3 種常見(jiàn)金銀花致病菌多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法研究

朱桐杉，劉艷艷，譚晴晴，劉國(guó)霞，陳雪燕，步迅，王文博，于子涵，4，張全芳，張永清

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，山東濟(jì)南 250100；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250013)

金銀花又名忍冬花，是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]，在我國(guó)分布廣泛。 主要有效成分為黃酮類(lèi)[2]、環(huán)烯醚萜類(lèi)[3]、揮發(fā)油類(lèi)[4]、酚酸類(lèi)等[5]。其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用非常廣泛，具有清熱解毒、通經(jīng)活絡(luò)、消炎消腫之功效[6]。

隨著金銀花種植年限的增長(zhǎng)，病蟲(chóng)害也逐漸加重，以葉部病害和根部病害為主。 其中炭疽病、褐斑病和白粉病是最常發(fā)生的葉部病害，褐斑病可導(dǎo)致葉片枯萎脫落；金銀花植株感染白粉病會(huì)導(dǎo)致花蕾發(fā)育畸形，嚴(yán)重時(shí)會(huì)大量落花；炭疽病侵染莖枝時(shí)會(huì)使枝條倒伏、枯死，影響植株生長(zhǎng)發(fā)育，降低花蕾的產(chǎn)量與品質(zhì)[7]。 目前對(duì)于金銀花病害的檢測(cè)手段較少。 傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法通常為病原菌分離后經(jīng)過(guò)柯赫氏法則結(jié)合分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定[8]，該過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，容易延誤病害防治時(shí)機(jī)。 做好金銀花病害的早期檢測(cè)、及時(shí)開(kāi)展防治工作，有效降低化學(xué)農(nóng)藥施用量，對(duì)于保證金銀花藥材產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。 因此建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)金銀花炭疽病、褐斑病及白粉病病原菌的方法，并應(yīng)用于3 種病害的早期防治是當(dāng)務(wù)之急。

前期在山東省臨沂市平邑縣金銀花主產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)并分離出炭疽病病原菌膠胞桿菌(Colletotrichum gloeosporioides)，并驗(yàn)證了病原菌的致病性[9]，結(jié)合已報(bào)道的金銀花主要葉部病害褐斑病病原菌鼠李尾孢(Cercospora rhamni)和白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)，基于ITS 序列分別設(shè)計(jì)了特異引物和TaqMan 探針，通過(guò)優(yōu)化PCR 體系和反應(yīng)條件建立了多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了金銀花炭疽病、褐斑病和白粉病病原菌的快速、準(zhǔn)確和高通量檢測(cè)，以期為及時(shí)有效地防治金銀花葉部病害提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)、炭疽病病原菌膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、褐斑病病原菌鼠李尾孢(Cercospora rhamni)、白絹病病原菌(Selerotium rolfsii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、金銀花葉斑病病原菌(Stemphyliumsp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)，保存于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所；用于驗(yàn)證試驗(yàn)的金銀花病害樣本采集于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園和山東省臨沂市平邑縣金銀花產(chǎn)區(qū)。

高效植物基因組DNA 提取試劑盒[DP350，天根生化科技(北京)有限公司]，DNA 分子量Maker DL2000[天根生化科技(北京)有限公司]，真菌基因組DNA 提取試劑盒(Axygen)，電泳上樣緩沖液[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 儀器與設(shè)備

Quant Studio7Flex 熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI)；Takara PCR 儀[寶生物工程(大連)有限公司]；Nano Drop Lite 超微量核酸檢測(cè)儀(賽默飛世爾)； 5424D 型高速離心機(jī)(Eppendorf 公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad 公司)；UV3600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。 引物和探針序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 使用Quant StudioTMReal-Time PCR Software 軟件進(jìn)行繪圖。 使用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行表格制作。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 3 種病原菌特異引物及TaqMan 探針設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 上的鼠李尾孢菌(Cercospora rhamni，GenBank 登錄號(hào)MT338042.1)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides， GenBank 登 錄 號(hào)MN833335.1)及白粉病病原菌(Erysiphe lonicera，GenBank 登錄號(hào)LC009992.1)序列，使用Primer premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)引物對(duì)和TaqMan 探針。引物及探針序列見(jiàn)表1。

表1 引物和探針序列

1.3.2 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 體系構(gòu)建 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系(20 μL):2×TaqMan Master Mix 10 μL，炭疽病病原菌上、下游引物和探針各1 μL，白粉病病原菌上、下游引物和探針各1 μL，褐斑病病原菌上、下游引物和探針各1 μL，DNA模板1 μL。 褐斑病引物和探針的終濃度分別為0.50 μmol/L 和0.40 μmol/L，白粉病引物和探針的終濃度為0.50 μmol/L 和0.40 μmol/L，炭疽病病原菌引物和探針的終濃度為0.25 μmol/L 和0.10 μmol/L。

多重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增條件:95℃2 min；95℃10 s，60℃35 s(在此階段收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 使用1.3.1 中金銀花褐斑病、白粉病及炭疽病病原菌特異引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，參考李敏[10]的方法進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建，對(duì)重組質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證是否正確插入目的片段。 DNA 測(cè)序在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所進(jìn)行。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 使用UV3600紫外分光光度計(jì)測(cè)定3 種病原菌陽(yáng)性重組質(zhì)粒DNA 濃度，將重組質(zhì)粒DNA 定量至2.94×108copies/μL，按照10 倍梯度稀釋成6 個(gè)濃度，每個(gè)梯度3 次重復(fù)。 反應(yīng)體系與程序按照1.3.2 進(jìn)行。根據(jù)重組質(zhì)?？截悢?shù)初始量值和閾值循環(huán)數(shù)(Ct)進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光PCR 體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。

1.3.5 引物和探針特異性檢測(cè) 分別以膠孢炭疽菌、鼠李尾孢菌、白粉病病原菌、白絹病病原菌、木霉菌、禾谷鐮刀菌、金銀花葉斑病病原菌、黑曲霉的基因組DNA 為模板，按1.3.2 中多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)條件及反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本3 次重復(fù)，驗(yàn)證引物和探針的特異性。

1.3.6 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法靈敏度驗(yàn)證 將重組質(zhì)粒DNA 定量至2.94×108copies/μL，按照10 倍梯度依次稀釋8 個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)3次，根據(jù)熒光信號(hào)值大小，評(píng)價(jià)相應(yīng)引物和探針對(duì)3 種病原菌的檢測(cè)靈敏度。 同時(shí)以此DNA 模板和表1 中特異引物進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)2 次。

普通PCR 擴(kuò)增體系:10×buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL、Taq酶(5 U)0.2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、DNA 模板(1～10 ng/μL)2.0 μL，ddH2O 16.3 μL；擴(kuò)增程序:95℃3 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 利用本研究建立的3 種病原菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法對(duì)從臨沂市平邑縣金銀花產(chǎn)區(qū)、山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園采集的15 份葉部病害樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)提取樣本DNA、使用真菌通用引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′，ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，切膠回收并測(cè)序。 將兩種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證本研究所建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的準(zhǔn)確性與可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以重組質(zhì)粒拷貝數(shù)初始量值為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，得到褐斑病線性回歸方程為y ＝-3.296x＋40.234，R2＝0.998；白粉病線性回歸方程為y ＝-3.374x＋40.374，R2＝0.996；炭疽病線性回歸方程為y ＝-3.470x＋43.092，R2＝0.996(圖1)。3 種病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.99，擴(kuò)增效率均接近100%，標(biāo)準(zhǔn)曲線橫縱坐標(biāo)間形成良好線性關(guān)系，表明該方法具有效性。

圖1 3 種病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 引物和探針特異性驗(yàn)證

按照1.3.5 方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證，當(dāng)ROX 熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線且滿足Ct≤35 時(shí)，說(shuō)明待檢樣本檢出炭疽病病原菌；當(dāng)FAM 熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線且滿足Ct≤35 時(shí)，說(shuō)明待檢樣本檢出白粉病病原菌；當(dāng)JOE 熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線且滿足Ct≤35 時(shí)，說(shuō)明待檢樣本檢出褐斑病病原菌；當(dāng)FAM、JOE 和ROX 熒光修飾探針均無(wú)擴(kuò)增曲線時(shí)，表明該檢測(cè)樣品為陰性。 由表2 可知，本試驗(yàn)建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法只能特異擴(kuò)增目的病原菌，對(duì)其他病原菌均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明本研究建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系的引物及探針的特異性良好。

表2 引物及探針特異性驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3 檢測(cè)靈敏度

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法和普通PCR 法對(duì)金銀花褐斑病、白粉病和炭疽病3 種病原菌靈敏度驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2A、B、C。 3 組重組質(zhì)粒在濃度29.4 copies/μL 時(shí)，Ct 值＞35，因此多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)3 種病原菌檢測(cè)最低檢測(cè)限為2.94×102copies/μL；在普通PCR 擴(kuò)增中，當(dāng)模板DNA 濃度為2.94×104copies/μL 時(shí)有明顯擴(kuò)增條帶，低于此濃度則無(wú)擴(kuò)增條帶，因此普通PCR 法 檢 測(cè) 靈 敏 度 為2.94 × 104copies/μL(圖2D)。 結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法的靈敏度比普通PCR 法高100倍。

圖2 3 種病原菌多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR(A、B、C)和常規(guī)PCR(D)擴(kuò)增體系靈敏度

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別使用本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法和DNA 測(cè)序法對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行檢測(cè)，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果檢測(cè)出炭疽病病原菌陽(yáng)性樣本4 份、白粉病陽(yáng)性樣本5 份、褐斑病陽(yáng)性樣本6 份，檢出率為100%，與DNA 測(cè)序結(jié)果完全一致(表3)。

表3 實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

金銀花為山東道地藥材之首，主產(chǎn)于山東省臨沂市平邑縣。 以花入藥，藥用歷史悠久。 性味甘寒，氣味芳香，有清透疏表、清熱解毒之效。 亦可食用，具有一定的保健功能，老少皆宜。

傳統(tǒng)植物病原菌通常使用組織分離法結(jié)合DNA 測(cè)序法進(jìn)行鑒定，如紫薯腐敗菌的分離和鑒定[11]、馬鈴薯赤霉病病原菌的分離和鑒定[12]等，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法可實(shí)現(xiàn)數(shù)個(gè)樣品的自動(dòng)化檢測(cè)，成本低，較普通PCR 技術(shù)所用時(shí)間短，能在病害初期進(jìn)行快速檢測(cè)[13]。 目前已經(jīng)建立了柑橘枯萎病病毒[14]、橄欖果實(shí)中敏感炭疽菌[15]等實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法。

褐斑病、白粉病及炭疽病是常見(jiàn)的3 種金銀花葉部病害，也是導(dǎo)致金銀花減產(chǎn)、降質(zhì)的重要原因。 感染白粉病時(shí)，葉部綠原酸含量降低[16]；褐斑病、炭疽病發(fā)病后期，斑點(diǎn)融合導(dǎo)致葉片呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則病斑，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致全株葉片脫落、植株枯死[17，18]，且病害后期致病菌可停留在土壤及病殘?bào)w中越冬。 李志紅等[19]對(duì)封丘金銀花炭疽病染病植株葉片進(jìn)行分離和檢測(cè)，得到炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；研究表明金銀花褐斑病病原菌為半知菌亞門(mén)鼠李尾孢(Cercospora rhamni)、金銀花白粉病病原菌為Erysiphe lonicera[20，21]。

目前對(duì)3 種金銀花病害的研究還停留在發(fā)病癥狀調(diào)查和病原菌分離鑒定階段，防治措施是在葉部出現(xiàn)明顯癥狀后進(jìn)行噴灑農(nóng)藥或剪去帶病枝條[22，23]，而針對(duì)3 種病害的分子檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、高通量、高敏感性等特點(diǎn)，在分子診斷、動(dòng)植物檢疫以及食品安全檢測(cè)等方面有廣泛應(yīng)用，提高了檢測(cè)時(shí)效性和靈敏度。 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法可在同一個(gè)檢測(cè)體系中對(duì)多個(gè)目標(biāo)序列同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，且能精確定量。 如利用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄定量PCR 技術(shù)快速檢測(cè)香蕉的枯萎芽孢桿菌[24]、菊花的花葉白銹菌及褐銹菌[25]、馬鈴薯中常見(jiàn)瘡痂病及病原菌[26]以及檢測(cè)羊奶中牛奶和大豆源性成分[27]。

本研究基于ITS 序列設(shè)計(jì)引物與TaqMan 探針，建立了可同時(shí)檢測(cè)金銀花褐斑病、白粉病及炭疽病3 種病害病原菌的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)體系，該方法最低檢測(cè)限度為2.94×102copies/μL，比普通PCR 方法提高100 倍，特異性強(qiáng)，可為金銀花葉部病害早診斷、早防治提供技術(shù)支持，彌補(bǔ)了金銀花炭疽病、褐斑病及白粉病病害檢測(cè)方法的缺失。 但本試驗(yàn)未曾對(duì)多種病害同時(shí)檢測(cè)進(jìn)行實(shí)際樣本驗(yàn)證，對(duì)于病原菌的鑒定停留在定性層面而未進(jìn)行定量計(jì)算，因此關(guān)于多種病原菌的同時(shí)檢測(cè)及其定量分析是下一步研究重點(diǎn)。