聚多巴胺功能化大腸桿菌生物電催化劑的構(gòu)建及其氧還原性能

白正宇,邢寶鳳,牛洋娣

(河南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)

隨著化石能源造成的環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重,探索和開發(fā)可再生及環(huán)境友好的新型替代能源技術(shù)成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［1-2］.微生物燃料電池(MFC)作為一種綠色可持續(xù)的新興生物電化學(xué)技術(shù)而備受關(guān)注［3-5］,其利用微生物細(xì)胞呼吸過程中復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)將化學(xué)能直接轉(zhuǎn)換為電能,在污水處理、生物修復(fù)和清潔電能生產(chǎn)方面展現(xiàn)了巨大的潛力［6-7］.氧還原反應(yīng)(ORR)是發(fā)生在MFC陰極上的主要反應(yīng)［8］.因此,研發(fā)高效率和低成本的ORR電催化劑是促進(jìn)MFC進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵.生物電催化劑具有綠色、高效和可再生的生物學(xué)特性,利用生物系統(tǒng)材料來催化MFC陰極上發(fā)生的氧還原反應(yīng)對于可持續(xù)能源發(fā)展具有重要意義［9-11］.分離的氧化還原酶和電活性微生物細(xì)胞是兩種最常見和應(yīng)用最廣泛的生物電催化劑.相對于氧化還原酶的易失活和易脆性,微生物細(xì)胞具有自我復(fù)制和自我修復(fù)的特性,增強(qiáng)了生物催化平臺(tái)的運(yùn)行穩(wěn)定性［9］.然而,電活性微生物自身的細(xì)胞膜導(dǎo)電性較差,這將導(dǎo)致微生物細(xì)胞之間的跨細(xì)胞膜界面以及微生物與電極之間的生物/非生物界面細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移(EET)速率緩慢,限制了微生物細(xì)胞的生物電催化活性和產(chǎn)電效率［12-15］.

對微生物細(xì)胞進(jìn)行導(dǎo)電納米修飾,不僅能對細(xì)胞提供保護(hù)作用,增強(qiáng)其耐受性和穩(wěn)定性,而且能提升它們的本征催化活性和導(dǎo)電性［16-17］,從而提高生物電催化ORR能力和MFC的整體性能.在微生物細(xì)胞表面涂覆多功能導(dǎo)電納米材料,可以改善活細(xì)胞的代謝或增強(qiáng)其對惡劣環(huán)境的抵抗力［18-19］.含有共軛雙鍵和離域π軌道的導(dǎo)電聚合物作為生物電極和生物系統(tǒng)之間的中介材料,可以與生物系統(tǒng)發(fā)生密切的相互作用,并且能增強(qiáng)細(xì)胞的穩(wěn)定性,如在細(xì)胞表面原位合成的聚吡咯(PPy)“導(dǎo)電細(xì)胞壁”可以有效地加速EET,而不損害生物催化活性或產(chǎn)電效率,因此,MFC的電流或發(fā)電量可以大大增強(qiáng).然而,一個(gè)被忽視的問題是,PPy的疏水性導(dǎo)致電活性細(xì)菌黏附性降低,增加了生物膜形成的難度.具有黏附性的導(dǎo)電納米材料可以直接影響內(nèi)部細(xì)胞和外部環(huán)境之間的質(zhì)量和能量交流,不僅能夠作為連接相鄰細(xì)胞的電子橋梁,同時(shí)賦予其良好的附著力,使功能化后的細(xì)胞密集附著在電極表面［20］.研究表明,多巴胺前體在電極表面沉積為多功能和強(qiáng)黏附膜的獨(dú)特特征是由于其分子結(jié)構(gòu)中存在兒茶酚和胺基.聚多巴胺(PDA)和不同種類的生物分子之間的相互作用,如氫鍵、疏水相互作用和芳香-陽離子相互作用,已被用于促進(jìn)各種物質(zhì)的黏附,如蛋白質(zhì)、核苷酸、低聚糖和脂類.另外,PDA具有豐富的官能團(tuán),例如氨基、酚羥基等親水基團(tuán),可以提高底物的親水性.PDA還具有大量的醌基,是氧化還原活性功能配體,進(jìn)一步適用于加速細(xì)胞外呼吸過程中的電子轉(zhuǎn)移,改善細(xì)胞與電極之間的界面電子轉(zhuǎn)移［21-22］.此外,PDA具有優(yōu)異的生物相容性,良好的黏附力,可以保護(hù)微生物細(xì)胞的生存能力［23］.

本文通過在單個(gè)大腸桿菌表面原位聚合得到PDA功能性涂層(E.colicell@PDA),可以改善生物/無機(jī)界面的電子轉(zhuǎn)移,并對其生物電催化能力進(jìn)行評(píng)估.PDA功能性涂層的成功制備在不降低細(xì)菌細(xì)胞活力的情況下提高細(xì)菌細(xì)胞的導(dǎo)電性,EET效率顯著提高.電化學(xué)測試結(jié)果顯示,PDA功能性涂層可以提高大腸桿菌的ORR電催化活性,E.colicell@PDA在MFC中作為生物陰極,氧還原電流密度明顯提高,由天然大腸桿菌(nativeE.colicell)的2.13 mA·cm-2增加到2.62 mA·cm-2,最大輸出功率密度達(dá)到95.3 μW·cm-2,為功能化生物電催化劑的構(gòu)建及性能調(diào)控提供了一種有效策略.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

大腸桿菌在LB培養(yǎng)基(10.0 g·L-1胰蛋白胨、10.0 g·L-1NaCl、5.0 g·L-1酵母粉)中,在37 ℃的搖床(200 r·min-1)上復(fù)蘇7～8 h,再經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)7 h左右到達(dá)生長平臺(tái)期,通過離心(4 000 r·min-1,4 min)收集細(xì)菌沉淀以供進(jìn)一步使用.

PDA涂層包覆大腸桿菌的過程:將收集到的細(xì)菌沉淀懸浮于10 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)中,加入10.0 mg的鹽酸多巴胺,在搖床上振蕩4 h(37 ℃,200 r·min-1),離心(6 000 r·min-1,4 min)獲得E.colicell@PDA的細(xì)菌沉淀.

1.2 生物電極的構(gòu)建

將依次通過丙酮、無水乙醇和混酸(V(濃硫酸)∶V(濃硝酸)=3∶1)超聲處理、洗至中性并干燥過的碳布(2 cm×2 cm)放入被PDA包覆的大腸桿菌的LB培養(yǎng)基懸浮液中,在搖床上(37 ℃,200 r·min-1)搖36 h左右,使細(xì)菌牢固地附著在碳布上.為了進(jìn)行比較,天然大腸桿菌的電極也按照同樣的步驟制備.

1.3 材料表征

細(xì)菌懸浮液用超純水洗滌3次,接著在戊二醛中固定8 h左右,離心,再用超純水洗滌3次,然后依次用不同體積濃度的乙醇(體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、85%、90%、100%)梯度洗脫,每個(gè)體積濃度洗脫3次,每次持續(xù)10 min.利用SU8010掃描電子顯微鏡(SEM)觀察制備的生物電催化劑的表面形貌,JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡(TEM)觀察生物電催化劑的內(nèi)部結(jié)構(gòu).利用LabRAM HR Evolution高分辨拉曼光譜儀和NEXUS紅外光譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)測試,利用P200/P200+紫外可見分光光度計(jì)對物質(zhì)的組成進(jìn)行測定和分析.

1.4 細(xì)菌活力測試

使用LIVE/DEAD染色細(xì)菌活力試劑盒對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測.按照產(chǎn)品說明書配制染色工作液(V(NucGreen)∶V(EthD-Ⅲ)=1∶2),將細(xì)菌懸液稀釋到合適的體積濃度,取1 mL細(xì)菌懸液,加入10 μL的染色工作液,充分混合,室溫避光孵育15 min,之后取10 μL細(xì)菌懸液滴在帶有蓋玻片的載玻片上,使用FV1200MOE激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照.

1.5 微生物燃料電池的組成

采用雙室MFC(內(nèi)腔容積50 mL),由質(zhì)子交換膜Nafion117膜隔開,陽極為40%Pt/C|CC,陰極為E.colicell@PDA|CC或nativeE.colicell|CC.陽極室中加入含1 mol·L-1葡萄糖的10×PBS緩沖溶液(7.518 0 g Na2HPO4·12H2O,1.496 0 g KH2PO4,2.480 0 g NaCl,0.060 0 g MgSO4,0.005 6 g CaCl2),通入氮?dú)?陰極室中加入含4 g·L-1葡萄糖的10×PBS緩沖溶液,2 mL的LB培養(yǎng)基和適量菌液,通入氧氣.MFC的外電阻均為1 000 Ω,均在37 ℃下操作.每次測試都要準(zhǔn)備3個(gè)獨(dú)立的MFC.

陽極的制備過程為:稱取0.004 6 g的40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鉑碳分散于2 mL異丙醇中,超聲混勻,接著加入293 μL Nafion溶液繼續(xù)超聲均勻.用微量注射器分多次移取上述400 μL分散液涂至預(yù)先處理好的碳布上,在室溫下晾干即可.

1.6 電化學(xué)測試

使用上海辰華CHI760E電化學(xué)工作站,37 ℃下采用標(biāo)準(zhǔn)三電極體系(對電極為鉑片電極,參比電極為銀/氯化銀電極,工作電極為負(fù)載細(xì)菌的碳布電極),在氧氣或氮?dú)怙柡偷腗9溶液中進(jìn)行ORR電化學(xué)測試.循環(huán)伏安法(CV)和線性掃描伏安法(LSV)均在-0.6～0.3 V電壓之間進(jìn)行測試.

電極的制備過程為:將天然的大腸桿菌或PDA包覆的大腸桿菌懸浮于50 mL的LB培養(yǎng)基中,加入預(yù)先處理好的碳布,置于搖床(37 ℃,200 r·min-1)中振蕩36 h,此時(shí)細(xì)菌已經(jīng)附著碳布上,將碳布取出,室溫下晾干,即為所制備的工作電極.

2 結(jié)果與討論

PDA功能性涂層是在單個(gè)細(xì)菌表面通過多巴胺單體原位氧化聚合得到,經(jīng)過優(yōu)化聚合時(shí)間,在大腸桿菌表面形成均勻的PDA納米殼層.通過掃描電子顯微鏡和超薄切片的透射電子顯微鏡測試可以觀察到PDA納米涂層包覆前后的細(xì)菌表面的形態(tài)變化(如圖1所示).從掃描電子顯微鏡(SEM)圖(圖1a)可以看出,天然的大腸桿菌細(xì)胞由于脫水表面出現(xiàn)褶皺,但整體表面相對光滑.而經(jīng)過PDA功能涂層包覆的大腸桿菌細(xì)胞更加圓潤(圖1d),這歸因于PDA涂層對細(xì)胞的保護(hù)作用,此外,可以明顯看到包覆后細(xì)胞表面比較粗糙,布滿了納米顆粒.通過切片的透射電子顯微鏡(TEM)圖(圖1b)和切片TEM圖的局部放大圖(圖1c)可觀察到大腸桿菌細(xì)胞表面相對光滑,細(xì)胞的內(nèi)膜和外膜可以清晰看到。由PDA功能涂層包覆后的大腸桿菌細(xì)胞切片的透射電子顯微鏡(TEM)圖(圖1e)和其局部放大圖(圖1f)可清晰地看到,PDA納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞外膜緊密連接并均勻包裹在細(xì)胞膜上,證明了在大腸桿菌細(xì)胞表面成功形成了PDA納米顆粒.另外,PDA納米顆粒具有豐富的活性官能團(tuán),易與材料表面共價(jià)交聯(lián),有希望連接細(xì)菌的電子導(dǎo)管,可以改善生物/電極界面間的電子轉(zhuǎn)移［24］.

為進(jìn)一步確定細(xì)菌表面形成的聚合物涂層的組成結(jié)構(gòu),對其進(jìn)行了光譜分析.首先利用拉曼光譜(圖2a)分析PDA涂層的分子結(jié)構(gòu),在單純的PDA聚合物的拉曼光譜中,1 338 cm-1和1 414 cm-1的吸收峰歸屬于C=O鍵的特征峰,1 583 cm-1的吸收峰歸屬于芳烴C=C鍵的特征峰［25］,這些特征峰在PDA包覆的大腸桿菌細(xì)胞(E.colicell@PDA)的拉曼光譜中均存在,而在天然的大腸桿菌細(xì)胞(NativeE.colicell)的拉曼光譜中未觀察到PDA的特征峰,同時(shí),在1 100 cm-1處的特征峰是大腸桿菌自身的特征峰,這些結(jié)果表明PDA聚合物成功包覆在大腸桿菌細(xì)胞表面.另外,由UV-vis光譜(圖2b)可看出大腸桿菌自身沒有明顯的吸收峰,而合成的純PDA納米顆粒與PDA包覆的大腸桿菌都有一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰(279 nm)該吸收峰歸因于PDA的特征峰,證實(shí)了PDA涂層在大腸桿菌細(xì)胞上的存在.通過傅里葉變換紅外光譜(圖2c)對形成的聚合物涂層做進(jìn)一步的分析,在1 118 cm-1和1 285 cm-1處的吸收峰歸因于PDA的C-O鍵的伸縮振動(dòng)［26-27］,這些吸收峰在天然的大腸桿菌中均未發(fā)現(xiàn),這些結(jié)果都證明了PDA成功地包覆在大腸桿菌表面.

為了探討PDA納米涂層對細(xì)菌細(xì)胞生存活力的影響,通過LIVE/DEAD染色細(xì)菌活力試劑盒對細(xì)胞染色,進(jìn)行共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)的分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過PDA修飾的細(xì)菌細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光和較弱的紅色熒光(圖2e),與天然的大腸桿菌相似(圖2d),說明包覆前后均具有較高的活細(xì)胞比例.因此PDA涂層對大腸桿菌的活力幾乎沒有影響.接著通過UV-vis光譜分析比較了天然的大腸桿菌和PDA包覆的大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中在600 nm處的光學(xué)密度(OD600),來進(jìn)一步監(jiān)測細(xì)胞的生長情況(圖2f),從圖2f中可看出PDA包覆的大腸桿菌的孵育時(shí)間后進(jìn)入了與天然細(xì)胞相似的繁殖階段,說明PDA納米涂層對大腸桿菌細(xì)胞的自分裂性能幾乎沒有影響,具有良好的生物相容性［28］.

為了進(jìn)一步探究PDA納米涂層對大腸桿菌ORR電催化活性功能的促進(jìn)作用,在PDA成功包覆大腸桿菌表面后,通過使用三電極電化學(xué)測試系統(tǒng)對功能化的大腸桿菌進(jìn)行半電池電化學(xué)分析,結(jié)果表明與天然的大腸桿菌相比,E.colicell@PDA具有更高的電催化ORR活性,這歸因于其顯著增強(qiáng)了直接電子轉(zhuǎn)移能力,以及電極上更密集的細(xì)菌附著量.為了證明E.colicell@PDA的電催化活性,在氧氣或氮?dú)怙柡偷腗9溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)測試.圖3a顯示,在氧氣飽和的M9溶液中進(jìn)行CV測試時(shí),掃描速率為50 mV·s-1,不同的大腸桿菌均在0.35 V vs.RHE有一個(gè)明顯的陰極還原峰,與天然的大腸桿菌(2.13 mA·cm-2)相比,E.colicell@PDA的還原電流(2.62 mA·cm-2)增加了約23 %.通過線性掃描(LSV)測試(圖3b)結(jié)果可看出,E.colicell@PDA生物催化劑的極限電流密度比天然的大腸桿菌增加了約0.1 mA·cm-2,這些結(jié)果表明E.colicell@PDA有更好的ORR催化活性,歸因于PDA具有良好的導(dǎo)電性以及豐富的活性官能團(tuán),產(chǎn)生了更多的催化活性位點(diǎn),有助于大腸桿菌催化活性的提高.為了探究生物-非生物界面的電荷轉(zhuǎn)移電阻,進(jìn)行了電化學(xué)阻抗譜(EIS)分析測試,對比兩種生物催化劑的Nyquist圖(圖3c)可以發(fā)現(xiàn),E.colicell@PDA的電阻要小于天然的大腸桿菌,進(jìn)一步證明了PDA功能性涂層的修飾顯著提高了細(xì)胞與電極間的電子轉(zhuǎn)移效率.在氮?dú)怙柡偷腗9溶液中進(jìn)行CV測試時(shí),天然的大腸桿菌在約0.19 V和0.30 V(vs.RHE)處有一對明顯的氧化還原峰(圖3d),這是由于大腸桿菌中的催化活性蛋白細(xì)胞色素c(Cyt c)通過Fe3+和Fe2+之間的電子轉(zhuǎn)移增強(qiáng)細(xì)胞的氧化還原活性.而E.colicell@PDA的氧化還原峰更加明顯,說明具有更強(qiáng)的直接電子轉(zhuǎn)移能力以及電化學(xué)氧化還原活性.在氮?dú)怙柡偷腗9溶液中,以0.01到1.00 V·s-1的不同掃描速率來記錄氧化還原峰值電流(圖3e).根據(jù)峰值電流與掃描速率的對應(yīng)關(guān)系(圖3f),發(fā)現(xiàn)峰值電流隨掃描速率的增加呈線性增加,表明E.colicell@PDA的電催化ORR過程為表面控制過程.

為了評(píng)估不同細(xì)菌的生物發(fā)電能力,構(gòu)建了雙室微生物燃料電池(MFC).當(dāng)MFC電壓輸出穩(wěn)定時(shí),在陰極和陽極之間連接不同的外部負(fù)載,得到功率密度曲線(圖4a)和電流-電壓(I-V)的極化曲線(圖4b).結(jié)果表明,采用天然的大腸桿菌作為生物陰極的MFC的最大輸出功率密度為44.5 μW·cm-2,E.colicell@PDA生物陰極的MFC的最大輸出功率密度為95.3 μW·cm-2,其產(chǎn)電性能遠(yuǎn)高于天然的大腸桿菌,進(jìn)一步說明E.colicell@PDA的電催化還原能力更好.從極化曲線可以看出,采用E.colicell@PDA的MFC比天然的大腸桿菌的MFC的極化曲線的斜率更小,說明其內(nèi)阻較小,有利于細(xì)菌與電極之間的電子轉(zhuǎn)移.對這兩種類型的MFC進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜(EIS)測試,EIS的Nyquist圖如圖4c所示,可以看出E.colicell@PDA生物陰極的電荷轉(zhuǎn)移電阻明顯低于天然的大腸桿菌,表明PDA的修飾提高了MFC的電荷轉(zhuǎn)移速率,大大降低了MFC的電荷轉(zhuǎn)移電阻.

為了證明PDA功能性涂層的黏附性,通過SEM圖對細(xì)菌在碳布電極上的附著情況進(jìn)行了分析.可以觀察到天然的大腸桿菌在光滑的碳布纖維上附著量相對較少(圖5a),而E.colicell@PDA在光滑的碳布纖維上形成了致密的生物膜(圖5b),結(jié)果表明PDA具有良好的黏附力,使細(xì)菌更大程度附著在電極上,從而改善了MFC的產(chǎn)電性能.

3 結(jié) 論

氧化還原活性的聚多巴胺通過原位聚合包覆在單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞表面,在不影響細(xì)菌細(xì)胞活力的情況下增強(qiáng)了ORR電催化活性以及最大輸出功率密度.PDA功能性涂層的引入不僅促進(jìn)了細(xì)胞的生物電催化活性,而且PDA具有許多親水基官能團(tuán),增強(qiáng)了細(xì)胞的黏附性,與細(xì)胞膜緊密接觸并均勻包裹在細(xì)胞表面,增強(qiáng)了細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移速率.本文研究為制備高活性生物電催化材料提供了一種方法,有利于促進(jìn)新型生物電催化劑的設(shè)計(jì)合成與性能探索.