。

表1 所用引物及其序列

回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pMD20-T 載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，將經(jīng)PCR 鑒定的陽性克隆送廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用表2 所列軟件對菜心CBL1、CBL9基因編碼蛋白及其氨基酸序列進(jìn)行分析。

表2 所用軟件及其網(wǎng)址

1.5 基因表達(dá)量的qRT-PCR 分析

按照1.2 中的方法提取菜心樣品的RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA 樣品用RNase-Free ddH2O稀釋5 倍后作為模板，利用SYBR Green?PremixEx TaqTM進(jìn)行熒光定量PCR 分析。 擴(kuò)增體系:2×SYBR GreenTaqTM10 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，用RNase-Free ddH2O 補(bǔ)充到20.0 μL。 擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min，95℃10 s，60℃30 s，循環(huán)40 次。 以GADPH和Actin2為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計算基因相對表達(dá)量[23]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖

用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Duncan’s 法進(jìn)行顯著性分析，用SigmaPlot 11.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心CBL1、CBL9 基因的克隆

以菜心葉片cDNA 為模板，用CBL1-F、CBL1-R 和CBL9-F、CBL9-R 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均獲得約650 bp 的基因片段(圖1)。 經(jīng)測序，克隆得到的基因片段長度均為642 bp。 通過BLAST 在線比對，菜心CBL1基因片段與擬南芥的AtCBL1(NM_001341238.1)、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)的BnCBL1(XM_013881846.3)、大白菜的BrCBL1(XM_009138607.3)的核苷酸序列同源性分別為91.12%、98.29%、98.44%；而菜心CBL9基因片段與AtCBL9(NM _ 124081.4)、BnCBL9(XM _013840912.3)、BrCBL9(XM_009130690.3)的核苷酸序列同源性分別為92.21%、99.69%、99.69%。初步表明所克隆的兩個基因片段分別為菜心CBL1、CBL9基因序列。 將這兩個基因分別命名為BcCBL1、BcCBL9。

圖1 菜心CBL1、CBL9 基因的PCR 擴(kuò)增圖譜

2.2 BcCBL1、BcCBL9 的氨基酸序列分析

利用ProtParam 和ExPASyProtScale 對Bc-CBL1、BcCBL9 編碼蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，BcCBL1 編碼213 個氨基酸，分子量為24.60 kD，原子組成為C1109H1725N277O336S9，理論等電點(diǎn)(pI)為4.64，平均疏水率為-0.173，脂肪酸系數(shù)為89.20，不穩(wěn)定系數(shù)為36.35。 BcCBL9 編碼213 個氨基酸，分子量為24.41 kD，原子組成為C1097H1703N275O338S8，pI 為4.58，平均疏水率為-0.185，脂肪酸系數(shù)為88.31，不穩(wěn)定系數(shù)為34.69。 BcCBL1、BcCBL9 均為可溶性親水蛋白。 通過SignalP 5.0 預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)二者均無信號肽序列，為非分泌型蛋白。

BcCBL1、BcCBL9 均有多個絲氨酸磷酸位點(diǎn)(ser)和蘇氨酸磷酸位點(diǎn)(Thr)。 利用Cell-Ploc 2.0 和ProtCompv.9.0 預(yù)測BcCBL1、BcCBL9 亞細(xì)胞定位，均定位于細(xì)胞膜上；TMHMM Server 2.0分析結(jié)果表明二者均無跨膜結(jié)構(gòu)。

2.3 BcCBL1 和BcCBL9 的二、三級結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用Expasy 的SOPMA 對BcCBL1、BcCBL9蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果(圖2)顯示，BcCBL1 蛋白含有α-螺旋(alpha helix)50.70%、β-折疊延伸鏈(extended strand)11.74%、β-轉(zhuǎn)角(beta turn) 5.16%、 無 規(guī) 則 卷 曲(random coil)32.39%，而BcCBL9 蛋白的α-螺旋、β-折疊延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲分別為52.11%、7.98%、6.57%、33.33%。 可見，兩者的主要組成部分均為α-螺旋，β-折疊延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲則散布于蛋白結(jié)構(gòu)中。 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與該結(jié)果一致。 另外，BcCBL1 蛋白三級結(jié)構(gòu)為單體結(jié)構(gòu)，而BcCBL9 蛋白三級結(jié)構(gòu)為二聚體結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖2 BcCBL1 和BcCBL9 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3 BcCBL1、BcCBL9 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 BcCBL1、BcCBL9 氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將BcCBL1、BcCBL9 與AtCBL1(NP_567533.1)、AtCBL9(NP_199521.1)、BrCBL1(XP_009136855.1)、BrCBL9(XP_009128938.1)進(jìn)行氨基酸序列多重比對分析，結(jié)果(圖4)顯示，BcCBL1、BcCBL9 與兩個物種CBL1、CBL9 的氨基酸相似性介于95.31%～100%，其中， BcCBL1 與BrCBL1 相 似 性 高 達(dá)100%，BcCBL9 與BrCBL9 相似性為99.53%。

圖4 菜心、擬南芥、大白菜CBL1、CBL9 氨基酸序列多重比對結(jié)果

利用SMART 在線工具對兩個菜心CBL基因編碼氨基酸進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果(圖5)表明，Bc-CBL1、BcCBL9 均具有CBL 蛋白結(jié)合Ca2＋所必需的EF-hand 型結(jié)構(gòu)域(EFh)，保守結(jié)構(gòu)域均為3 個且位置相同，位于第71～99、108～136、152～180 位氨基酸，F(xiàn)ANRIFDMFDVKRKGVIDFGDFVRSLNVF(BcCBL1)和FANRIFDLFDVKRKGVIDFGDFVRSLNVF(BcCBL9)，KIDFTFRLYDMDCTGFIERQEVKQMLIAL (BcCBL1)和KTDFTFRLYDMDCTGFIERQEVKQMLIAL(Bc-CBL9)，ILDKTFEDADVNQDGKIDKLEWSDFVNKN(BcCBL1)和ILDQTFEDADVDRDGKIDKTEWSDFVIKN(BcCBL9)。

圖5 BcCBL1、BcCBL9 保守結(jié)構(gòu)域分析

進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖6)表明，BcCBL1 與BrCBL1親緣關(guān)系最近，BcCBL9 與BrCBL9 親緣關(guān)系最近，其次分別為AtCBL1 和AtCBL9，且菜心、大白菜、擬南芥的CBL1 與CBL9 同聚類在一個分支，而與擬南芥、大白菜的其他CBL 成員相距較遠(yuǎn)。進(jìn)一步表明本研究分離得到的2 個菜心CBL基因?qū)儆谥参顲BLs基因家族成員，編碼類鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白。

圖6 BcCBL1、BcCBL9 與擬南芥、大白菜CBLs 的進(jìn)化樹分析

2.5 BcCBL1、BcCBL9 在菜心不同器官中的表達(dá)分析

由圖7 可知，BcCBL1和BcCBL9在菜心根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果中均有表達(dá)。BcCBL1在菜心葉中表達(dá)量最高，顯著高于其他器官，其次為根、莖；在葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果中表達(dá)量相對較低，且器官間無顯著差異。BcCBL9在菜心莢果中表達(dá)量最高，其次為薹莖，兩者間差異顯著且均顯著高于其他器官；在葉、葉柄、花、根、莖中表達(dá)量相對較低，在花蕾中的表達(dá)量最低，顯著低于其他器官，僅為莢果中表達(dá)量的3.33%。

2.6 BcCBL1 和BcCBL9 對不同氮素形態(tài)的響應(yīng)

由圖8 可知，BcCBL1、BcCBL9表達(dá)量受氮素形態(tài)及其水平影響，二者表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。BcCBL1在低濃度氮條件表達(dá)量較高，表達(dá)量有隨氮濃度增加而明顯下降的趨勢；在8 mmol/L NO-3(或NH＋4)條件下，菜心根和葉中的BcCBL1表達(dá)量也較高，為1 mmol/L NO-3(或NH＋4)條件下的5.92%～41.41%。BcCBL1表達(dá)還受不同氮素形態(tài)影響，在相同濃度條件下，NH＋4處理的菜心根中BcCBL1表達(dá)量最高，NO-3處理的次之，NH4NO3處理的最低(圖8A)；在菜心葉中，BcCBL1表達(dá)也呈現(xiàn)出與根中類似的變化規(guī)律(圖8B)。

圖8 BcCBL1(A、B)和BcCBL9(C、D)對不同氮素形態(tài)的響應(yīng)

由圖8C 看出，在菜心根中，BcCBL9表達(dá)量隨著NH＋4濃度增加顯著增加，8 mmol/L NH＋4處理下最高，分別是中、低濃度NH＋4處理下的1.96 倍和48.16 倍；而在NO-3和NH4NO3處理下，隨其濃度增加，BcCBL9表達(dá)量均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，且不同濃度處理間差異顯著，但表達(dá)量最高值分別出現(xiàn)在低濃度和高濃度處理時。 在菜心葉中(圖8D)，BcCBL9表達(dá)水平隨NO-3濃度增加而降低，中、高濃度處理間表達(dá)量差異不顯著，但顯著低于低濃度處理；在NO-3和NH4NO3處理下，Bc-CBL9表達(dá)水平隨濃度的變化趨勢與根系中相似，但變化幅度略小，其中，中濃度與高濃度NH＋4處理間、低濃度與高濃度NH4NO3處理間差異不顯著。

此外，與BcCBL1相比，無論在菜心根還是葉中，BcCBL9均保持較高的表達(dá)水平，暗示兩基因可能在氮素吸收利用方面發(fā)揮著不同作用。

2.7 BcCBL1、BcCBL9 蛋白互作關(guān)系

在STRING 交互式數(shù)據(jù)庫中輸入BcCBL1、BcCBL9 蛋白序列，選擇“擬南芥”為所屬物種，利用擬南芥蛋白構(gòu)建互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，據(jù)此推測Bc-CBL1、BcCBL9 的互作蛋白。 由圖9 推測可知，BcCBL1 蛋白與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族(CIPK1、CIPK3、CIPK7、CIPK8、CIPK9、CIPK15、CIPK23、SOS2、SIP3)、鉀離子通道蛋白AKT1 具有互作關(guān)系；而BcCBL9 蛋白也可與AKT1 和CIPK 家族蛋白互作，但其互作網(wǎng)絡(luò)中未包含CIPK7 和CIPK15，此外，菜心BcCBL9 還可與免疫親和蛋白(FKBP12)和AT2G20050 蛋白互作。

圖9 BcCBL1(A)和BcCBL9(B)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論與結(jié)論

本研究從菜心中克隆到兩個完整的CBL基因——BcCBL1、BcCBL9，開放閱讀框均為642 bp，均編碼213 個氨基酸殘基；BcCBL1、BcCBL9 蛋白均具有CBL 蛋白結(jié)合Ca2＋所必需的EF-hand 結(jié)構(gòu)域；與大白菜、擬南芥CBL1、CBL9 的氨基酸序列同源性均在95%以上，聚類于同一進(jìn)化分支，但與其他CBL 成員的遺傳距離較遠(yuǎn)。BcCBL1、BcCBL9編碼蛋白均為穩(wěn)定性蛋白，具有較強(qiáng)的親水性，定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，與擬南芥AtCBL1、AtCBL9[24]和唐古特白刺N(yùn)t-CBL 的定位結(jié)果一致[11]。 CBL 定位于質(zhì)膜上表明其可能通過結(jié)合膜蛋白在細(xì)胞中發(fā)揮作用[11]。BcCBL1 和BcCBL9 蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成部分均為α-螺旋，散布β-折疊延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲；然而，BcCBL1 為單體結(jié)構(gòu)，BcCBL9 蛋白為二聚體結(jié)構(gòu)，暗示兩者可能發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。

基因在不同組織中的表達(dá)特性可能暗示其在相應(yīng)表達(dá)部位的生物學(xué)功能[25]。 在已研究的植物中，多數(shù)CBL在各個組織或器官中具有不同程度表達(dá)，在某些組織中具有表達(dá)優(yōu)勢[8]。 本研究結(jié)果表明，BcCBL1和BcCBL9在菜心根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果中均有表達(dá)，其中，Bc-CBL1在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在其他組織中，而BcCBL9在莢果中的表達(dá)量顯著高于在其他組織中，暗示兩基因可能分別主要在菜心葉和莢果生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

研究報道，CBL1/9 可與CIPK23 形成CBLCIPK 復(fù)合體參與擬南芥氮信號通路調(diào)控[18，19]，并可響應(yīng)低溫、高鹽、干旱、低鉀等多種逆境脅迫，在植物生長發(fā)育過程和非生物脅迫中具有重要作用[13，20]。 本研究結(jié)果表明，BcCBL1、BcCBL9 確實(shí)可響應(yīng)外界氮素變化，二者的表達(dá)水平不僅受不同氮素形態(tài)影響，也受氮素水平影響，但二者呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。 其中，BcCBL1在低濃度(1 mmol/L)單一氮源(NO-3或NH＋4)條件上調(diào)表達(dá)，而在中(4 mmol/L)、高濃度(8 mmol/L)或混合氮源(NH4NO3)條件下調(diào)表達(dá)，甚至不表達(dá)；BcCBL9在低濃度NH＋4條件下表達(dá)量低，在中、高濃度NH＋4條件下表達(dá)量高，而在NO-3和NH4NO3處理時，BcCBL9在低/高氮濃度下表達(dá)水平較高，在中等濃度下表達(dá)量較低。 這與AtCBL1/9受低濃度NO-3誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)而在高濃度NO-3時下調(diào)表達(dá)[18]的結(jié)論一致。Straub[24]報道，擬南芥AtCBL1表達(dá)依賴于NH＋4，缺氮后恢復(fù)供2 mmol/L NH＋4可誘導(dǎo)其表達(dá)，供NH＋430 min 時，AtCBL1表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后開始下降；而AtCBL9表達(dá)量在供NH＋430 min 后才開始增加，隨后基本無明顯變化。 本研究主要對供不同濃度不同形態(tài)氮素2 h后BcCBL1、BcCBL9基因在菜心中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并未比較不同供氮時間對二者表達(dá)量的影響，可在今后研究中增加該項目。

通過STRING 交互式數(shù)據(jù)庫，利用擬南芥CBL1、CBL9 蛋白構(gòu)建互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，據(jù)此推測菜心的BcCBL1 與CIPK1、CIPK3、CIPK7、CIPK8、CIPK9、CIPK15、CIPK23 等CIPK 家族成員及鉀離子通道蛋白AKT1 互作； 而BcCBL9 雖可與AKT1、CIPKs 互作，但CIPK 成員不包含CIPK7 和CIPK15， 此 外， BcCBL9 還 可 與 FKBP12 和AT2G20050 蛋 白 互 作。 STRING 數(shù) 據(jù) 庫 對AT2G20050 蛋白注釋為含有蛋白磷酸酶2C 和環(huán)核苷酸結(jié)合/激酶結(jié)構(gòu)域蛋白，參與調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化。AtCBL1/9受低濃度NO-3誘導(dǎo)表達(dá)，促進(jìn)其與CIPK23 形成復(fù)合體以調(diào)控AtNRT1.1 磷酸化水平，從而促進(jìn)NO-3運(yùn)輸[18]。 在擬南芥中，AtCBL1 與AtCIPK23 形成CBL-CIPK 復(fù)合體，參與調(diào)控AtAMT1.1 和AtAMT1.2 蛋白磷酸化水平，從而調(diào)控擬南芥根系對NH＋4的吸收，而AtCBL9并未參與調(diào)控[19，21，24]。 本研究發(fā)現(xiàn)菜心BcCBL1和BcCBL9表達(dá)均受不同氮素形態(tài)和氮素水平影響，二者在不同氮素形態(tài)下如何調(diào)控氮素吸收利用，是否存在功能冗余現(xiàn)象，仍需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究分離得到的BcCBL1、BcCBL9基因?qū)儆诓诵腃BL 基因家族成員，具有組織表達(dá)特異性，受氮素不同形態(tài)不同水平影響，但兩者表達(dá)模式不同，可能參與調(diào)控不同氮素條件下的氮吸收與利用過程，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。在今后研究中，可將氮素供應(yīng)時間進(jìn)一步細(xì)化，觀察BcCBL1、BcCBL9基因在不同供氮時間下的表達(dá)模式，再利用VIGS 對基因進(jìn)行沉默，驗證其功能。 本研究結(jié)果可對進(jìn)一步探究菜心氮素吸收利用分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。