還原敏感性兩親性聚合物的合成及載藥性能的研究

李世璽,劉雪,梁旭華,程敏

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000)

近年來癌癥頻發(fā),每年都有數(shù)以百萬計(jì)的患者死于癌癥及相關(guān)疾病,對(duì)人類健康構(gòu)成了極大的威脅[1]。在治療癌癥的眾多方案中,化療是最為常用的一種治療方法[2]。然而很多化療藥物在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞和組織造成一定的毒副作用,影響了其在臨床上的應(yīng)用[3]。為了提高化療藥物的生物利用度和降低對(duì)患者的毒副作用,藥物運(yùn)載體系的研發(fā)受到了持續(xù)的關(guān)注[4]。由于具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),生物刺激信號(hào)如酶、氧化還原、葡萄糖、pH值和溫度已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于響應(yīng)性可控釋放的藥物載體的設(shè)計(jì)當(dāng)中[5-7]。在這些生物刺激信號(hào)中,還原敏感性在藥物載體設(shè)計(jì)中的應(yīng)用格外引人注目[8-11]。正常體液中谷胱甘肽的濃度(2～20 μmol/L)遠(yuǎn)低于癌細(xì)胞中的(2～20 mmol/L)[12-13],利用其谷胱甘肽的濃度差異,通過在納米載體結(jié)構(gòu)中引入還原響應(yīng)性結(jié)構(gòu)或者官能團(tuán)[14],可以制備具有還原響應(yīng)性的藥物運(yùn)載體系。至今已經(jīng)有一系列的還原敏感性納米顆粒被用于藥物運(yùn)載體系的制備當(dāng)中[15-24]。

綜合利用開環(huán)反應(yīng)(ROP)和原子轉(zhuǎn)移自由基反應(yīng)(ATRP),制備了一系列新型兩親性嵌段共聚物PLAn-SS-PHEMAm。聚合物可自組裝成均一膠束,利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)研究膠束的粒徑尺寸和形貌,通過熒光蛋白法檢測(cè)其臨界膠束濃度。隨后依次研究了其穩(wěn)定性、血液相容性和細(xì)胞毒性。通過透析法阿霉素可以有效地負(fù)載于膠束內(nèi)部而形成均一的載藥膠束,考察了載藥膠束的體外藥物釋放性能。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要原料

實(shí)驗(yàn)所用試劑如無特別說明均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。2,2′-二硫代二乙二醇(SS-DOH,90%),甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA,97%)購于Acros公司。2-溴-2-甲基丙酸(98%)購于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司。溴化亞銅(CuBr,≥98.5%)、2,2′-聯(lián)吡啶(bpy,≥99.5%)及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,≥ 95%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。二甲氨基吡啶(DMAP)購于百靈威。辛酸亞錫(Sn(Oct)2,95%)購于阿拉丁。D,L-丙交酯(D,L-LA,≥99.0%)購于上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司。二硫蘇糖醇(DTT,>98%)購自默克公司。阿霉素鹽酸鹽(DOX·HCl)購自上海英軒公司。

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(青霉素-鏈霉素)購于Gibco公司。胎牛血清購于Hyclone公司。人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)。SD大鼠(雄性,250 g)購于武漢大學(xué)中南醫(yī)院。

1H NMR的檢測(cè)由Mercury VX-300型核磁共振波譜儀于300 MHz下完成,常用溶劑為CDCl3或DMSO-d6,四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)。由Hitachi F-4500熒光光譜儀測(cè)定相關(guān)的熒光性質(zhì)。聚合物膠束粒徑及粒徑分布由Malvern Zetasizer Nano ZS測(cè)定。膠束的形貌則利用JEM-100CX II透射電子顯微鏡觀察,加速電壓為100 kV。聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量及分布由Waters 2690D-2410 GPC凝膠色譜系統(tǒng)檢測(cè),采用Styragel脂溶性凝膠柱(Waters,Styragel HR3),檢測(cè)參數(shù)為:流速為0.300 mL/min,柱溫和顯示器溫度均為40 ℃,聚甲基丙烯酸甲酯作為標(biāo)準(zhǔn)品,DMF為溶劑。血紅蛋白的吸光值經(jīng)由紫外可見分光光度計(jì)(Perkin-Elmer,Lambda 35)來檢測(cè)。細(xì)胞毒性則利用酶標(biāo)儀(Bio-Rad 550,Hercules,CA,USA)進(jìn)行測(cè)定。

1.2 兩親性聚合物的合成

1.2.1 PLA-SS-iBuBr與PLA-CC-iBuBr的合成

參考文獻(xiàn)[24]方法合成HO-SS-iBuBr和HO-CC-iBuBr。利用HO-SS-iBuBr引發(fā)D,L-LA的開環(huán)反應(yīng)制備PLA-SS-iBuBr:HO-SS-iBuBr(90.1 mg,0.3 mmol)、D,L-LA(3.0 g,20.8 mmol)、Sn(Oct)2(0.4 mL,0.04 mmol)和甲苯(2 mL)加入舒?zhèn)惪斯苤小；旌衔锿ㄟ^三次“冷凍-抽換氣-解凍”徹底除水除氧。將其在Ar氣氛下加熱至120 ℃進(jìn)行聚合,反應(yīng)8 h后冷卻至室溫通大氣終止反應(yīng)。聚合物用甲醇進(jìn)行沉降,所得固體于40 ℃真空干燥24 h,即得白色粉末狀中間體,產(chǎn)率86%。PLA-CC-iBuBr的合成參照上述方法,以HO-CC-iBuBr替代HO-SS-iBuBr,可得白色粉末狀產(chǎn)物,產(chǎn)率81%。

1.2.2 PLA-SS-PHEMA與PLA-CC-PHEMA的合成

通過PLA-SS-iBuBr引發(fā)HEMA的ATRP反應(yīng)制備PLA-SS-PHEMA:PLA-SS-iBuBr(0.50 g,0.083 mmol)、HEMA(0.87 g,0.8 mL,6.7 mmol)、聯(lián)吡啶(26.04 mg,0.17 mmol)與CuBr(11.68 mg,0.083 mmol)投入舒?zhèn)惪斯?密封后通過抽放氣除氧,加入2 mL甲苯/甲醇(V甲苯∶V甲醇=65∶35)使之溶解?；旌衔锿ㄟ^三次“冷凍-抽換氣-解凍”徹底除水除氧。解凍后于70 ℃聚合,反應(yīng)8 h后冷卻至室溫通大氣終止反應(yīng)。采用氧化鋁柱層析法除催化劑,氯仿/甲醇作為洗脫劑。洗脫液濃縮后于乙酸乙酯/正己烷(V乙酸乙酯∶V正己烷=1∶1)混合液中沉降,所得白色固體于40 ℃真空干燥24 h即得目標(biāo)產(chǎn)物,產(chǎn)率68%。PLA-CC-PHEMA的合成依照前述方法,以PLA-CC-iBuBr替代PLA-SS-iBuBr,得白色純品,產(chǎn)率72%。

1.3 聚合物膠束的制備及性質(zhì)表征

1.3.1 聚合物膠束的制備

透析法制備聚合物膠束:準(zhǔn)確稱取10 mg聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA,然后將其溶于2 mL DMSO,超聲處理使之充分溶解。將適量去離子水緩慢滴加至有機(jī)相,室溫繼續(xù)攪拌2 h后移至透析袋(MWCO 3500),定時(shí)更換缸內(nèi)去離子水,透析24 h得PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA的膠束溶液。利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)測(cè)定聚合物膠束的粒徑和粒徑分布,膠束的形態(tài)則通過透射電子顯微鏡(TEM)檢測(cè)觀察。

1.3.2 臨界膠束濃度的測(cè)定

利用熒光光譜法[23-24]測(cè)定聚合物的臨界膠束濃度(CMC):分別精確量取3 μL芘(濃度為6.26×10-4mol/L)的丙酮溶液,加入到一系列的樣品瓶中,于55 ℃的烘箱內(nèi)避光放置使溶劑徹底揮發(fā)。將膠束溶液梯度稀釋,分別取3 mL加入到處理過的樣品瓶內(nèi),室溫下避光靜置過夜。利用熒光光譜儀來測(cè)試各樣品中芘的發(fā)射光譜:激發(fā)波長334 nm,記錄范圍350～450 nm,狹縫寬度5 nm。以熒光發(fā)射光譜中的第三熒光峰的強(qiáng)度(I394)和第一熒光峰強(qiáng)度(I378)的比值(I394/I378)與聚合物濃度(LogC)的關(guān)系作圖來確定聚合物的臨界膠束濃度。

1.3.3 溶血實(shí)驗(yàn)

靜脈注射是納米藥物的主要給藥方式,納米顆粒需具備極高的血液相容性。采用溶血實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)聚合物膠束的血液相容性。參考文獻(xiàn)[21]制備2%紅細(xì)胞懸浮液。

溶血率的檢測(cè):取0.2 mL不同濃度梯度(0.25～5.0 mg/mL)聚合物膠束于EP管,分別加入0.8 mL的2%細(xì)胞懸浮液和1.0 mL的PBS,作為實(shí)驗(yàn)組。以去離子水作為陽性對(duì)照組,而以PBS作為陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于37 ℃孵育2 h,于1 500 r/min離心15 min,收集上清液,于室溫靜置30 min。陰性對(duì)照組為空白,通過紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)各上清液540 nm處吸光值,按如下公式計(jì)算各樣品的溶血率:

式中:ASample為實(shí)驗(yàn)組各樣品上清液540 nm處吸光值,APositive和ANegetive分別為陽性和陰性對(duì)照組上清液540 nm處吸光值。每個(gè)樣品分別做三個(gè)平行樣。

1.3.4 膠束的細(xì)胞毒性測(cè)定

采用MTT法檢測(cè)聚合物膠束對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性:以5.0×103細(xì)胞/孔的密度將HeLa細(xì)胞種到96孔板,在含5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育24 h。使用完全DMEM培養(yǎng)基將PLA-SS-PHEMA或PLA-CC- PHEMA膠束溶液逐級(jí)稀釋至不同濃度梯度。分別取100 μL不同濃度梯度膠束溶液加入到預(yù)先種有HeLa細(xì)胞的96孔板(對(duì)照組只加入100 μL完全DMEM培養(yǎng)基),于37 ℃孵育48 h。每孔中加入20 μL MTT,于37 ℃孵育4 h后移除孔內(nèi)MTT及培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO,室溫輕柔振蕩使藍(lán)紫色的晶體甲瓚徹底溶解。利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在570 nm處吸光值。細(xì)胞相對(duì)存活率(Relative Cell Viability)可以通過以下公式計(jì)算:

式中:A0為背景值(未加膠束及MTT),Acontrol為對(duì)照值(未加膠束而只加MTT),Atest則是含不同濃度膠束的各孔的實(shí)驗(yàn)值。每個(gè)濃度的膠束溶液和對(duì)照組做4個(gè)平行樣。

1.3.5 膠束的細(xì)胞毒性測(cè)定

透析法制備載藥膠束:將DOX·HCl(5 mg)和三乙胺(10 μL)溶于10 mL的DMSO,避光攪拌,加入50 mg PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA,繼續(xù)攪拌2 h。將25 mL去離子水緩慢滴加到混合液,繼續(xù)攪拌2 h后轉(zhuǎn)移至透析袋(MWCO 3500),定時(shí)更換透析缸內(nèi)去離子水,于室溫透析48 h即得聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA載藥膠束。將其用0.45 μm水系濾膜過濾,可得粒徑均一的載藥膠束。載藥膠束的粒徑及粒徑分布通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試方法測(cè)定。

取3 mL載藥膠束凍干,用DMSO溶解,利用熒光光譜儀測(cè)定590 nm處的發(fā)射光強(qiáng)度:激發(fā)光的波長為485 nm,記錄范圍400～650 nm,狹縫寬度為5 nm。依據(jù)所制的DOX/DMSO的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算膠束中DOX含量。膠束載藥量(Drug lLoading Content,DLC)及包封率(Entrapment Efficiency,EE)通過如下公式計(jì)算:

式中:Wdrug為聚合物膠束包載的藥物質(zhì)量;Wmicelle為凍干后膠束質(zhì)量;Wfeed為初始藥物質(zhì)量。

1.3.6 載藥膠束的體外還原響應(yīng)性釋放

以PLA-SS-PHEMA的載藥膠束(SS-DOX)為實(shí)驗(yàn)組,PLA-CC-PHEMA的載藥膠束(CC-DOX)和游離DOX(Free DOX)作為對(duì)照組。模擬體外還原性環(huán)境(含10 mmol/L DTT的PBS,0.01 mol/L,pH值7.4)和非還原性環(huán)境(無DTT的PBS,0.01 mol/L,pH值7.4),研究載藥膠束的釋藥性能:三種溶液各取1 mL移至透析袋(MWCO 3500),密封后浸入30 mL相應(yīng)的緩沖溶液中,于37 ℃恒溫振蕩(100 r/min)。定時(shí)從各體系分別取出5 mL的緩沖液,并補(bǔ)加相同體積相應(yīng)的新鮮緩沖液,體系中緩沖液的總體積不變。通過熒光光譜法測(cè)定所取樣品的DOX含量。樣品中藥物的累積釋放量(Cumulative Release)依據(jù)如下公式計(jì)算:

式中:Wt為時(shí)間t時(shí)從載藥膠束中釋放的藥物質(zhì)量的總和,Wdrug為各載藥膠束中所含藥物的初始質(zhì)量。以藥物釋放時(shí)間作為橫坐標(biāo),藥物累積釋放量作為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。每種緩沖體系分別做三個(gè)平行樣。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 聚合物的合成與表征

兩親性嵌段聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA的合成路線如圖1所示。參考文獻(xiàn)[24]方法合成小分子引發(fā)劑HO-SS-iBuBr和HO-CC-iBuBr。分別利用其羥基引發(fā)D,L-丙交酯的開環(huán)反應(yīng),制得大分子引發(fā)劑PLA-SS-iBuBr和PLA-CC-iBuBr。大分子引發(fā)劑引發(fā)HEMA單體的ATRP反應(yīng),制備聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA。通過調(diào)節(jié)HEMA單體和大分子引發(fā)劑的投料比控制疏水性鏈段(PLA)和親水性鏈段(PHEMA)的長度比例。

圖1 兩親性聚合物的合成路線

聚合物相對(duì)分子質(zhì)量利用GPC檢測(cè)。以還原敏感性嵌段共聚物為例,固定疏水性鏈段的長度,通過控制HEMA單體和大分子引發(fā)劑的投料比例來調(diào)節(jié)親水性鏈段長度,制備一系列兩親性嵌段共聚物PLAn-SS-PHEMAm。將其用作抗腫瘤藥物阿霉素的載體材料,考察載藥膠束粒徑、載藥量及包封率等相關(guān)性質(zhì)(表1所示)。隨著聚合物的親水性鏈段長度的增長,膠束的粒徑有所增大,而親水性鏈段長度達(dá)到一定限度(n∶m=2∶7)后便無法形成膠束。此外,隨著親水性鏈段的增長,聚合物膠束的載藥率有所下降。綜合考慮聚合物膠束的穩(wěn)定性和載藥率等性質(zhì),選擇聚合物PLAn-SS-PHEMAm(Mn=2.52×104,n∶m=2∶3)進(jìn)行后續(xù)研究。而PLAn-CC-PHEMAm(Mn=2.61×104,n∶m=2∶3)與前者相對(duì)分子質(zhì)量非常接近,因此可以作為對(duì)照組。

表1 兩親性聚合物膠束性質(zhì)及載藥性能

圖2為PLA-SS-iBuBr及PLA-SS-PHEMA的1H NMR譜圖。圖2(A)中δ=5.14～5.26和δ=1.55～1.59分別為PLA中O=C-CH(CH3)-OH和-CH3特征峰,峰面積的積分比為1∶3;δ=1.94處單峰則屬于溴代異丁酸酯上甲基的質(zhì)子峰。圖2(B)中可找到PLA的特征峰,PHEMA中羥基特征峰出現(xiàn)在δ=4.82處,而δ=3.89和δ=3.58處則是亞甲基的特征峰,其余的峰也都有歸屬,且各峰面積的積分比例也都符合要求,證明聚合物PLA-SS-PHEMA的成功合成。

(A)PLA-SS-iBuBr(溶劑:CDCl3);(B)PLA-SS-PHEMA(溶劑:DMSO-d6)圖2 聚合物的1H NMR譜圖

2.2 聚合物膠束的制備和表征

以芘作為熒光探針來測(cè)定兩親性聚合物的臨界膠束濃度(CMC)。以熒光發(fā)射光譜中的第三熒光峰值(I394)和第一熒光峰值(I378)的比值與聚合物濃度(LogC)的關(guān)系作圖(圖3)。

圖3 芘熒光光譜(I394/I378)與聚合物PLA-SS-PHEMA濃度(LogC)的關(guān)系曲線圖

聚合物濃度較低時(shí),I394/I378值基本上保持不變,超過某一濃度時(shí),開始急劇增大,拐點(diǎn)處分別作切線,交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)濃度即為臨界膠束濃度。從圖3可算出PLA-SS-PHEMA的CMC為9.7 μg/mL。極低的臨界膠束濃度表明其在體內(nèi)循環(huán)過程中能夠保持較長時(shí)間的穩(wěn)定性,為其用于構(gòu)建抗癌藥物遞送體系提供了保證。

采用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定聚合物膠束和載藥膠束的粒徑尺寸和粒徑分布,進(jìn)一步利用透射電鏡表征其形貌(圖4)。

(A,B)聚合物PLA-SS-PHEMA空白膠束;(C,D)載藥膠束

從圖4(A)看出聚合物PLA-SS-PHEMA膠束的粒徑呈現(xiàn)單分散性,分布較窄,其粒徑平均尺寸為96 nm,符合抗癌藥物載體的要求。TEM結(jié)果(圖4 B)進(jìn)一步證明聚合物膠束具有較規(guī)則的球形輪廓,粒徑尺寸約70 nm。從圖4(C,D)看出聚合物載藥膠束的粒徑有所增大。相較于DLS檢測(cè)結(jié)果,TEM法檢測(cè)的膠束粒徑尺寸較小,可能是因?yàn)樵谥茦舆^程中聚合物膠束經(jīng)歷了干燥過程,親水性外殼發(fā)生坍塌從而造成了尺寸的縮減。

2.3 聚合物膠束的溶血實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

靜脈注射是納米藥物顆粒的主要給藥方式,這對(duì)納米顆粒的血液相容性提出了很高的要求。本文通過溶血實(shí)驗(yàn)來考察聚合物膠束的血液相容性。從圖5可知,在0.25～5.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),PLA-SS-PHEMA膠束和PLA-CC-PHEMA膠束的溶血率均維持在2%左右,在國家標(biāo)準(zhǔn)允許的范圍之內(nèi)(不超過5%)。這兩種聚合物膠束均符合生物醫(yī)用材料溶血實(shí)驗(yàn)要求。從圖5溶血實(shí)驗(yàn)照片可知,在0.25～5.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),經(jīng)這兩種聚合物膠束處理的試樣,其上清液均為無色透明狀,未被破壞的紅細(xì)胞沉積在EP管底部。而陽性對(duì)照組的上清液則為明顯的紅色,EP管底部未見有沉積的紅細(xì)胞,表明紅細(xì)胞已被去離子水嚴(yán)重破壞,導(dǎo)致了溶血現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明這兩種聚合物膠束具有良好的血液相容性,可以用于體內(nèi)注射。

插入圖片:實(shí)驗(yàn)組(聚合物膠束)、陽性對(duì)照組(去離子水)、陰性對(duì)照組(PBS 7.4)的紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果,A:PLA-SS-PHEMA,B:PLA-CC-PHEMA圖5 不同濃度聚合物膠束處理過的紅細(xì)胞溶血率(mean ± SD,n=3)

為評(píng)價(jià)聚合物材料的毒性,選取HeLa細(xì)胞作為模型細(xì)胞,采用MTT法檢測(cè)聚合物膠束的細(xì)胞毒性。從圖6可以看出,在1.95～250 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),與還原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA膠束及非還原敏感性聚合物PLA-CC-PHEMA膠束共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞存活率均在90%以上,表明這兩種聚合物對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性極低,適于用作藥物載體材料。

圖6 PLA-SS-PHEMA和PLA-CC-PHEMA空白膠束與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后細(xì)胞毒性(mean ± SD,n=4)

2.4 空白膠束DLS分析及還原刺激響應(yīng)性研究

聚合物PLA-SS-PHEMA結(jié)構(gòu)中的雙硫鍵在還原性條件下發(fā)生斷裂,導(dǎo)致聚合物解體。通過體外模擬還原性環(huán)境,采用DLS法研究聚合物膠束的粒徑尺寸及分布隨時(shí)間的變化。

從圖7可以看出,在非還原性條件(不含DTT的PBS緩沖液)下,還原響應(yīng)性聚合物PLA-SS-PHEMA膠束作用24 h后,其粒徑幾乎沒有變化。而在模擬的還原性環(huán)境(含10 mmol/L DTT的PBS緩沖液)中作用10 min,聚合物膠束粒徑就發(fā)生了變化,出現(xiàn)了兩個(gè)峰。聚合物膠束在還原性條件下迅速降解,致使其粒徑尺寸及分布發(fā)生巨大變化。當(dāng)作用時(shí)間延長至20 min,膠束的粒徑尺寸激增,表明其結(jié)構(gòu)遭到進(jìn)一步的破壞。作為對(duì)照組的PLA-CC-PHEMA膠束在相同的還原性條件下作用24 h,粒徑尺寸及分布依然穩(wěn)定。研究結(jié)果表明聚合物PLA-SS-PHEMA具有靈敏的還原響應(yīng)性,為其載藥膠束的還原響應(yīng)性釋藥提供了可能性。

(A)PLA-SS-PHEMA膠束;(B)PLA-CC-PHEMA膠束

2.5 載藥膠束的制備與表征

阿霉素是一種廣譜抗腫瘤藥物,被廣泛應(yīng)用于癌癥的臨床治療。鑒于阿霉素本身具有熒光,本研究以阿霉素作為模型藥物,采用透析法制備載藥膠束。通過熒光光譜法測(cè)定還原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA的載藥量為5.7%,包封率為60.8%;非還原敏感性聚合物PLA-CC-PHEMA的載藥量為5.4%,包封率為56.6%。

體外模擬還原性環(huán)境(PBS含10 mmol/L DTT,pH值7.4)和非還原性環(huán)境(PBS,pH值7.4),研究這兩種載藥膠束的藥物釋放情況。從圖8可以看出,游離DOX在PBS中出現(xiàn)暴釋,不到1 h就有近80%的藥物釋放出來。在還原性條件下,還原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA的雙硫鍵發(fā)生斷裂而破壞膠束結(jié)構(gòu),迅速釋放膠束內(nèi)核負(fù)載的DOX,僅10 h就有約30%的DOX釋放出來,隨著釋藥時(shí)間的增長,累積釋藥量可達(dá)到90%。而非還原敏感性聚合物PLA-CC-PHEMA載藥膠束在還原性和非還原性條件下釋藥速率都比較低,其釋藥情況無顯著性差別,釋藥時(shí)間延長至48 h,其累積釋藥量均不超過30%。鑒于還原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA載藥膠束可以實(shí)現(xiàn)靈敏的還原響應(yīng)性藥物釋放,其在構(gòu)建抗癌藥物運(yùn)載體系方面具有一定的應(yīng)用潛力。

(A)PLA-SS-PHEMA膠束;(B)PLA-CC-PHEMA膠束圖8 PLA-SS-PHEMA膠束和PLA-CC-PHEMA膠束在不同條件下的體外DOX釋放(mean ± SD,n=3)

3 結(jié)論

利用開環(huán)反應(yīng)和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)合成一系列新型還原敏感性兩親性嵌段共聚物PLAn-SS-PHEMAm。聚合物可以自組裝成規(guī)則的球形納米膠束,有效地負(fù)載抗癌藥物DOX。研究表明n∶m=2∶3時(shí)聚合物膠束的粒徑和載藥性能最佳。聚合物材料的細(xì)胞毒性極低,能夠滿足納米藥物載體材料的安全性要求。鑒于聚合物膠束優(yōu)良的血液相容性,可以用于體內(nèi)注射。還原性環(huán)境中聚合物載藥膠束的雙硫鍵發(fā)生斷裂,膠束解體而快速釋放負(fù)載的DOX。因此,該還原敏感性聚合物有望用于抗腫瘤藥物遞送領(lǐng)域,以解決傳統(tǒng)抗腫瘤藥物制劑存在的問題。