胡賽賽,萬磊,劉健,黃傳兵,李方澤,陳瑩瑩,程靜
1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230031
2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種較為復(fù)雜的自身免疫性疾病,可能會累及到身體的多個臟器和系統(tǒng),常見的有腎臟、心臟、肺部、腦、皮膚和血液等[1]。目前較常見的治療手段主要是糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑,近些年來生物制劑的應(yīng)用也逐漸廣泛起來[2]。目前患者的生存率已有大幅度的升高[3],但SLE患者臨床表現(xiàn)多樣,部分病人無法耐受糖皮質(zhì)激素的治療,且其不良反應(yīng)令人聞之色變,西醫(yī)治療目前可選擇的藥物還十分有限。SLE患者的臨床表現(xiàn)差異明顯,臨床表現(xiàn)各異也是其漏診率、誤診率高的一個原因,而這正與中醫(yī)學(xué)所遵循的“辨證論治”相呼應(yīng)。中醫(yī)治療可以根據(jù)病人相應(yīng)的癥狀提供個體化的治療方案,改善其癥狀,減輕西藥的不良反應(yīng),協(xié)助減少西藥用量等,最終達(dá)到提高生活質(zhì)量的目的[4]。知母、牡丹皮在治療SLE中應(yīng)用廣泛,但目前知母-牡丹皮治療SLE尚缺乏依據(jù)合理解釋其作用機(jī)制[5],本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法分析“知母-牡丹皮”治療 SLE 的有效成分及目標(biāo)靶點(diǎn),以期更好的探討知母-牡丹皮治療SLE的作用機(jī)制。
使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP,輸入知母、牡丹皮為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,制定篩選標(biāo)準(zhǔn):口服生物利用度(OB)≥30%、化合物類藥性(DL)≥0.18,篩選出知母-牡丹皮的有效成分,并統(tǒng)計其相應(yīng)的靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn),得到知母-牡丹皮有效成分及其相應(yīng)靶點(diǎn)。
以“Systemic Lupus Erythematosus”為檢索詞在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank及DisGeNE數(shù)據(jù)庫檢索SLE的疾病靶點(diǎn)。
使用Draw Venn Diagram 工具,將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮相關(guān)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入,得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖。將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮有效成分及其相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.1構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。
取SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮蛋白靶點(diǎn)的交集,將其導(dǎo)入String平臺,選擇 “Multiple proteins”,選擇物種為人類,構(gòu)建其PPI圖,再將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.9.1,進(jìn)一步對信息進(jìn)行分析,篩選出關(guān)鍵基因。
通過Metascape數(shù)據(jù)庫對篩選出來的交集基因進(jìn)行分析,使用ChiPlot繪制出富集分析的氣泡圖,以探討知母-牡丹皮對SLE在基因及信號通路中起關(guān)鍵作用的信息。
通過UniProt數(shù)據(jù)庫得到目標(biāo)靶點(diǎn)對應(yīng)的PDB ID,通過其ID號在PDB數(shù)據(jù)庫下載目標(biāo)靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu),使用PyMol軟件去除蛋白結(jié)構(gòu)外的其他小分子,再將其導(dǎo)入AutoDock Tools處理后設(shè)置為受體蛋白。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載有效成分的小分子結(jié)構(gòu),使用AutoDock Tools處理后設(shè)置為配體小分子。再進(jìn)一步進(jìn)行分子對接,將結(jié)合能最低的構(gòu)象導(dǎo)出作為最佳結(jié)合構(gòu)象,保存后用PyMol軟件對其進(jìn)行可視化處理。
在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中分別搜索知母、牡丹皮,設(shè)置OB≥30%和 DL≥0.18作為篩選條件進(jìn)行篩選,檢索出知母-牡丹皮中化合物共有16個,利用TCMSP數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出其相應(yīng)靶點(diǎn),其中知母168個、牡丹皮200個。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化命名后刪除其中的重復(fù)項,最終共獲得靶點(diǎn)193個。
以“Systemic Lupus Erythematosus”為檢索詞在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank和DisGeNET數(shù)據(jù)庫查詢疾病靶點(diǎn),分別得到4906、112、30、226、33個基因。對 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中得到的結(jié)果以Gifts大于等于平均值(≥29)進(jìn)行篩選得到基因3147個,將得到的所有基因進(jìn)行匯總,經(jīng)去重后共得到SLE相關(guān)疾病基因3224個。
將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮相關(guān)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venn Diagram 工具,得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖,得到交集靶點(diǎn)共127個(圖1)。將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮有效成分及其相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.1,結(jié)果顯示知母-牡丹皮中的16種活性化合物與127個疾病基因相互作用,共同構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(圖2)。分析計算得到degree值排名前五的活性化合物(表1),表明知母-牡丹皮中對SLE起主要治療作用的有效化合物主要為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、淫羊藿苷元(Anhydroicaritin)、豆甾醇(Stigmasterol)和薯蕷皂苷元(diosgenin)等。
表1 “知母-牡丹皮”主要活性化合物
圖1 “知母-牡丹皮”藥對與系統(tǒng)性紅斑狼瘡Venn圖
圖2 “中藥-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖
取SLE靶點(diǎn)與知母-牡丹皮靶點(diǎn)的交集,127個潛在靶點(diǎn),將其導(dǎo)入String平臺,選擇 “Multiple proteins”,選擇物種為人類,構(gòu)建其PPI初步圖,再將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1,使用Tools中的Analyze Network對信息進(jìn)行分析作圖,根據(jù)其Degree值進(jìn)行排序,并篩選出關(guān)鍵基因,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3),圖中degree值越大,則節(jié)點(diǎn)越大,顏色越深,靶點(diǎn)之間聯(lián)系越密切。排名前五的基因分別為AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53;這5個核心靶點(diǎn)蛋白間互作影響力最強(qiáng),能在復(fù)雜的疾病調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中直接或間接影響其他大部分靶點(diǎn)通路,可能是研究藥物治療SLE的關(guān)鍵。
圖3 知母-牡丹皮治療SLE潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖
通過Metascape數(shù)據(jù)庫對篩選出來的交集基因進(jìn)行KEGG、GO富集分析,結(jié)果顯示KEGG共獲得194條富集結(jié)果,GO共獲得1877條富集結(jié)果,其中GO生物過程(biological process,BP)1646條;GO分子功能(molecular function,MF)150條;GO細(xì)胞組分(cellular components,CC)81條。選取具有代表性的集群的富集結(jié)果進(jìn)行可視化分析,使用ChiPlot繪制出KEGG分析圖和GO分析圖(圖4、圖5),其中橫坐標(biāo)為GeneRatio,縱坐標(biāo)為富集到的結(jié)果名稱。這進(jìn)一步解釋了知母-牡丹皮治療SLE的潛在機(jī)制,幫助我們進(jìn)一步了解知母-牡丹皮治療疾病時參與的調(diào)節(jié)方式。
圖4 知母-牡丹皮和SLE“交集靶點(diǎn)”的KEGG富集分析
圖5 知母-牡丹皮和SLE“交集靶點(diǎn)”的GO富集分析
利用分子對接技術(shù)進(jìn)一步對得到的結(jié)果進(jìn)行分析,選擇篩選后得到的有效成分和目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行對接,對知母-牡丹皮中有效成分治療SLE的能力進(jìn)行評估。根據(jù)表1得到的結(jié)果,選擇來自知母-牡丹皮的槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蕷皂苷元這5個活性成分作為對接配體。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的關(guān)鍵基因,選取排名前5的核心靶點(diǎn):AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53作為對接受體。通過結(jié)合能(Affinity)來評估有效成分與目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合的緊密程度,結(jié)合能越低表明配體與受體之間的結(jié)合越緊密。表2列舉出了排名前15的對接結(jié)果。使用Pymol軟件對部分結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步處理(圖6),其中淺藍(lán)色為受體蛋白,深藍(lán)色為配體小分子,紅色為配體與受體結(jié)合的氨基酸殘基,黃色虛線為配體與受體之間形成的氫鍵。分子對接結(jié)果顯示有效成分與目標(biāo)靶點(diǎn)之間可以較好的結(jié)合。
表2 主要有效成分與目標(biāo)靶點(diǎn)對接結(jié)果
圖6 部分分子對接結(jié)構(gòu)圖
在本文所示的研究中,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出了16個知母-牡丹皮藥對的活性成分和127個與SLE相關(guān)的基因靶點(diǎn)。結(jié)果表明,知母-牡丹皮藥對在多組分和多目標(biāo)組合治療SLE中發(fā)揮一定的作用,對治療SLE具有潛在優(yōu)勢。有醫(yī)家認(rèn)為SLE在急性活動期的主要證型多為熱毒熾盛證,其治法多以清熱為主[6]。知母和牡丹皮同屬清熱藥,知母有清熱潤燥之效,牡丹皮有清熱涼血之效。本研究選取degree值排名前5的活性成分和排名前5的核心基因進(jìn)行分子對接,有效成分分別為槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蕷皂苷元,主要起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用;核心基因為AKT1、TNF、IL-6、VEGFA和TP53,主要在調(diào)節(jié)免疫、炎癥、調(diào)控細(xì)胞生長、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等方面起作用。
槲皮素廣泛存在于多種植物中,實(shí)驗研究表明槲皮素具有降血糖、抗過敏、抗炎、抗腫瘤等作用[7]。有研究表明槲皮素具有腎臟抗炎活性,主要通過抑制腎臟中的巨噬細(xì)胞極化抑制腎小管間質(zhì)損傷并且能夠減少機(jī)體中的炎癥因子[8]。槲皮素可以通過調(diào)節(jié)自身免疫,減少機(jī)體中的炎癥因子,改善患者的腎臟功能,對狼瘡腎炎有一定的指導(dǎo)意義[9]。山奈酚及其衍生物可以減少人體內(nèi)的脂質(zhì)氧化,防止器官和細(xì)胞結(jié)構(gòu)惡化,具有抗菌、抗癌、保護(hù)神經(jīng)和保護(hù)肝臟等作用[10]。淫羊藿苷元是一種主要來自中藥淫羊藿的化合物,研究表明淫羊藿苷元可以通過調(diào)節(jié)功能,進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放,從而恢復(fù)異常信號通路[11]。淫羊藿苷元可以抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性,從而抑制SLE患者免疫細(xì)胞的過度活化。且實(shí)驗證實(shí)其治療小鼠腎臟損傷有一定療效[12]。豆甾醇是一種植物甾醇,具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用,但其機(jī)制尚未明確。有研究表明,豆甾醇可以顯著抑制促炎介質(zhì)的表達(dá),促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá),從而改善機(jī)體的炎癥狀態(tài)[13]。薯蕷皂苷元已被證實(shí)具有抗氧化,抗炎和抗癌等的作用。薯蕷皂苷元可以明顯抑制巨噬細(xì)胞的活化,抑制CD4+T細(xì)胞增殖,阻礙Th1/Th17細(xì)胞分化[14]。AKT1在蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞凋亡過程中起到重要作用,AKT1的表達(dá)增加,會使促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加,進(jìn)而Treg相關(guān)基因表達(dá)增加,提示存在與炎癥活動相反的調(diào)節(jié)反饋[15]。TNF與自身免疫性疾病的易感性相關(guān),有研究表明SLE的疾病活動評分與TNF-α水平呈現(xiàn)正相關(guān)[16]。IL-6由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生,有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等作用[17],有研究表明IL-6水平在SLE患者中顯著高于健康人,在SLE患者中,活動期高于非活動期。靶向調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá),有望改善SLE患者的臨床癥狀[18]。VEGFA是一種多功能的細(xì)胞生長因子,能夠促進(jìn)新生毛細(xì)血管的生成,并且其是腎小球濾過屏障的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可能對治療狼瘡腎炎具有指導(dǎo)意義[19]。TP53是一種腫瘤抑制基因,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡和DNA修復(fù)的作用,有研究表明TP53與SLE發(fā)病之間存在顯著關(guān)聯(lián)[20]。通過以上作用機(jī)制的分析,為進(jìn)一步預(yù)測知母-牡丹皮對SLE的治療機(jī)制,我們對GO和KEGG進(jìn)行了富集分析。結(jié)果表明,知母-牡丹皮在治療SLE中參與了生物過程中的細(xì)胞對脂質(zhì)、無機(jī)物、脂多糖、激素、氮化合物的反應(yīng),對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等;分子功能中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白激酶活性等;細(xì)胞組分中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑復(fù)合物、膜筏、囊泡腔等。KEGG顯示知母-牡丹皮治療SLE涉及的通路主要有鈣信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、cAMP信號、松弛素信號通路及Apelin信號通路等。這些通路在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血流、信號傳導(dǎo)等方面有重要意義。
本文綜合了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接,初步從分子水平上展示了知母-牡丹皮的多組分、多靶點(diǎn)、多通道治療SLE的現(xiàn)代應(yīng)用價值,從而為知母-牡丹皮臨床治療SLE提供指導(dǎo)意義。