威靈仙-白花蛇舌草藥對抗癌作用機制研究

常冠坤 王繼豐 于爽 郝婧瑋

文章編號：1003?6180（2023） 03?0041?07

摘? 要：探討威靈仙-白花蛇舌草藥對治療癌癥的作用機制.從HERB與Swiss ADME兩個數(shù)據(jù)庫中篩選出威靈仙-白花蛇舌草藥對中活性成分、作用靶點、癌癥疾病靶點、活性成分與疾病的共同靶點，篩選出重要的活性成分與關(guān)鍵靶點，將活性成分與關(guān)鍵靶點進行分子對接驗證.關(guān)鍵靶點為ESR1，重要活性成分為槲皮素、阿魏酸和恩貝林，這三種藥物的活性成分均與疾病靶點蛋白有著較好的結(jié)合性.威靈仙-白花蛇舌草藥對可能對治療癌癥疾病起著重要作用.

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學；威靈仙；藥對；癌癥；分子對接

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Mechanism of Couplet Medicines of Clematis chinensis Osbeck

and Hedyotis diffusa Treatment for Cancer

CHANG Guankun1，WANG Jifeng2，YU Shuang1，HAO Jingwei1*

（1.College of life science and technology，Mudanjiang Normal College，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China；2.Institute of? Nature Resources And Ecology.Has，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，

Heilongjiang 150040，China）

Abstract：Exploring the Mechanism of couplet medicines of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa Treatment for Cancer.The HERB and Swiss ADME databases were used to screen active ingredients， target proteins， and common targets of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa for cancer treatment， and important active ingredients and key targets were identified and verified through molecular docking.The key target is ESR1， and the important active ingredients are Quercetin， Ferulic acid， and Embelin.All three active ingredients have good binding properties with the disease target protein.Couplet medicines of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa may play an important role in the treatment of cancer.

Key words：network pharmacology；Clematis chinensis Osbeck；Hedyotis diffusa;couplet medicines；cancer；molecular docking

癌癥是由于生物體某個基因發(fā)生突變導致的[1-2]，中草藥如威靈仙（Clematis chinensis Osbeck），常與其他中藥配伍治療疾病；白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）是南方較為常見的中草藥，有著消炎、解毒、抗癌腫等多種藥理作用，具有較好的使用價值.[1-4]本文以威靈仙-白花蛇舌草為藥對，采用活性成分篩選法[5]，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接實驗，探討威靈仙-白花蛇舌草藥對的抗癌機制.

1 材料與方法

威靈仙-白花蛇舌草對活性成分的收集和篩選 在數(shù)據(jù)庫本草組鑒（http：//drug.ac.cn/，HERB）中分別搜索威靈仙、白花蛇舌草的成分，選擇OB score ≥ 30為篩選條件，分選出主要成分.在 Swiss ADME（http：//www.swissadme.ch/）中，以藥代動力學里的胃腸道吸收（GI absorption）為“High”的結(jié)果，及類藥性（Druglikeness）五個預測（Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge）的結(jié)果中有2個及以上是“Yes”為篩選條件，對HERB中收集的活性成分進行篩選，篩選得到最終的活性成分.

威靈仙-白花蛇舌草藥對活性成分靶點的收集 將得到的活性成分在數(shù)據(jù)庫PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中收集對應的Canonical SMILES，并在SwissTargetPrediction（http：//www.swiss-target-prediction.ch/）輸入各個活性成分的Canonical SMILES，物種屬性設(shè)置為“Homo sapiens”，選擇Probability > 0的靶點數(shù)據(jù).

癌癥靶點的收集 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）搜索關(guān)鍵詞“cancer”，選擇Score ≥ 20 的靶點；在OMIM（https：//www.omim.org/）里的Gene Map中搜索“cancer”，并收集該數(shù)據(jù)庫與癌癥疾病有關(guān)的所有作用靶點.

疾病與藥物共同關(guān)鍵靶點的篩選 將藥物活性成分對應的靶點與疾病的靶點上傳至Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），取得威靈仙-白花蛇舌草藥對與癌癥作用的靶點，即共同靶點，并作韋恩圖.

藥物-成分-靶點-疾病的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用軟件Cytoscape 3.9.0 將藥物、成分、靶點、疾病構(gòu)建成網(wǎng)絡(luò)圖，探究各個成分與各個靶點的相互關(guān)系.篩選出威靈仙-白花蛇舌草藥對中的藥物活性成分.

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物與疾病的共同靶點上傳至STRING（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中進行搜索，物種屬性選擇“Homo sapiens”，余下參數(shù)皆為默認值，將得到的相應數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.0 ，得到藥對活性成分與疾病的蛋白質(zhì)（PPI）互相作用網(wǎng)絡(luò)圖.利用該軟件中的Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲分析，以degree值為主要參考標準作圖，使用MCODE模塊軟件分析網(wǎng)絡(luò)圖中的基因簇，運用cytoHubba模塊軟件以MCC為參考標準分析核心基因.

對關(guān)鍵靶點進行GO富集分析和KEGG通路的富集分析 將藥物與疾病的共同靶點上傳至Metascape（https：//metascape.org/），進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，分析該靶點集參與細胞組成、生物過程、分子功能的作用和種類，分析參與作用的信號通路類型，分析數(shù)據(jù)上傳至在線作圖平臺微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/），作氣泡圖.

重要活性成分與主要靶點的分子對接 在PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中選取主要作用靶點蛋白的pdb格式文件，在TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)中選取重要藥物活性成分的mol2格式文件，用AutoDock-Vinna 軟件進行分子對接，用Pymol 軟件進行可視化分析.

2 實驗結(jié)果

篩選結(jié)果表明，威靈仙的活性成分28個，白虎蛇舌草的活性成分7個，有2個共同成分：白頭翁素（Anemonin），槲皮素（Quercetin）.

藥物靶點的篩選結(jié)果表明，威靈仙活性成分所對應的靶點467個，白花蛇舌草活性成分對應的靶點264個，兩者合并去重，總共得到靶點523個.

靶點篩選得到400個靶點，癌癥疾病靶點498個，合并去重后得到781個疾病靶點.運用Venny 2.1取藥物與疾病的交集靶點，得到交集靶點56個.

運用Cytoscape 3.9.0軟件將威靈仙的28個活性成分和白花蛇舌草的7個活性，與56個藥物和疾病的共同靶點進行網(wǎng)絡(luò)互作.網(wǎng)絡(luò)由92個節(jié)點和244條邊組成，用Network Analyzer分析各個活性成分的Outdegree值.共同成分槲皮素（B1）的Outdegree值為18.威靈仙活性成分中最大Outdegree值為9，是恩貝林（WLX09）；白花蛇舌草活性成分中最大Outdegree值為14，是阿魏酸（BHSSC03）.

2.1 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病的共同靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，將得到的數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.0軟件，得到藥物與疾病的共同靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，其degree值從里到外逐漸變小，靶點蛋白ESR1的degree值最大為45.以degree值為參考標準，選取數(shù)值最大的前八個基因靶點，運用MCODE模塊軟件分析該網(wǎng)絡(luò)，得到2個基因簇（表2）.運用cytoHubba模塊軟件以MCC為參考標準進行分析.前十的基因靶點為EGFR，CCND1，VEGFA，HRAS，STAT3，MAPK1，SRC，MDM2，AKT1，ESR1.

2.2 GO富集分析和KEGG通路的富集分析

將藥物與疾病的56個共同靶點上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析和KEGG通路的富集分析.GO富集分析包括分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞組分（CC）.共同靶點集涉及分子功能條目78條，主要關(guān)于磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性；共同靶點集涉及細胞組分條目44條，主要關(guān)于受體復合體、微膜結(jié)構(gòu)域、膜筏；共同靶點集涉及生物過程條目100 2條，主要關(guān)于酶聯(lián)受體蛋白信號通路、腺體的發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、細胞對化學應激的響應.取GO富集分析3個部分，根據(jù)P值前五個條目在微生信平臺作氣泡圖（圖1）.

KEGG通路的富集分析涉及152個條目，主要關(guān)于癌癥通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的微小RNA、化學致癌-受體的激活、前列腺癌，還有PI3K-Akt這條重要信號通路.根據(jù)P值選取KEGG通路的富集分析結(jié)果前20個條目，在微生信平臺作氣泡圖（圖2）.

2.3 分子對接驗證

選取槲皮素、阿魏酸和恩貝林這三個藥物活性成分別與靶點蛋白ESR1進行分子對接.運用AutoDock-Vinna對接，用Pymol分析結(jié)果顯示.槲皮素與ESR1蛋白進行分子對接，形成1個氫鍵，結(jié)合能為-7.7 kcal/mol（圖3）；阿魏酸與ESR1蛋白進行分子對接，形成1個氫鍵，結(jié)合能為-6.0 kcal/mol（圖4）；恩貝林與ESR1蛋白進行分子對接，形成3個氫鍵，結(jié)合能為-7.0 kcal/mol（圖5）.以上三個活性成分與靶點蛋白皆有較好的結(jié)合性.

3 討論

篩選出藥對中的槲皮素、阿魏酸和恩貝林三個重要活性成分，通過對篩選出的共同靶點集進行PPI蛋白互作，ESR1是最重要的靶點.將該靶點與篩選出的三個藥物活性成分進行分子對接，發(fā)現(xiàn)三個活性成分與ESR1靶點蛋白都具有較好的結(jié)合性.對共同靶點集進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示多集中于癌癥通路.

在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中，結(jié)合三種篩選方式，得到前五核心靶點分別是ESR1，CCND1，EGFR，STAT3，HRAS.乳腺癌發(fā)病后，ESR1會發(fā)生突變，是乳腺癌的標志產(chǎn)物[6]，有部分患者的ESR1會發(fā)生甲基化，而ESR1未發(fā)生甲基化的患者的存活率比發(fā)生甲基化的患者存活率要高[7]；ESR1甲基化后也會影響卵巢癌的發(fā)生，說明ESR1與多種疾病有著很大的關(guān)聯(lián)性.[8]鑒于ESR1的關(guān)聯(lián)性較多，猜測該基因與其他癌癥疾病的發(fā)病原因存在較大的關(guān)系.

槲皮素、阿魏酸、恩貝林這三種活性成分與疾病靶點的關(guān)聯(lián)度最大，具有更大的研究價值.分子對接顯示，這三種活性成分與ESR1靶點蛋白都有較好的結(jié)合性.槲皮素對多種癌癥均有不俗的治療效果.如Wang發(fā)現(xiàn)槲皮素通過轉(zhuǎn)錄因子EB和活性氧依賴性鐵凋亡的溶酶體活化誘導p53非依賴性癌細胞死亡[9]，能夠調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)，抑制Akt和NF-KB途徑，使前列腺癌細胞凋亡和壞死.[10]除了直接作用于癌細胞，槲皮素還可以通過改變癌細胞的耐藥性.Lu等發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過通過雄激素受體和PI3K-Akt信號通路，降低了前列腺癌細胞對多西紫杉醇的耐藥性.[11]有學者發(fā)現(xiàn)，阿魏酸處理宮頸癌細胞系的細胞后，分別能達到88.3%和85.4%的抑制率，且隨著阿魏酸處理濃度的增加，宮頸癌細胞周期中的G0期 或 G1期都能發(fā)生顯著性停滯，也會降低相關(guān)蛋白的自噬.[12]在對肺癌的治療中，阿魏酸衍生物中的FXS-3能對ERK/p38，AKT/mTOR和MEK/ERK信號通路進行負調(diào)控，阻止信號的傳遞，進而使肺癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移受到了抑制，能有效達到治療肺癌的目的[13]，而另一種衍生物4-乙烯基愈創(chuàng)木酚治療結(jié)腸癌是通過誘導細胞的凋亡達到治療作用的.[14]恩貝林能改變?nèi)梭w乳腺細胞癌焦點的基因表達，主要體現(xiàn)于細胞增殖的抑制和誘導細胞的凋亡這兩方面.[15]恩貝林能抑制Akt信號的傳導，能使活化的GSK-3β部分促進前列腺癌細胞的凋亡.[16]在治療胰腺癌的作用中，恩貝林除了能抑制Akt和Shh通路使胰腺癌細胞的生長受阻，還可以調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境抑制炎癥.[17]目前尚未見有槲皮素、阿魏酸、恩貝林這三種活性成分對靶蛋白ESR1作用的研究報道，基于三種活性成分現(xiàn)有的研究，猜測ESR1可能是這三種活性成分潛在的作用靶點.

對靶點集的富集分析發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號通路的P值最大，猜想該通路是治療癌癥重要的信號通路. Ma等發(fā)現(xiàn)PHLDA2的下調(diào)通過PI3K-AKT信號通路抑制結(jié)腸癌的EMT并促進自噬.[18]Wang等發(fā)現(xiàn)LINC01559通過上調(diào)PGK1，誘導PTEN啟動子的甲基化，使PTEN受到抑制，進而激活PI3K-AKT信號通路，促進胃癌細胞的增殖.[19]Wang等發(fā)現(xiàn)黃芪素能在治療胃癌過程中首先誘導凋亡信號蛋白的表達，通過抑制PI3K/AKT信號通路，進而抑制癌細胞的擴散，達到治療胃癌的作用.[20]胡椒堿在治療胃癌的過程中，同樣通過抑制PI3K/Akt信號通路來抑制增殖并誘導人胃癌細胞凋亡，其中涉及到了上調(diào)Bax，Bad的蛋白表達和下調(diào)Bcl-2，Bcl-xl的蛋白表達.[21]激活或抑制PI3K-AKT信號通路會引起相關(guān)癌癥發(fā)病或誘導癌細胞凋亡，猜想PI3K-AKT信號通路是藥對治療癌癥的主要通路.

綜上所述，藥對的活性成分可能通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路作用于癌癥疾病的靶點，達到治療癌癥的目的.

參考文獻

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