豬肉脂肪酸堿法甲酯化工藝優(yōu)化及其脂肪酸組成分析

潘雷，劉志彬，李月明，2，倪雪，王軍茹，張根生*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所主食加工技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 151900）

豬肉是人們蛋白質(zhì)攝入的重要來源之一，而豬肉糜作為肉丸、肉餡、肉腸等眾多肉制品的主要原料，其獨(dú)特的風(fēng)味和口感備受消費(fèi)者喜愛[1]。隨著豬肉糜市場(chǎng)的逐年擴(kuò)大，肉糜摻雜的情況時(shí)有發(fā)生，摻雜肉樣難以辨別，一些廉價(jià)肉會(huì)被混入其中[2]。為了維護(hù)消費(fèi)者的健康和利益，需采取一系列方法對(duì)豬肉糜摻雜進(jìn)行鑒定。目前常見的肉類摻雜檢測(cè)技術(shù)有光譜分析[3]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)[4]、色譜分析、酶聯(lián)免疫分析等[5]。其中，光譜分析檢測(cè)成本較高；PCR 技術(shù)會(huì)產(chǎn)生假陽性、假陰性等問題；酶聯(lián)免疫分析不適用于加工過的肉制品，應(yīng)用范圍較窄。色譜技術(shù)檢測(cè)限低，定量準(zhǔn)確，應(yīng)用范圍也更廣泛。目前色譜分析主要是通過對(duì)肉類氨基酸、蛋白質(zhì)、肽類等成分的分析而鑒定其種類，但蛋白質(zhì)受熱變性會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響[6]。研究表明因每種肉類的脂肪酸組成和含量不同，可依據(jù)不同肉類的特征脂肪酸進(jìn)行摻雜鑒定[7]。

氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9]、薄層色譜法[10]是常見的脂肪酸組分分析方法。分析豬肉脂肪酸的組成一般利用氣相色譜法，該方法分離度好、靈敏度高且分析時(shí)長(zhǎng)短[11]，但由于脂肪酸在進(jìn)行氣相分析時(shí)是在高溫下進(jìn)行的，脂肪酸在高溫下容易產(chǎn)生脫酸、裂解等副反應(yīng)，會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生影響，所以在進(jìn)行色譜分析前，通常要將脂肪酸進(jìn)行甲酯化，轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯或丁酯。適宜的甲酯化方法不但可以準(zhǔn)確鑒定出豬肉的脂肪酸種類，還能夠提高試驗(yàn)的效率。吳妹英等[12]利用堿法甲酯化法處理莆田黑豬肉的脂肪，并通過氣相色譜法分析出其中飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總脂肪酸的42.01%。李丹丹等[13]選擇堿法甲酯化處理提取的發(fā)酵藏豬肉脂肪，采用氣相色譜法測(cè)定出豬肉樣品中含有36 種脂肪酸。李貴林等[14]選擇氫氧化鉀甲醇溶液進(jìn)行甲酯化，通過氣相色譜法分離出甘孜州藏豬肌肉中主要的8 種脂肪酸，并認(rèn)為該法有較好的精密度、重復(fù)性、可靠性。胡廣英等[15]采用氫氧化鉀甲醇溶液對(duì)豬肉脂肪進(jìn)行甲酯化，并利用氣相色譜法測(cè)定出樣品豬肉中21 種脂肪酸。前期在對(duì)豬肉樣品進(jìn)行堿法甲酯化的試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，堿法甲酯化的酯化溫度、酯化時(shí)間、酯化劑的添加量都對(duì)脂肪酸的檢測(cè)結(jié)果有不同的程度的影響，甲酯化的反應(yīng)是可逆的，添加適量的酯化劑才能保證反應(yīng)正向進(jìn)行，得到最優(yōu)的條件。本研究對(duì)甲酯化方法進(jìn)行優(yōu)化，為下一步的氣相色譜分析提供有利條件。這不僅有利于檢測(cè)出更多種類的脂肪酸，還能夠使油酸含量檢測(cè)的更準(zhǔn)確。本文參考王彥平等[16]的方法并稍加改動(dòng)，選擇豬的前、后腿肉，并在樣品中加入氫氧化鉀甲醇作為酯化劑，同時(shí)加入正己烷，采用超聲處理代替原方法中渦旋混勻，以期有效提高檢測(cè)結(jié)果的精確度。以豬肉中脂肪酸含量最多的油酸為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)比在不同堿法甲酯化條件下的油酸含量，得出最佳的甲酯化條件，為準(zhǔn)確測(cè)量豬肉中脂肪酸的種類與含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬前腿、后腿肉：市售。37 種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸：美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；甲醇、氫氧化鉀、正己烷、氯化鈉（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 7900 氣相色譜儀：上海天美儀器有限公司；500A 中草藥粉碎機(jī)：泰斯特儀器有限公司；H-511 電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；KQ-500 DE 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；202 電熱干燥箱：余姚市東方電工儀器廠；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉脂肪酸提取以及甲酯化

將豬前腿、后腿肉部位樣品于箒20 ℃冰箱中凍藏，進(jìn)行樣品前處理。各取不同批次豬的前腿、后腿肉各100 g，切成薄片于60 ℃烘箱中，烘干至恒重，用粉碎機(jī)將烘干肉樣混合粉碎，向1 g 豬肉樣品粉末中加入5 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH 和10 mL 正己烷，70 ℃條件下，水浴回流20 min，冷卻后加入15 mL 蒸餾水進(jìn)行超聲波處理，250 W 超聲5 min，結(jié)束后以3 000 r/min離心10 min。離心后取上層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.2 氣相色譜條件

色譜柱：選用DB-FastFAM 色譜柱（固定相為氰丙基），進(jìn)樣量1 μL，初始溫度140 ℃，持續(xù)5 min，以5 ℃/min 升至220 ℃，保持15 min。

1.3.3 油酸含量的計(jì)算

油酸含量計(jì)算方法選擇面積歸一化法，測(cè)定方法參照GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》[17]。

1.3.4 豬肉脂肪酸堿法甲酯化單因素試驗(yàn)

以油酸含量為指標(biāo)，研究甲酯化溫度（50、60、70、80、90 ℃）；甲酯化時(shí)間（10、15、20、25、30 min）；酯化劑添加量（3、5、7、9、11 mL）對(duì)豬肉中油酸含量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化堿法甲酯化條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)甲酯化的條件進(jìn)行分析與優(yōu)化，試驗(yàn)因素以及水平如表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平Table 1 Response surface factors and levels

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)取平均值，借助SPSS 13.0 數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著分析，利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 甲酯化溫度對(duì)油酸含量的影響

甲酯化溫度對(duì)油酸含量的影響見圖1。

圖1 甲酯化溫度對(duì)油酸含量的影響Fig.1 Effect of methyl esterification temperature on oleic acid content

如圖1 所示，不同甲酯化溫度對(duì)油酸含量有一定影響，隨著反應(yīng)溫度的升高，油酸含量先升高后降低，70 ℃時(shí)油酸含量最高，這是由于溫度升高會(huì)增加分子的運(yùn)動(dòng)速率，從而提高轉(zhuǎn)化率，油酸含量增加。溫度低于70 ℃時(shí)，甲酯化反應(yīng)不充分，油酸含量少，但甲酯化溫度過高時(shí)，甲醇容易發(fā)生汽化，會(huì)降低自身濃度，也可能會(huì)產(chǎn)生脂肪發(fā)生異構(gòu)化，使得反應(yīng)速率變慢，影響油酸的含量。此結(jié)果與李朝陽[18]研究結(jié)果相似。因此，選擇價(jià)值化溫度60、70、80 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 甲酯化時(shí)間對(duì)油酸含量的影響

甲酯化時(shí)間對(duì)油酸含量的影響見圖2。

圖2 甲酯化時(shí)間對(duì)油酸含量的影響Fig.2 Effect of methyl esterification time on oleic acid content

如圖2 所示，在10 min 到30 min 的反應(yīng)過程中，油酸含量逐漸升高后降低，這是由于反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)，甲酯化向正方向進(jìn)行，油酸含量隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，20 min 時(shí)可達(dá)到油酸含量的最大值。反應(yīng)在10～20 min時(shí)呈上升趨勢(shì)，在此期間甲酯化反應(yīng)不充分，油酸含量較低。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過20 min 之后，由于反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪氧化分解，導(dǎo)致脂肪酸含量有所損失，油酸含量逐漸下降。此研究結(jié)果與李朝陽等[19]研究結(jié)果類似。因此，選擇甲酯化時(shí)間15、20、25 min 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 酯化劑添加量對(duì)油酸含量的影響

酯化劑添加量對(duì)油酸含量的影響見圖3。

圖3 酯化劑添加量對(duì)油酸含量的影響Fig.3 Effect of addition amount of esterifying agent on oleic acid content

如圖3 所示，酯化劑添加量較少時(shí)，油酸含量較低，這主要是由于酯化劑作為一種催化劑，當(dāng)溶液中添加量較少時(shí)，達(dá)不到催化的最大作用。隨著酯化劑添加量的增大，脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化率逐漸增加，油酸含量逐漸增大，在酯化劑添加量為3～7 mL，酯化劑添加量與油酸含量成正相關(guān)。但隨著酯化劑添加量的增加，油酸含量降低，分析是由于甲酯化向正向進(jìn)行，加速了皂化反應(yīng)等副反應(yīng)的發(fā)生[20]。因此油酸含量不會(huì)一直升高，當(dāng)酯化劑添加量達(dá)到7 mL 后，轉(zhuǎn)化率逐漸平穩(wěn)，油酸含量緩慢下降。因此，選擇酯化劑添加量5、7、9 mL 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 堿法甲酯化測(cè)定豬肉脂肪酸響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results of Box-Behnken alkali-catalyzed methyl esterification for determination of pork fatty acids

采用Design-expert 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的油酸含量二次多元回歸模型公式為油酸含量=47.5-0.72A-0.4B-0.52C-0.97AB-0.34AC+0.13BC-4.83A2-3.96B2-3.44C2。

2.2.1 方差分析

回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)見表3。

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression equation coefficients and significance test

由表3 可知，F(xiàn)=146.73、P＜0.01，本試驗(yàn)中的響應(yīng)面回歸模型極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型的失擬項(xiàng)F=1.9、P=0.270 7＞0.05，說明非正常誤差的比例較小影響不顯著，因此該模型項(xiàng)是顯著的。該回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.994 7，證明該模型能解釋99.47%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有良好擬合度；方程決定系數(shù)R2Adj=0.987 9，也表明模型具有較高顯著性，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間具有良好一致性。CV=1.04%＜10%，表明該試驗(yàn)結(jié)果精確度較高；該模型Adeq Precision 的值為32.571，具有較高的精密度，說明該模型可預(yù)測(cè)。同時(shí)表明對(duì)豬肉脂肪酸中油酸含量擬合的回歸方程與上述檢驗(yàn)原則相符，具有良好的適應(yīng)性。對(duì)油酸含量的影響效果表明：A、B、C 3 個(gè)因素對(duì)豬肉脂肪酸中的油酸含量的影響顯著（P＜0.05），AB、A2、B2、C2對(duì)豬肉脂肪酸中的油酸含量影響極顯著（P＜0.01），而其他因素的影響則不顯著。各因素對(duì)油酸含量影響的大小順序?yàn)锳（甲酯化時(shí)間）>C（酯化劑添加量）>B（甲酯化溫度）。交互作用為AB>AC>BC。

2.2.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析及驗(yàn)證試驗(yàn)

甲酯化時(shí)間、甲酯化溫度和酯化劑添加量交互作用如圖4～圖6。

圖4 甲酯化時(shí)間與甲酯化溫度對(duì)油酸含量的影響Fig.4 Effects of methyl esterification time and temperature on oleic acid content

圖5 甲酯化時(shí)間與酯化劑添加量對(duì)油酸含量的影響Fig.5 Effects of methyl esterification time and addition amount of esterifying agent on oleic acid content

圖6 甲酯化溫度與酯化劑添加量對(duì)油酸含量的影響Fig.6 Effects of methyl esterification temperature and addition amount of esterifying agent on oleic acid content

曲線梯度反應(yīng)各因素對(duì)油酸含量的影響程度，響應(yīng)面越彎曲則表示此因素對(duì)油酸影響越大[21]。由圖4～圖6 可知，3 個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的曲線，即響應(yīng)值（油酸含量）存在極大值。

確定模型優(yōu)化得到甲酯化反應(yīng)的最佳條件：甲酯化時(shí)間19.65 min、甲酯化溫度69.58 min、酯化劑添加量6.85 mL?？紤]試驗(yàn)實(shí)際操作的可行性，按照調(diào)整后的試驗(yàn)條件進(jìn)行，即甲酯化時(shí)間19.6 min、甲酯化溫度69.5 min、酯化劑添加量6.8 mL，在相同條件下重復(fù)進(jìn)行3 次試驗(yàn)，得到油酸含量為46.74%，與得出的預(yù)測(cè)值47.56%相差0.82%，相差較小，兩者吻合性較好，說明該模型能較好反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。此反應(yīng)條件下不僅甲酯化效率高，而且試驗(yàn)反應(yīng)快速、簡(jiǎn)單。

2.3 豬肉脂肪酸的組成成分分析

2.3.1 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜分析結(jié)果

脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖見圖7，37 種脂肪酸出峰序號(hào)及名稱見表4。

圖7 37 種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜圖Fig.7 Standard gas chromatogram of 37 fatty acids

表4 37 種脂肪酸出峰序號(hào)及名稱Table 4 Eluotropic sequence and names of 37 fatty acids

由表4 可知，37 種脂肪酸的各組分分離程度較好，被實(shí)驗(yàn)選用的氣相色譜條件以及標(biāo)準(zhǔn)品適合分析豬肉脂肪酸的組成成分。

2.3.2 甲酯化方法優(yōu)化前豬肉脂肪酸組成成分的測(cè)定

甲酯化方法優(yōu)化前豬肉脂肪酸的氣相色譜圖見圖8，其豬肉脂肪酸出峰序號(hào)及名稱見表5。

圖8 甲酯化方法優(yōu)化前豬肉脂肪酸的氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of pork fatty acids before process optimization for methyl esterification

表5 甲酯化方法優(yōu)化前豬肉脂肪酸出峰序號(hào)及名稱Table 5 Eluotropic sequence and name of pork fatty acids before process optimization for methyl esterification

由表5 可知，在甲酯化方法未優(yōu)化時(shí)，豬肉樣品中共檢測(cè)出7 種脂肪酸，主要以棕櫚酸（含量為14.800%）、反油酸（含量為12.230%）、二十三酸（含量為4.860%）為主，其他組分相對(duì)含量較低。這與王毅等[22]測(cè)定豬肉脂肪酸組成的試驗(yàn)結(jié)果（棕櫚酸19.02%，硬脂酸17.90%，油酸33.21%）相比，棕櫚酸含量相差不大，但其他種類脂肪酸含量有明顯差距。

2.3.3 甲酯化方法優(yōu)化后豬肉脂肪酸組成成分的測(cè)定

甲酯化方法優(yōu)化后豬肉脂肪酸的氣相色譜圖見圖9，其豬肉脂肪酸出峰序號(hào)及名稱見表6。

圖9 甲酯化方法優(yōu)化后豬肉脂肪酸的氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of pork fatty acids after process optimization for methyl esterification

表6 甲酯化方法優(yōu)化后豬肉脂肪酸出峰序號(hào)及名稱Table 6 Eluotropic sequence and name of pork fatty acids after process optimization for methyl esterification

由表6 知，試驗(yàn)測(cè)得豬肉中共含有17 種脂肪酸，主要以油酸（47.395%）、棕櫚酸（22.433%）、硬脂酸（15.111%）、反亞油酸（4.040%）、棕櫚油酸（2.982%）、月桂酸（1.645%）為主，其他組分含量相對(duì)較低。

與未優(yōu)化甲酯化方法測(cè)定豬肉脂肪酸的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，可檢測(cè)出的豬肉脂肪酸種類由7 種增加至17 種，月桂酸、棕櫚酸、棕櫚油酸所被檢測(cè)出的含量明顯提高，同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了油酸是豬肉中主要的脂肪酸，含量為47.395%。

通過對(duì)王彥平等[16]所采用的甲酯化方法的改進(jìn)，本試驗(yàn)檢測(cè)出的脂肪酸種類較豐富，與方晨等[23]采用氣相色譜法檢測(cè)分析豬肉中的15 種脂肪酸相比有所增多。并且優(yōu)化后的甲酯化方法所檢測(cè)出的油酸和棕櫚油酸含量相較于李瑩瑩等[24]測(cè)定豬肉脂肪酸含量中棕櫚油酸（1.629%）、油酸（39.208%）有顯著提高。席斌等[25]和Joo 等[26]測(cè)定的豬肉中不包含反油酸，這可能與色譜柱的分離能力不同有關(guān)。此外，豬肉不同品種以及不同部位，其脂肪酸的組成和含量也有所差異[27]。黃業(yè)傳等[28]發(fā)現(xiàn)榮昌豬肉中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸在不同部位間有顯著差異。豬肉中以油酸、棕櫚油酸和亞油酸為代表的不飽和脂肪酸，具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫力、調(diào)節(jié)脂類代謝等功效[29]。適當(dāng)攝入以月桂酸、棕櫚酸和硬脂酸為代表的飽和脂肪酸能增加膽固醇和中性脂肪，為人體提供能量[23]。因此，探究合適的脂肪酸提取條件對(duì)脂肪酸功能研究同樣具有意義。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以油酸含量為指標(biāo)，采取單因素試驗(yàn)并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化豬肉堿法甲酯化工藝中的甲酯化時(shí)間、甲酯化溫度和酯化劑添加量3 個(gè)因素。結(jié)果表明：堿法甲酯化的最佳工藝參數(shù)為甲酯化時(shí)間19.6 min、甲酯化溫度69.5 ℃、酯化劑添加量6.8 mL，在此條件下得到油酸含量為46.74%。通過氣相色譜儀對(duì)豬肉的脂肪酸組成成分以及含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明豬肉中含有17 種脂肪酸。

本研究對(duì)傳統(tǒng)的甲酯化工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定一種新的甲酯化工藝參數(shù)，該工藝條件下能夠檢測(cè)出更多種類的脂肪酸，氣相色譜圖的出峰效果也有明顯改善，可為豬肉類產(chǎn)品中脂肪酸種類和含量的測(cè)定以及后續(xù)通過特征脂肪酸種類和含量進(jìn)行肉糜摻雜鑒定提供參考。