臭氧濃度升高對(duì)小白菜葉片生理特性的影響隨暴露時(shí)間的變化研究

高藝芹，王效科，萬(wàn)五星，馮美琪，張丹紅，耿春梅，殷寶輝，張楠，宋蕊，劉穎

（1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050016；2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085；3.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012）

對(duì)流層臭氧（O3）是由氮氧化物（NOX）、揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCS）等前體物質(zhì)通過(guò)一系列復(fù)雜的光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的二次污染物[1-2]。世界氣象組織（WMO）監(jiān)測(cè)O3發(fā)現(xiàn)，全球背景O3濃度年均增長(zhǎng)0.15 nmol·mol-1，全 球 城市O3濃 度年 均 增 長(zhǎng)0.31 nmol·mol-1[3]。生態(tài)環(huán)境部2022 年7 月31 日發(fā)布報(bào)告所示，O3已成為繼PM2.5后中國(guó)的另一項(xiàng)主要污染物。2022 年的調(diào)查表明中國(guó)O3污染最嚴(yán)重地區(qū)為華北平原，特別是京津冀城市及周邊地區(qū)[4]。O3污染呈現(xiàn)區(qū)域性、聚集性特征[5]。

O3作為一種強(qiáng)氧化性空氣污染物，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害生物健康[6]。大量研究表明，O3污染會(huì)對(duì)植物形態(tài)、生理和生產(chǎn)等方面產(chǎn)生一系列負(fù)面效應(yīng)，如：葉片可見(jiàn)明顯傷害癥狀（包括斑塊、斑點(diǎn)等）[7-8]，氣孔阻力增加，氣孔傳導(dǎo)降低[9-10]，膜系統(tǒng)破壞，光合色素含量減少，光合速率下降；玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativa）等農(nóng)作物生物量減少[11]。已有研究證明，隨著O3濃度升高和O3暴露時(shí)間累積，植物受影響的程度會(huì)不斷加重[12-13]?；谏飳?duì)環(huán)境變化的響應(yīng)和適應(yīng)的復(fù)雜性，依據(jù)植物對(duì)環(huán)境因子的生態(tài)適應(yīng)規(guī)律并結(jié)合R 語(yǔ)言的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可以得知植物對(duì)環(huán)境脅迫（包括空氣污染）的響應(yīng)程度（即敏感性），隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)可能會(huì)出現(xiàn)3 種情況：不變、增強(qiáng)和減弱。到目前為止，小白菜對(duì)O3的敏感性隨暴露時(shí)間的變化方面的數(shù)據(jù)還比較缺乏[14-15]。

選取十字花科蕓薹屬栽培植物小白菜（Brassica pe?kinensis）“正旺達(dá)88”為研究對(duì)象，采用開(kāi)頂式氣室（Open-Top-Chamber，OTC）開(kāi)展O3熏蒸實(shí)驗(yàn)，研究隨O3濃度升高和暴露時(shí)間延長(zhǎng)小白菜葉片生理參數(shù)的變化情況，為科學(xué)估算O3對(duì)蔬菜的危害程度提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究地點(diǎn)位于山東淄博市（36°57'N，118°13'E），該地區(qū)屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，屬半濕潤(rùn)氣候，氣候變化具有明顯的季節(jié)性。以小白菜“正旺達(dá)88”為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，“正旺達(dá)88”為雜交一代，速生，葉片油綠、平展、光滑，淡綠幫，生長(zhǎng)勢(shì)旺，抗病能力強(qiáng)，特抗熱、耐濕、耐寒。

實(shí)驗(yàn)采用圓柱形OTC 對(duì)小白菜進(jìn)行O3熏氣實(shí)驗(yàn)（圖1），氣室高2 m，底外切圓直徑3 m，體積約10 m3。為減少外部氣體對(duì)室內(nèi)氣體的影響，OTC 頂端增設(shè)45°收縮口（高0.8 m）。本研究中的O3以環(huán)境大氣作為氣源，由O3發(fā)生器（3S-A3，北京同林高科科技有限公司）發(fā)生不同濃度O3，通過(guò)控制高壓空氣流量來(lái)控制O3產(chǎn)生量。布?xì)夤苡梢桓睆綖? m、兩端密封的PVC 管加工而成，管路上分布等距離且與水平成45°夾角的小孔，滿足：①小孔總面積≥立管的橫截面積，以減少動(dòng)壓損失；②根據(jù)作用力與反作用力原理，與水平成45°夾角的小孔噴出的氣體為布?xì)夤芴峁┬D(zhuǎn)的推動(dòng)力；③從布?xì)夤苤行闹羶啥耍】组_(kāi)孔直徑逐漸增加以保證在水平截面上布?xì)獾木鶆蛐?；④布?xì)饪撞捎猛鈴酱笥趦?nèi)徑的喇叭型開(kāi)口，以降低對(duì)農(nóng)作物的直吹。PVC氣管與立管連接部分采用密封軸承，確保布?xì)夤苻D(zhuǎn)動(dòng)自如，且氣體沒(méi)有泄漏。此外，立管高度可隨作物株高調(diào)整，且保持布?xì)夤芟戮壘嚯x作物冠層≥50 cm。

圖1 O3熏蒸系統(tǒng)實(shí)景圖和通氣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Real picture of O3 fumigation system and structure picture of ventilation system

OTC 中加入不同濃度O3以獲得不同實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)O3濃度，分別為環(huán)境濃度（NF）、環(huán)境濃度+40 nmol·mol-1（NF40）、環(huán)境濃度+80 nmol·mol-1（NF80）、環(huán)境濃度+120 nmol·mol-1（NF120）。每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，共計(jì)12 個(gè)OTC。2021 年8 月5 日—9月1 日，小白菜進(jìn)行O3熏蒸。累積熏氣天數(shù)28 d，每天熏氣8 h（北京時(shí)間9：00—17：00），陰雨天（8 月20日、8 月25 日、9 月1 日共計(jì)3 d）不熏氣。O3濃度日變化特征如圖2所示。熏氣期間NF、NF40、N80和N120處理的實(shí)際O3濃度平均分別為49.13、90.81、124.78 nmol·mol-1和151.68 nmol·mol-1。

圖2 O3日平均濃度變化Figure 2 Variation of daily average concentration of O3

2021 年7 月18 日，將小白菜種子人工播種在不同處理的OTC 地面土壤內(nèi)。土壤0~20 cm 的有機(jī)質(zhì)含量為21.35 g·g-1，水解性氮、速效磷、速效鉀含量分別為126.2、30.0、316 mg·kg-1。在播種前，對(duì)土壤進(jìn)行統(tǒng)一殺菌和均勻施農(nóng)家肥（主成分為牛糞）處理，種植期間不再施加肥料。出苗后首先以漫灌方式將土壤澆透，然后以噴灌形式，約4 d 灌溉一次（雨天除外）。小白菜生長(zhǎng)出第2片真葉時(shí)開(kāi)始間苗。

1.2 試驗(yàn)方法

小白菜生長(zhǎng)出第一片完全成熟葉片標(biāo)記為第1葉位，按生長(zhǎng)先后順序標(biāo)記至第10葉位。小白菜首次出現(xiàn)O3癥狀后，每隔7 d采集植株的第5~7葉位葉片作為樣本（5~7葉位為開(kāi)始熏氣時(shí)完全展開(kāi)的葉），進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。每株采集2~3片葉片，每次每處理共計(jì)15片葉片，其中包含3個(gè)重復(fù)。全生育期4次采樣日期（4期）依次為8月12日、8月19日、8月25日和9月1日。

葉綠素（Chlorophyll，Chl）和類(lèi)胡蘿卜素（Caro?tene，Car）含量的測(cè)定：95%乙醇提取色素，充足時(shí)間暗處理后，測(cè)定470、664、649 nm 處吸光度，根據(jù)Li?chtenthaler[16]的修正公式計(jì)算Chl與Car含量。

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定：采用硫代巴比妥酸法[17]。

抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）含量的測(cè)定：采用Okamura（1980）還原Fe3+的方法測(cè)定還原型抗壞血酸（還原型AsA）與總抗壞血酸（總AsA）含量[18]。

可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量的測(cè)定：采用蒽酮比色法。使用Solarbio公司生產(chǎn)的植物可溶性糖含量檢測(cè)試劑盒（BC0035）檢測(cè)樣品[19]。

可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量的測(cè)定：在酸性乙醇溶液中，考馬斯亮藍(lán)G250 與蛋白結(jié)合后顏色由棕色變?yōu)樗{(lán)色，在595 nm 有最大吸收值。使用上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的Bradford 蛋白定量試劑盒（R-21252）檢測(cè)樣品[20]。

總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）的測(cè)定：酸性條件下，樣品中的抗氧化物質(zhì)還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生Fe2+-TPTZ，呈現(xiàn)出明顯藍(lán)色，于593 nm處有最大吸光度。使用上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（R-24147）檢測(cè)樣品[21]。

還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量的測(cè)定：谷胱甘肽與5，5'-二硫代-雙-2-硝基苯甲酸反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-巰基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物。2-硝基-5-巰基苯甲酸為黃色產(chǎn)物，在波長(zhǎng)412 nm 處具有最大吸光度。使用Solarbio公司生產(chǎn)的還原型谷胱甘肽含量檢測(cè)試劑盒（BC1175）檢測(cè)樣品[22]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性（Phosphoenolpyr?uvate carboxylase activity，PEPC）的測(cè)定：PEPC 催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2生成草酰乙酸和HPO2-4，蘋(píng)果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH 生成蘋(píng)果酸和NAD+，在340 nm 處測(cè)定NADH 減少速率，計(jì)算PEPC 活性。使用Solarbio 公司生產(chǎn)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性檢測(cè)試劑盒（BC2195）檢測(cè)樣品[23]。

生物量的測(cè)定：每隔10 d 采樣測(cè)定植株各器官（根、莖、葉）生物量并計(jì)算總生物量。隨機(jī)選取3 株新鮮植株樣品，將各器官分開(kāi)測(cè)定鮮質(zhì)量，然后分別于烘箱105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

O3暴露劑量AOT40（小時(shí)O3濃度大于40 nmol·mol-1的累積O3暴露值）的計(jì)算公式如下：

式中：CO3為太陽(yáng)總輻射大于50 W·m-2時(shí)的小時(shí)平均O3濃度。

利用R 語(yǔ)言lm（）函數(shù)建立各次測(cè)定的Chl、Car、SS、SP、PEPC、MDA、GSH、AsA、T-AOC 與O3暴露劑量AOT40的線性模型。根據(jù)線性模型得到截距、截距標(biāo)準(zhǔn)差，斜率、斜率標(biāo)準(zhǔn)差，分別估算截距的95%置信區(qū)間（截距CI，截距-截距標(biāo)準(zhǔn)差×1.96，截距＋截距標(biāo)準(zhǔn)差×1.96）和斜率的95%置信區(qū)間（斜率CI，斜率-斜率標(biāo)準(zhǔn)差×1.96，斜率＋斜率標(biāo)準(zhǔn)差×1.96）。截距代表非脅迫下小白菜生長(zhǎng)過(guò)程中的生理指標(biāo)變化。斜率代表小白菜生長(zhǎng)過(guò)程中的生理指標(biāo)對(duì)O3暴露的響應(yīng)敏感性。采用GraphPad Prism 9.3.1 軟件的Forest plot 分別繪制各次采集的葉片生理指標(biāo)的截距和斜率置信區(qū)間。

利用R4.2.1 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），在分析之前使用as.matrix（）函數(shù)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為矩陣，然后使用scale（）函數(shù)將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)Factomine R 程序包中的PCA（）函數(shù)，將主成分分析應(yīng)用于選定的AOT40 和生理指標(biāo)（Chl、Car、SP、SS、MDA、GSH、AsA和T-AOC），并通過(guò)Factoextra 程序包的fviz_pca_ind與fviz_pca_var函數(shù)進(jìn)行可視化圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 小白菜形態(tài)和生物量對(duì)O3濃度升高及暴露時(shí)間延長(zhǎng)的響應(yīng)

實(shí)驗(yàn)中，小白菜在不同濃度O3熏蒸下表現(xiàn)出不同程度的傷害癥狀，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)可見(jiàn)傷害癥狀加劇。在O3熏蒸3 d 時(shí)，NF120 組小白菜局部可觀測(cè)到受害癥狀，首先出現(xiàn)葉邊緣褪綠及黃化斑點(diǎn)。隨著O3熏蒸的累積，可見(jiàn)傷害癥狀由葉邊緣擴(kuò)散到葉中部區(qū)域乃至整個(gè)葉片。O3熏蒸累積28 d時(shí)，熏氣處理的葉片O3可見(jiàn)傷害癥狀占據(jù)葉片的大部分表面（圖3）。小白菜葉片黃化干枯且老化脫落葉片增多，說(shuō)明高濃度O3熏蒸、積累對(duì)小白菜葉片造成了傷害，加速了植株衰老的進(jìn)程。

隨著O3濃度升高，小白菜的各器官生物量和總生物量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖4）。熏氣28 d時(shí)，NF組與NF40、NF80、NF120 組的葉生物量與總生物量存在顯著性差異（P<0.05）；與NF 組相比較，NF40 組小白菜根、莖、葉和總生物量分別減少了30.23%、62.91%、94.71% 和124.28%，NF80 組 分 別 減 少 了20.93%、33.73%、101.68%和133.32%，NF120 組分別減少了41.86%、140.86%、137.91%和185.01%。

圖4 小白菜各器官生物量隨O3濃度和熏蒸時(shí)間的變化Figure 4 Changes of organ biomass of Brassica pekinensis with O3 concentration and fumigation time

2.2 小白菜生理指標(biāo)對(duì)O3濃度升高及暴露時(shí)間延長(zhǎng)的響應(yīng)

2.2.1 光合生理相關(guān)參數(shù)

從不同采樣日期的葉片光合色素（Chl 和Car）含量和光合作用PEPC 活性與AOT40 線性模型參數(shù)（圖5 中a、b、c、d、e、f）可以看出，模型截距從熏氣第7 天到第28 天呈先略微增加后減少的趨勢(shì)，說(shuō)明隨小白菜生長(zhǎng)，葉片光合色素含量和PEPC 活性先增后減。但各期測(cè)定得到的模型截距CI 重疊，說(shuō)明隨小白菜生長(zhǎng)，葉片光合色素含量和PEPC 活性沒(méi)有發(fā)生顯著變化。光合色素含量的模型斜率CI 小于0 且與0 不重疊，說(shuō)明O3脅迫造成葉片光合色素含量顯著降低。光合色素含量的模型斜率CI 在熏氣前3 期逐步增加后減少，且斜率CI 在第1 期和第3 期存在不重疊現(xiàn)象，說(shuō)明葉片光合色素含量對(duì)O3的敏感性隨O3暴露時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)顯著減弱，至第28 天時(shí)敏感程度不存在顯著差異。PEPC 活性的模型斜率CI 與0 重疊，說(shuō)明O3對(duì)PEPC活性沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。

圖5 光合生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型的截距和斜率的95%置信區(qū)間（CI）Figure 5 The 95%confidential interval of intercept and slope of the linear model between photosynthetic physiological indicators and O3exposure dose（AOT40）

從葉片SS 和SP 含量與AOT40 線性模型參數(shù)（圖5 中g(shù)、h、i、j）可以看出，模型截距CI 從熏氣第7 天到第28 天呈逐漸減少趨勢(shì)，并且SP 后兩期的模型截距CI 與前兩期不重疊，說(shuō)明SP 含量隨小白菜生育進(jìn)程推移明顯減少。SS模型斜率CI大于0且與0不重疊，說(shuō)明隨O3暴露劑量AOT40 增加，葉片SS 含量顯著增加。SS 模型斜率CI 在熏氣前期較大而后期明顯變小，但各次模型斜率CI 存在重疊，說(shuō)明葉片SS 對(duì)O3的敏感性隨暴露時(shí)間無(wú)顯著變化。SP模型斜率CI小于0 且不與0 重疊，說(shuō)明隨O3暴露劑量AOT40 增加，葉片SP含量顯著減少。SP模型斜率CI從熏氣第7天后一致增加，且后3 期與第1 期不重疊，說(shuō)明葉片SP對(duì)O3的敏感性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)顯著減少。

2.2.2 抗氧化生理相關(guān)參數(shù)

由葉片MDA、還原型AsA、總AsA 和T-AOC 與AOT40 線性回歸模型參數(shù)（圖6 中a、b、c、d、e、f、g、h）分析得知，模型截距CI 在熏氣周期內(nèi)呈先略增加后減少的趨勢(shì)，說(shuō)明隨小白菜生長(zhǎng)，葉片MDA、還原型AsA、總AsA 及T-AOC 先增后減。且還原型AsA 含量的前兩期模型截距CI 不存在重疊，MDA 和總AsA含量及T-AOC 各期測(cè)定得到的模型截距CI 存在重疊，說(shuō)明隨小白菜生長(zhǎng)，葉片還原型AsA 含量前兩期出現(xiàn)顯著增加，葉片MDA、總AsA和T-AOC含量不存在顯著性變化。

圖6 抗氧化生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型的截距和斜率的95%置信區(qū)間（CI）Figure 6 The 95%confidence interval of intercept and slope of linear model of plant antioxidant physiological index and ozone exposure dose（AOT40）

MDA含量的模型斜率CI大于0并且不與0重疊，說(shuō)明隨著O3暴露劑量AOT40增加MDA含量會(huì)顯著增加（P<0.05）。MDA 含量的模型斜率CI 在熏氣前3 期呈先減少后略增加趨勢(shì)。后3 期測(cè)定得到的模型斜率CI 與第1 期不存在重疊現(xiàn)象，說(shuō)明葉片MDA 含量隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)O3的敏感性顯著下降。還原型AsA、總AsA 和T-AOC 的模型累積熏蒸7 d 時(shí)存在斜率CI 與0 重疊的情況，說(shuō)明O3脅迫對(duì)還原型AsA、總AsA 和T-AOC 的影響隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)不存在顯著性變化。

從葉片GSH 含量與AOT40線性模型參數(shù)（圖6中i、j）可以看出，GSH 模型截距CI在熏氣期間呈增加趨勢(shì)。O3暴露20 d后，GSH模型截距CI與無(wú)效線0不重疊，說(shuō)明GSH含量在生長(zhǎng)后期發(fā)生了顯著增加。GSH模型斜率CI大于0且與0不重疊，說(shuō)明隨著O3暴露劑量AOT40 增加，葉片GSH 含量顯著增加。GSH 模型斜率CI 在熏氣前期大而后期明顯變小，但各期模型斜率CI 存在重疊，說(shuō)明O3對(duì)葉片GSH 的敏感度隨暴露時(shí)間沒(méi)有顯著變化。

2.3 小白菜生理指標(biāo)對(duì)O3濃度升高及暴露時(shí)間延長(zhǎng)響應(yīng)的綜合分析

采用主成分分析對(duì)O3濃度升高與暴露時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)各生理指標(biāo)的響應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，從主成分分析的二序圖（圖7b 和圖7d）可以看出，Dim1 和Dim2 共同解釋了小白菜生理指標(biāo)值總方差的64.4%。Dim1 解釋了方差的37.3%（圖7d），反映了O3暴露濃度越高，處理組與NF 組離散程度越高，說(shuō)明O3暴露濃度對(duì)小白菜的影響越大。Dim2 解釋了方差的26.9%（圖7b），反映了暴露時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)小白菜生長(zhǎng)的影響，其中7~14 d 離散程度最大，與后兩期離散程度減少，說(shuō)明隨著O3暴露時(shí)間延長(zhǎng)，小白菜對(duì)O3脅迫的敏感度有所減小。指標(biāo)變量間夾角越小，表示變量間相關(guān)性越高（圖7 中a、c）。由圖可將研究指標(biāo)分成3 組：第1 組為Chl、Car 和SP，與光合作用和營(yíng)養(yǎng)有關(guān)；第2 組為MDA、SS 和GSH，與細(xì)胞膜透性、能量供應(yīng)和抗氧化能力有關(guān)；第3 組為PEPC、T-AOC 和AsA，與光合作用和抗氧化能力有關(guān)。MDA 和SS與Dim1夾角很小，說(shuō)明這兩個(gè)指標(biāo)與Dim1 的關(guān)系比較密切，即與O3暴露濃度的關(guān)系比較密切。而其他指標(biāo)與Dim1 和Dim2 的夾角幾乎相等，說(shuō)明這些指標(biāo)同時(shí)受到O3暴露濃度和暴露時(shí)間的影響。

圖7 O3濃度與熏蒸時(shí)間對(duì)小白菜生理指標(biāo)影響的主成分分析Figure 7 Principal component analysis of the effects of O3 concentration and fumigation time on physiological indexes of Brassica pekinensis

3 討論

3.1 小白菜生理指標(biāo)隨生長(zhǎng)的變化

本研究自然狀態(tài)下（即沒(méi)有接受O3暴露），在小白菜的生長(zhǎng)過(guò)程中，其葉片內(nèi)Chl、Car 含量先增加后減少，PEPC 活性在初期小幅增長(zhǎng)然后下降，SS 含量總體呈下降趨勢(shì)，SP 含量在初期略增長(zhǎng)后顯著降低。這可能是因?yàn)樾“撞松L(zhǎng)期間需要合成大量光合色素進(jìn)行光合作用并積累有機(jī)物，生長(zhǎng)后期植株衰老、葉片枯黃、色素降解，并且小白菜自然衰老會(huì)促進(jìn)SP分解[24]。葉片內(nèi)MDA 含量、T-AOC 初期增加后期減少，還原型AsA與總AsA在初期呈動(dòng)態(tài)平衡至后期總體減少，GSH含量增加。這可能是因?yàn)槊鎸?duì)其他環(huán)境脅迫，小白菜膜系統(tǒng)受損，抗氧化物質(zhì)增加[24]。

3.2 O3濃度升高對(duì)小白菜生理特征的影響

本研究表明，高濃度O3會(huì)導(dǎo)致葉片產(chǎn)生褪綠、黃化斑點(diǎn)等傷害癥狀，O3傷害癥狀首先出現(xiàn)在葉片葉肉部分，主葉脈與小葉脈沒(méi)有出現(xiàn)受害癥狀。O3對(duì)于作物葉片的解剖學(xué)影響首先表現(xiàn)為危害柵欄組織，使其質(zhì)壁分離，細(xì)胞內(nèi)含物受到破壞且分散[25-26]。隨著O3暴露時(shí)間延長(zhǎng)，葉片光合色素減少，上表皮的壞死斑點(diǎn)變大，互相融合，最后傷害到海綿組織，形成兩面壞死斑，同時(shí)葉肉組織減少，葉片變薄，葉邊卷曲[27-29]。本研究中高濃度O3脅迫下，小白菜葉片受傷害面積逐漸增大，葉片變黃、脫落，最終導(dǎo)致生物量降低。同時(shí)傷害癥狀對(duì)生理指標(biāo)光合色素的下降做了進(jìn)一步驗(yàn)證。已有研究表明，O3濃度升高可以顯著誘導(dǎo)濕地松（Pinus elliottii）針葉凋落，使葉面積減小，最終抑制濕地松的生長(zhǎng)[30]。

根據(jù)研究小白菜生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型斜率的正負(fù)及是否與0重疊的結(jié)果顯示，O3濃度升高顯著降低了小白菜的光合生理特性（P<0.05），顯著增加了小白菜生理參數(shù)（P<0.05），而小白菜的PEPC 活性略微升高但沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，說(shuō)明高濃度O3脅迫破壞了葉片光合組織，減少了色素含量，改變了色素組成，使光合膜系統(tǒng)受損，導(dǎo)致小白菜光合反應(yīng)速率下降[31]。O3誘導(dǎo)葉片Chl 和Car 含量的減少與已有文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果相同[32-33]。SS、SP是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，高濃度O3脅迫下SS 含量增加可防止細(xì)胞失水過(guò)多，從而減少脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害。O3脅迫下的小白菜葉片SS 含量增加與莊明浩等[34]對(duì)毛竹（Phyllostachys edulis）和四季竹（Oligostachyum lubricum）的研究結(jié)果相似。而隨著AOT40 增加，小白菜葉片SP 含量顯著降低，這可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)SP 含量下降而氨基酸增加[35]。逆境脅迫下，光抑制現(xiàn)象在C3植物中普遍存在。本研究中PEPC 活性升高，說(shuō)明O3濃度升高誘導(dǎo)了PEPC 活性增加，從而增強(qiáng)小白菜對(duì)高濃度O3的抗性。本研究PEPC 活性升高的結(jié)果與前人研究中菜豆（Phaseolus vulgaris）和濕地松（Pinus elliottii）的PEPC 活性上升的結(jié)果相似[36-37]。

O3具有強(qiáng)氧化性，其進(jìn)入植物細(xì)胞后會(huì)進(jìn)行氧化分解產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2）、氣態(tài)O2、活性氧（ROS）、自由基等產(chǎn)物[38-40]，這些活性氧、自由基等產(chǎn)物使植物葉片細(xì)胞中多種功能膜和酶系統(tǒng)被破壞，產(chǎn)生葉片傷害[41]，誘發(fā)膜脂過(guò)氧化[42]。MDA 為膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，MDA 含量顯著增加，代表膜受損程度增大，這與前人研究矮化自根砧木M9T337 的結(jié)果相同[43]。AsA與GSH是細(xì)胞內(nèi)的一種抗氧化劑[44]，GSH能幫助植物保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，主要在AsA-GSH 循環(huán)中起主要作用[45]。小白菜體內(nèi)GSH 含量和T-AOC 增加，以清除植物各項(xiàng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，緩解膜脂過(guò)氧化傷害[46]，這與前人研究甜菜（Beta vulgaris）和菠菜（Spina?cia oleracea）的相關(guān)結(jié)果基本一致[47-48]。

綜上，在高濃度O3脅迫下，小白菜光合生理指標(biāo)含量下降，整體光合效率降低，以致小白菜生物量受損嚴(yán)重。因此，O3污染可能會(huì)對(duì)小白菜類(lèi)葉菜的生長(zhǎng)及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值帶來(lái)不利影響。

3.3 小白菜生理指標(biāo)對(duì)O3污染的敏感性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)的變化

根據(jù)小白菜生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型斜率在不同觀測(cè)時(shí)間是否存在顯著性差異，可以看出小白菜生理指標(biāo)敏感性（即指標(biāo)對(duì)單位O3暴露劑量變化的響應(yīng)大小）是否隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生顯著變化，結(jié)果表明隨著O3暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，初期Chl、Car、SP、MDA 的斜率參數(shù)顯著降低，熏氣28 d 時(shí)略有上升。綜上說(shuō)明小白菜葉片Chl、Car、SP、MDA含量對(duì)O3影響的敏感性會(huì)隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)整體下降。這是因?yàn)殡S著O3熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)，小白菜會(huì)產(chǎn)生一定的適應(yīng)能力和抗性，以致光合生產(chǎn)能力（Chl 含量）和氧化能力（MDA 含量）對(duì)O3暴露劑量的敏感性變?nèi)?，O3對(duì)小白菜葉片的生理影響并沒(méi)有出現(xiàn)快速惡化的現(xiàn)象。已有研究報(bào)道，對(duì)于高濃度O3處理的銀杏（Ginkgo biloba），隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其葉片光合參數(shù)對(duì)O3脅迫的敏感性下降[49]；油松（Pinus tabuliformis）針葉的膜脂過(guò)氧化程度隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，高濃度O3引起的MDA增加量（相對(duì)于對(duì)照）會(huì)變大[50]，但如果考慮熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)的O3累積因素，單位暴露累積劑量引起的光合作用下降幅度并不會(huì)明顯增加，同樣單位暴露累積劑量引起的MDA增加幅度也不會(huì)明顯增加。

在其他環(huán)境脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，植物生理指標(biāo)對(duì)脅迫暴露累積劑量的敏感性下降。例如高粱（Sorghum bicolor）Moench H21 幼苗Chl對(duì)長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫的敏感性降低[51]。隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，油菜（Brassica napus）葉片SP、MDA 對(duì)長(zhǎng)時(shí)間干旱脅迫敏感度整體呈下降趨勢(shì)[52]。隨著高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，蝴蝶蘭（Phalaenopsis sp.）幼苗葉片Chl、SP、MDA 對(duì)長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫敏感性整體下降[53]。這也意味著單采用線性的O3暴露劑量響應(yīng)關(guān)系，有時(shí)會(huì)高估O3暴露對(duì)小白菜一些生理指標(biāo)的影響，因此需結(jié)合O3熏蒸累積，進(jìn)一步驗(yàn)證植物對(duì)O3脅迫的敏感性。

由主成分分析可知，O3濃度越高，小白菜植株生理指標(biāo)受O3脅迫的影響越大（圖7b、圖7d），說(shuō)明O3對(duì)小白菜葉片生理指標(biāo)的影響是同時(shí)受到O3暴露濃度和時(shí)間的影響。不同生理指標(biāo)受O3暴露濃度和熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)的影響程度存在差異（圖7a、圖7c）。反映細(xì)胞膜透性（MDA）和能量供應(yīng)（SS）的2 個(gè)指標(biāo)與O3暴露水平的關(guān)系更加密切。

4 結(jié)論

（1）隨著O3濃度升高，小白菜葉片的葉綠素（Chl）、類(lèi)胡蘿卜素（Car）和可溶性蛋白（SP）含量減少（P<0.05），丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA）以及總抗氧化能力（TAOC）增加，表明O3濃度升高會(huì)造成小白菜葉片中光合色素下降和生理傷害增加，并誘使小白菜抵御O3脅迫的抗氧化能力增強(qiáng)。

（2）隨著O3暴露時(shí)間延長(zhǎng)，葉片中Chl、Car、SP、MDA 對(duì)O3的敏感性減弱（P<0.05），而SS、GSH、AsA、T-AOC 對(duì)O3敏感性沒(méi)有顯著變化，表明O3對(duì)小白菜葉片生理特征的影響強(qiáng)度會(huì)隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而下降，小白菜對(duì)O3脅迫的敏感性隨時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)出下降的特征。

（3）通過(guò)主成分分析，將受O3影響的小白菜葉片的指標(biāo)按相關(guān)性劃分成三類(lèi)，分別是：Chl、Car 和SP；MDA、SS 和GSH；PEPC、T-AOC 和AsA。這些指標(biāo)的變化與O3暴露水平和暴露時(shí)間有關(guān)，其中反映細(xì)胞膜透性（MDA）和能量供應(yīng)（SS）的2 個(gè)指標(biāo)與O3暴露水平的關(guān)系更加密切。