紅莧菜總黃酮超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化、抑菌活性

楊金鳳，陳偉玲，呂錦萍

（賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899）

紅莧菜（Amaranthus tricolor L.），學(xué)名莧菜，別名雁來(lái)紅、紅菜、老少年，為莧科一年生草本植物[1]。具有清肝明目、降血脂、心臟保護(hù)和消腫解毒的功效，常以其葉片、根入藥，治療赤白痢疾、絳蟲(chóng)、黃疽等[2]。目前關(guān)于該植物的研究涉及天然紅色素的提取，浸泡酒制作工藝的優(yōu)化、化學(xué)成分組成以及提取物具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制和抗焦慮活性等方面[3-4]，有關(guān)總黃酮類物質(zhì)及其活性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?？傸S酮類化合物，是以糖苷或游離態(tài)形式存在于自然界的一類特殊化合物，是植物界較常見(jiàn)且分布廣的天然活性成分，具有抗癌抑菌、消炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗輻射、保護(hù)心血管、降脂等生理功效[5-6]。

在莧屬植物中總黃酮可從根、莖、葉等部位中進(jìn)行提取，其方法主要包括熱水提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等[7]。研究表明，超聲波輔助提取過(guò)程會(huì)產(chǎn)生空化、振動(dòng)、粉碎、攪拌等綜合效應(yīng)，可以提高細(xì)胞壁破碎速度增加溶劑滲透作用，達(dá)到提取細(xì)胞內(nèi)容物的目的，能有效提高天然產(chǎn)物成分的提取率[9]。因此，本試驗(yàn)擬采用超聲輔助乙醇提取法對(duì)紅莧菜總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并研究其抗氧化及抑菌活性，以期為今后紅莧菜的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅莧菜：市售；三氯化鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：茂名市雄大化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）、青霉素（分析純）：青島克斯特生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）、抗壞血酸（分析純）：天津鴻鑫化學(xué)藥品有限責(zé)任公司。

JE1103CE 電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際有限公司；R-1010 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：耀特設(shè)備科技有限公司；V-5600（PC）型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：元析儀器國(guó)際有限公司；KKRQ-409B 電導(dǎo)率儀：北京儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液于25 mL 比色管中，向其加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，加入0.3 mL 10%三氯化鋁溶液靜置6 min，最后加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻后靜置15 min[10]，空白對(duì)照使用75%乙醇溶液，將以上8 個(gè)不同濃度的蘆丁溶液于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)應(yīng)吸光值；以蘆丁質(zhì)量濃度為x 軸，吸光度為y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.008 7x+0.097 5，R2=0.996 5。

1.2.2 紅莧菜中總黃酮的提取

取2.0 g 紅莧菜樣品粉末，加入50 mL 乙醇溶液，60 ℃超聲輔助提取1.5 h，吸取1.0 mL 提取液，按照1.2.1 的方法，在波長(zhǎng)為510 nm 條件下測(cè)定樣品的吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1）固定提取時(shí)間2.0 h、料液比1∶30（g/mL），改變提取溫度條件（40、50、60、70、80 ℃），進(jìn)行超聲輔助提取，并測(cè)定紅莧菜總黃酮提取量，考察提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響。

2）保持提取溫度70 ℃不變，在料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）條件下超聲輔助提取2.0 h，測(cè)定總黃酮提取量，考察料液比對(duì)總黃酮提取量的影響。

3）固定提取溫度為70 ℃，料液比為1∶40（g/mL），考察提取時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 時(shí)對(duì)總黃酮提取量的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)各單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提取溫度、料液比、提取時(shí)間為考察因素，以總黃酮提取量為指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳提取工藝條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

DPPH 自由基清除能力測(cè)定，參照張曉婷等[11]的方法，按下列公式計(jì)算DPPH 自由基清除率X（%）。

式中：Ai為樣品溶液的吸光值；Aj為95%乙醇溶液的吸光值；A0為95%乙醇和DPPH 工作液的吸光值。

還原能力測(cè)定參考馬洪鑫等[12]的方法稍作修改，1 mL 樣品中加入濃度0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀2.5 mL，充分混勻，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min 離心10 min，最后加入2.5 mL 蒸餾水、0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，以未加樣品液的反應(yīng)溶液作為參比溶液，測(cè)定700 nm 處吸光值。

1.2.6 抑菌活性測(cè)定

取最佳工藝獲得的紅莧菜總黃酮，以30%乙醇配制相應(yīng)質(zhì)量濃度菌懸液為處理組，以無(wú)菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，以沒(méi)有加紅莧菜總黃酮處理的菌懸液為對(duì)照組，以30%乙醇溶液為陰性對(duì)照，青霉素為陽(yáng)性對(duì)照。最低抑菌濃度測(cè)定采用二倍稀釋法[13]，按下列公式計(jì)算抑制率Y（%）。

式中：C2為處理組的吸光值；C1為對(duì)照組的吸光值；C0為空白對(duì)照組的吸光值。

1.2.7 體外抑菌作用機(jī)制

將一定量培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，接種至含有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別加入稀釋后的紅莧菜總黃酮提取液。搖床培養(yǎng)，每小時(shí)取菌液4 mL，4 500 r/min 條件下離心10 min 收集上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于260 nm 和280 nm 處測(cè)量吸光值[14]。參考文獻(xiàn)[15]的方法使用電導(dǎo)率儀測(cè)量溶液的電導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 25.0、Origin 9.0 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

紅莧菜總黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紅莧菜總黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor test results for extraction of flavonoids from Amaranthus tricolor L.

由圖1 可知，提取溫度在40～80 ℃時(shí)，總黃酮提取量隨提取溫度的升高先增大后減小，總體增幅較小，50 ℃時(shí)提取效果最好，總黃酮提取量達(dá)到1.303 mg/g，此后隨著提取溫度的繼續(xù)升高，總黃酮提取量緩慢下降。由此說(shuō)明，提取溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響提取效果。適當(dāng)?shù)厣咛崛囟?，有利于加快分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而加快料液兩相間的混合及總黃酮物質(zhì)的溶出，當(dāng)提取溫度高于50 ℃，總黃酮提取量開(kāi)始下降，這可能是由于溶劑在提取過(guò)程中隨溫度的升高而揮發(fā)，以及在高溫狀態(tài)下總黃酮物質(zhì)發(fā)生分解[16]，因此確定提取溫度為50 ℃最佳。

料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，總黃酮提取量達(dá)最高值1.192 mg/g，之后繼續(xù)增加溶劑量，總黃酮提取量反而呈下降趨勢(shì)。其原因推測(cè)為溶劑量較少時(shí)紅莧菜中的總黃酮與乙醇接觸面積較小，溶出的總黃酮類物質(zhì)總黃酮濃度較低；隨著溶劑量的增加，乙醇與紅莧菜中的總黃酮接觸面積增大，總黃酮溶解度增大，總黃酮提取量也隨之增高；但乙醇溶液的量過(guò)多，脂溶性雜質(zhì)等含量也相對(duì)增加，從而影響總黃酮提取量[17]。因此，最佳料液比為1∶40（g/mL）。

紅莧菜中總黃酮提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減小，當(dāng)提取2.0 h 時(shí)，總黃酮提取量最高，為1.290 mg/g，提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)而總黃酮提取量逐漸降低。說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間加熱提取會(huì)破壞總黃酮類活性成分，降低其穩(wěn)定性，加速溶劑乙醇的揮發(fā)，影響提取效果[18]，因此，確定紅莧菜的最佳提取時(shí)間為2.0 h。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇提取時(shí)間、料液比、提取溫度3 個(gè)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)分析方案及結(jié)果Table 2 Scheme and results of orthogonal test

由表2 可知，影響紅莧菜總黃酮提取量的因素主次順序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間，根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，可確定最佳的提取條件為A2B2C3，即提取時(shí)間為2.0 h，料液比為1∶40（g/mL），提取溫度為70 ℃，進(jìn)一步根據(jù)最優(yōu)方案進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到紅莧菜總黃酮提取量平均值為1.498 mg/g，優(yōu)化后的提取方案重復(fù)性好，總黃酮提取量高于正交試驗(yàn)結(jié)果，表明本試驗(yàn)得出的最佳工藝結(jié)果具有可靠性。

2.3 抗氧化能力

紅莧菜總黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH 自由基清除效果見(jiàn)圖2。

圖2 紅莧菜總黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH 自由基清除效果Fig.2 DPPH free radical scavenging activities of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.and ascorbic acid

由圖2 可知，在考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅莧菜總黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基具有較好的清除能力（IC50值為38.5 μg/mL），但是弱于抗壞血酸，這可能是提取液中含有的色素及脂類的干擾，降低了其抗氧化活性。

紅莧菜總黃酮和抗壞血酸的還原能力見(jiàn)圖3。

圖3 紅莧菜總黃酮和抗壞血酸的還原能力Fig.3 Reducing power of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.and ascorbic acid

由圖3 可知，不同質(zhì)量濃度總黃酮提取液對(duì)Fe3+均有較強(qiáng)的還原能力，且總黃酮提取物的還原能力呈濃度依賴性增加。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為80.00 μg/mL 時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照溶液的還原能力相近。這可能是總黃酮類物質(zhì)與反應(yīng)體系中的金屬離子發(fā)生強(qiáng)烈的螯合反應(yīng)，從而更好地將三價(jià)鐵離子還原為亞鐵離子，進(jìn)而展現(xiàn)出良好的抗氧化活性[19-20]。

2.4 抑菌能力

紅莧菜總黃酮提取物對(duì)微生物的抑制作用見(jiàn)表3。

表3 紅莧菜總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effect of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on Staphylococcus aureus

由表3 可知，隨著紅莧菜總黃酮體積分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果不斷增強(qiáng)。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為50.0%時(shí)，抑菌圈直徑為7.0 mm，抑菌效果比較明顯，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到100.0%時(shí)，抑菌效果最強(qiáng)。可見(jiàn)，高體積分?jǐn)?shù)的黃酮類化合物對(duì)細(xì)菌的抑菌效果較好?；谏鲜鼋Y(jié)果，進(jìn)一步考察提取物的最小抑菌濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同濃度紅莧菜總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用Table 4 Inhibitory effects of different concentrations of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on the growth of Staphylococcus aureus

由表4 可知，紅莧菜總黃酮夠明顯抑制金黃色葡萄球菌的增殖，隨著濃度的增大生長(zhǎng)抑制率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)以濃度為2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 的紅莧菜總黃酮提取液處理時(shí)，其抑菌率分別為15.0%、39.5%、89.8%和95.6%，當(dāng)其濃度為40.00 mg/mL 時(shí)，抑制率達(dá)到了100.0%，即紅莧菜總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為40.00 mg/mL。

2.5 抑菌機(jī)制

細(xì)胞膜保持了細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，當(dāng)菌體受到外界侵害時(shí)，細(xì)胞膜的通透性和完整性受到損傷，使菌細(xì)胞內(nèi)容物（蛋白質(zhì)和核酸）大量泄漏，導(dǎo)致電導(dǎo)率增加[21]，因此細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和電導(dǎo)率的變化是表征細(xì)胞膜破裂的3 個(gè)重要指標(biāo)[14]。紅莧菜總黃酮對(duì)細(xì)胞膜通透性和電導(dǎo)率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 紅莧菜總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性和電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on cell membrane permeability and conductivity of Staphylococcus aureus

由圖4 可知，紅莧菜總黃酮提取物處理后的金黃色葡萄球菌在260 nm 和280 nm 處的吸光值與未添加提取物的對(duì)照組相比明顯增加，并隨著提取液濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，表明提取物引起了菌體細(xì)胞內(nèi)蛋白和核酸泄露。同樣，未添加紅莧菜總黃酮提取物的對(duì)照組，菌懸液中電導(dǎo)率增長(zhǎng)緩慢，當(dāng)提取物作用于金黃色葡萄球菌180 min 后其電導(dǎo)率與對(duì)照組相比增加了74.3%，這表明紅莧菜總黃酮提取物是通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜從而抑制其生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了紅莧菜總黃酮提取工藝。結(jié)果顯示最優(yōu)提取工藝為提取時(shí)間2.0 h、料液比1∶40（g/mL）、提取溫度70 ℃，在該工藝條件下，紅莧菜中的總黃酮提取量高達(dá)1.498 mg/g。此外，紅莧菜總黃酮提取物顯現(xiàn)出了較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力和還原能力，且抗氧化活性隨著提取液質(zhì)量濃度的增加而升高。由最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果可知，紅莧菜總黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制效果。通過(guò)抑菌機(jī)理試驗(yàn)可知，紅莧菜總黃酮提取物通過(guò)破壞細(xì)胞膜通透性或完整性，導(dǎo)致菌懸液中電導(dǎo)率增大，大分子物質(zhì)濃度上升明顯，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。綜上，紅莧菜總黃酮提取物表現(xiàn)出了較強(qiáng)的體外抗氧化能力和抑菌活性，后期將對(duì)其在抗氧化和抑菌活性的構(gòu)效關(guān)系和相關(guān)分子機(jī)理進(jìn)行深入研究。