聚丙烯/明膠雙層膜的制備及其對真空冷鮮羊肉腐敗菌的抑制作用

王世靜，柴笑玉，田寒雪，時子丹，侯成立，張志勝，饒偉麗*，張德權(quán)

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運管控重點實驗室，北京 100193）

目前市場上羊肉的流通形式主要有冷鮮肉和冷凍肉，其中冷鮮肉在流通過程中通常是簡單包裝或無包裝，易受微生物污染而腐敗變質(zhì)。真空包裝結(jié)合冷藏或冰溫可以抑制肉中好氧微生物的生長繁殖，延長其貨架期[1-3]。但根據(jù)目前國內(nèi)的研究，我國真空包裝冷鮮肉的保質(zhì)期不超過30 d[4]。因此，進一步延長真空包裝冷鮮肉的貯藏期，迫切且必要。近年來，保持冷鮮肉貯藏期間品質(zhì)并延長貨架期的活性包裝成為開發(fā)的熱點。明膠具有良好的成膜和吸水性，是活性包裝材料的較好選擇[5]。研究表明，將明膠涂膜或制成膜包裹在冷鮮肉表面可以減少汁液流失、改善色澤變化、延長保質(zhì)期[6-8]。但明膠膜因具有高吸水性和吸水后發(fā)黏、易碎、阻隔性變差等特性[9]，將其單獨應(yīng)用于包裹冷鮮肉比較困難。因此，將明膠與塑料膜制成雙層膜，將極大地增強明膠膜的性能并擴展它的應(yīng)用范圍[10]。聚丙烯（oriented polypropylene，OPP）是一種食品級塑料，其無色無味，具有拉伸強度高、阻氣性良好、成本低等優(yōu)點。OPP 與明膠制成的雙層膜，在物理性能等方面都有較為顯著的提升，能更好地應(yīng)用于冷鮮肉保鮮。

在此基礎(chǔ)上，將活性物質(zhì)添加到明膠層中制成聚丙烯/明膠雙層膜活性包裝，以改善冷鮮肉貯藏期間的感官品質(zhì)劣變。精油提取于天然植物和香料，具有抗氧化和抗菌活性，將其添加到薄膜中包裹食品，可提高食品貯藏期間品質(zhì)，減少脂肪氧化，延長產(chǎn)品貨架期[11-15]。但精油的種類繁多，相關(guān)研究多為將單一精油添加到膜中，而將多種精油復(fù)配的研究較少，另外精油的抑菌性試驗中菌種的選擇針對性不強。精油種類對真空冷鮮羊肉中優(yōu)勢腐敗菌的抑制作用的影響還有待進一步確認。

本試驗選用了14 種精油，研究其對從真空冷鮮羊肉篩選鑒定出的19 株腐敗微生物的抑制作用，篩選出效果最佳的植物精油，然后進行復(fù)配。對比添加不同濃度復(fù)配精油的雙層膜的抑菌性、膜厚、機械性能、色澤、透光率、阻隔性和感官評分等指標，確定復(fù)配精油添加的最適濃度，以期為后續(xù)制備天然抑菌、抗氧化的真空冷鮮羊肉活性包裝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明膠、甘油、吐溫80（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；OPP 膜[40 cm×40 cm，厚度為（28.0±0.5）μm]：潮州市潮安區(qū)宏美紙塑包裝廠；肉桂精油、牛至精油、百里香精油、芥末精油、柑橘精油（蒸餾和冷榨）、甜橙精油（蒸餾和冷榨）、柚皮精油（蒸餾和冷榨）、葡萄柚精油（蒸餾和冷榨）、佛手柚精油（蒸餾和冷榨）：深圳市國鑫香精香料有限公司；平板計數(shù)瓊脂、營養(yǎng)肉湯：青島海博生物技術(shù)有限公司。

19 株羊肉腐敗菌由河北農(nóng)業(yè)大學畜產(chǎn)品加工創(chuàng)新實驗室從真空冷藏8 d 的羊背最長肌上分離，通過16S rDNA 測序（引物為27F1492R）方法鑒定，分離鑒定后的19 株菌株加甘油，于-18 ℃保藏。19 株菌分別為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、美洲愛文氏菌、液化沙雷氏菌、沙雷氏菌屬、液化沙雷氏菌屬SP025、液化沙雷氏菌屬P2ACOL2、哈夫尼亞菌屬B315、哈夫尼亞帕拉維、蜂房哈夫尼亞菌、成團泛菌、彎曲乳桿菌、變異棒桿菌、倫登假單胞菌、韓國假單胞菌、松柏假單胞菌、假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌、嗜根考克氏菌、腐生葡萄球菌。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（AR23CN）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；真空干燥箱（DZF-6050）：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；智能磁力攪拌器（ZNCL-GS）：廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；數(shù)顯測厚儀（DTG D2）：德力電氣工技術(shù)有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2800）：尤尼柯儀器有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式蒸汽滅菌鍋（BXM-30R）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DGH3600B）：天津市泰斯特儀器有限公司；高品質(zhì)電腦色差儀（NR60CP）：深圳市三恩時科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 14 種植物精油對羊肉中腐敗菌抑菌作用的測定

吸取300 μL 從真空冷鮮羊肉篩選、鑒定并由甘油保藏的菌液，加入10 mL 營養(yǎng)肉湯中，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，將菌液稀釋至1×106CFU/mL 后取100 μL 加入平板計數(shù)瓊脂中，搖勻倒板，用移液槍吸取5 μL 精油滴在直徑6 mm 的濾紙小圓片后將其放入平板中央，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈直徑，做3 個平行。

1.3.2 精油復(fù)配比例的確定

將芥末精油與牛至精油按體積比1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1 進行復(fù)配。選取真空4 ℃冷藏至第8 天的羊肉25 g，放入225 mL 的生理鹽水中，均質(zhì)后靜置30 min，吸取300 μL 上述液體加入10 mL 營養(yǎng)肉湯中，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，制得羊全菌菌液，參考1.3.1 的步驟進行抑菌圈試驗。

1.3.3 不同復(fù)配精油濃度OPP/明膠雙層膜的制備

稱量4 g 明膠，放入燒杯中加入300 mL 蒸餾水，在智能磁力攪拌器中以60 ℃、800 r/min 的條件攪拌1 h，隨后加入1.2 g 甘油繼續(xù)攪拌0.5 h，將復(fù)配精油分別以明膠質(zhì)量的0%、10%、20%、30%、40%與吐溫80 按照2∶1（mL/g）液料比制成混合溶液，加入明膠溶液中，常溫下攪拌1 h，倒入鋪有OPP 膜的亞克力成膜槽（26 cm×26 cm×4 cm），在真空干燥箱中以50 ℃干燥15 h。

1.3.4 抑菌性能的測定

將1.3.2 制得的菌液稀釋至1×105CFU/mL，并吸取1 mL 放入培養(yǎng)皿，平板計數(shù)瓊脂倒板搖勻，干燥后在培養(yǎng)基的中央放置4 cm×4 cm 精油雙層膜，以未添加精油的膜作為空白對照，于37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)，每組3 個平行。

1.3.5 膜厚的測定

每張雙層膜上均勻取9 個點，由數(shù)顯測厚儀測量膜厚，取平均值。

1.3.6 機械性能的測定

根據(jù)Nur Hanani 等[16]的方法測定雙層膜的機械性能，平行測定3 次。

1.3.7 阻濕性能的測定

根據(jù)Wang 等[17]的方法對雙層膜的水蒸氣透過率（water vapor permeability，WVP）進行測定。

1.3.8 阻氧性能的測定

根據(jù)王晗等[18]的方法對雙層膜的透氧系數(shù)進行測定，確定其阻氧性能，平行測定3 次，取平均值。

1.3.9 阻光性能的測定

室溫下，將平整光滑的雙層膜裁成1.0 cm×4.5 cm大小，緊貼比色皿內(nèi)一側(cè)，測定其在200～800 nm 波長范圍內(nèi)的透光率，以空比色皿作為對照，平行測定3 次。

1.3.10 顏色測定

利用高品質(zhì)電腦色差儀測定雙層膜的色澤，以白板作為色差測定參比，每張膜上選擇5 處位置測量L*值、a*值、b*值，1 個點從中央選取，其余點沿著膜四周取，計算平均值。

1.3.11 感官評價

將樣品膜分別放在白色干凈的盤子上，分別對樣品膜進行編號。測試者進行描述性感官培訓后對樣品進行評分。感官評分標準如表1 所示。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory scoring criteria

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表示為平均值±標準差，多組間數(shù)據(jù)差異性比較使用單因素方差分析，采用Duncan's 檢驗與最小顯著差異法進行均值多重比較；使用Origin 2019 軟件作圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 14 種精油對羊肉中腐敗菌的抑制效果

14 種精油對羊肉中的19 株腐敗菌的抑制圈直徑見表2，不同精油對不同腐敗菌的抑菌效果比較見表3。

表2 不同精油對真空冷鮮羊肉中不同腐敗菌的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of different essential oils on different spoilage bacteria of vacuum-packed chilling fresh lamb mm

表3 不同精油對真空冷鮮羊肉中不同腐敗菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effects of different essential oils on different spoilage bacteria of vacuum-packed chilling fresh lamb

抑菌圈試驗判定標準：抑菌圈直徑＞20 mm 為極度敏感；15～20 mm 為敏感；10～＜15 mm 為中度敏感；7～＜10 mm 為低度敏感；＜7 mm 為不敏感。由表2 可知，不同精油對真空冷鮮羊肉中的腐敗菌有著不同的抑制效果，在考察的14 種植物精油中，芥末精油對真空冷鮮羊肉中的絕大部分腐敗菌極度敏感。芥末精油對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、倫登假單胞菌、假單胞菌、液化沙雷氏菌屬P2ACOL2、液化沙雷氏菌屬SP025、產(chǎn)堿假單胞菌、嗜根考克氏菌、哈夫尼亞菌屬B315 和腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑更是超過90 mm，但對沙雷氏菌屬某些菌株以及對哈夫尼亞帕拉維的敏感性差。多數(shù)情況下，牛至精油較芥末精油的抑菌圈小，但牛至精油對芥末精油低度敏感的2 株腐敗菌極度敏感，因此將芥末精油和牛至精油進行復(fù)配加入膜材料，可以提高抑制真空冷鮮羊肉中腐敗微生物的能力。肉桂精油和百里香精油多處于敏感與中度敏感之間。柚皮精油和葡萄柚精油只對一小部分腐敗菌低度敏感，其余的水果來源精油，無論蒸餾還是冷榨，對于真空冷鮮羊肉中的腐敗菌均不敏感，水果來源的精油并不適合用在真空冷藏羊肉保鮮中。李新福[19]在研究中也發(fā)現(xiàn)，芥末精油、牛至精油、肉桂精油的抑菌效果比水果來源的精油（包括葡萄柚精油、檸檬精油、柑橘精油）對乳酸菌、肉食桿菌P9、腸桿菌P20、葡萄球菌P2 具有更好的抑制作用，水果來源的精油一般表現(xiàn)為低度敏感，較本研究中水果來源精油抑菌性稍強，這可能與精油的來源有關(guān)，也可能與受試菌株有關(guān)。孟玉霞等[20]在研究中也發(fā)現(xiàn)，肉桂精油比水果來源的精油對熱殺索絲菌、溫和氣單胞菌和海希瓦氏菌抑制效果更強，兩種水果來源精油對3 種受試菌均不敏感。

植物精油的抑菌性取決于其中的有效組分，作用成分不同，抑菌性不同。柑橘精油、葡萄柚精油主要作用成分為單萜類物質(zhì)（例如檸檬烯等），肉桂精油主要作用成分為肉桂醛，百里香精油主要作用成分為百里酚，牛至精油主要作用成分為香芹酚和百里酚，芥末精油中主要成分為異硫氰酸烯丙酯[21]。精油的抑菌作用不能歸因于某一種特定的機制，但精油對細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞已被確認為精油對微生物最重要的作用機制[22]。Zhang 等[23]的研究結(jié)果表明，肉桂精油會導(dǎo)致存活的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞外，使培養(yǎng)液中核酸和蛋白質(zhì)水平升高。Di Pasqua 等[24]的研究結(jié)果表明，百里酚、檸檬烯、丁香酚和肉桂醛可以分別與對其敏感的細菌的細胞膜作用，從而造成細胞膜損傷，改變脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，降低磷脂雙分子層中不飽和脂肪酸的濃度。

單一精油容易使菌產(chǎn)生脫敏性，且氣味較大，會引起食品感官的顯著變化而不被消費者接受，不同精油組合可以增強抗菌效果，并且不會顯著改變食物的感官特性[25]，結(jié)合表3 抑菌效果的比較，選定芥末精油和牛至精油進行復(fù)配，作為活性包裝明膠層中添加的活性成分。

2.2 不同復(fù)配比例精油的抑菌效果

不同體積比的芥末精油和牛至精油對羊肉中腐敗菌的抑菌效果見表4。

表4 芥末和牛至復(fù)配精油的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of the compound mustard and oregano essential oils

由表4 可知，對于真空冷鮮羊肉中的腐敗菌混合液，芥末精油抑菌圈直徑為80.00 mm，牛至精油抑菌圈直徑為38.00 mm，即芥末精油抑菌效果遠好于牛至精油。兩種精油復(fù)配后，相較于單獨的牛至精油抑菌效果顯著增強，但與芥末精油的抑菌圈直徑差異較小，其中芥末精油與牛至精油體積比為1∶4 和4∶1 的抑菌圈直徑分別為74.33 mm 和77.33 mm，且彼此間差異性不顯著。然而芥末精油本身揮發(fā)性強，抑菌作用時間短，強烈的氣味使得消費者接受程度低[26]，因此選定芥末精油:牛至精油=1∶4 的體積比，作為活性包裝中明膠層精油的復(fù)配比例。

2.3 復(fù)配精油濃度對雙層膜抑菌性的影響

添加不同濃度復(fù)配精油的OPP/明膠雙層膜對羊肉中腐敗菌的抑制效果見圖1。

圖1 不同濃度復(fù)配精油OPP/明膠雙層膜的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of OPP/gelatin bilayers with different concentrations of compound essential oils

由圖1 可知，隨著復(fù)配精油濃度的提高，雙層膜對腐敗菌的抑制效果逐漸增強，菌落數(shù)呈現(xiàn)階梯式下降趨勢。復(fù)配精油濃度為10%時，對比0%的雙層膜抑菌效果顯著增強（P＜0.05），濃度為40%時，抑菌效果達到最佳，當復(fù)配精油濃度從30%增加到40%時抑菌效果無顯著差異。雙層膜的抑菌效果與膜中復(fù)配精油的濃度以及遷移至食品表面的速度有關(guān)。芥末精油主要成分——異硫氰酸烯丙酯易揮發(fā)，在含水基質(zhì)中易水解，易與一些自由氨基酸反應(yīng)[27]。牛至精油主要成分——香芹酚和百里酚，易揮發(fā)、疏水、可以和某些蛋白質(zhì)結(jié)合，用前需要乳化。在攪拌和干燥過程中異硫氰酸烯丙酯還會發(fā)生降解。這些作用導(dǎo)致干燥完成時的雙層膜中復(fù)配精油含量下降。復(fù)配精油從明膠膜中遷移到食品表面的速度與明膠結(jié)構(gòu)、精油乳化時間和方法等因素有關(guān)。由于復(fù)配精油遷移緩慢，因此可較長時間維持食品表面的復(fù)配精油濃度在一定范圍內(nèi)，從而延長貨架期[28]。

2.4 復(fù)配精油濃度對雙層膜物理性能的影響

添加不同濃度復(fù)配精油雙層膜的膜厚、機械性能、阻濕性能、阻氧性能見表5。

表5 不同濃度復(fù)配精油雙層膜的膜厚、機械性能、阻濕性能、阻氧性能Table 5 Thickness,mechanical properties,water vapor permeability coefficient,and oxygen permeability coefficient of OPP/gelatinbilayers with different concentrations of compound essential oils

由表5 可知，隨著復(fù)配精油的添加，膜厚逐漸增加。復(fù)配精油濃度增加到30%時，膜厚較未添加復(fù)配精油時顯著增加（P＜0.05）。未添加復(fù)配精油的膜厚為0.073 mm，濃度從10%增加到40%，膜厚從0.074 mm上升至0.087 mm。這是由于明膠與芥末精油、牛至精油為互不相融成分，隨著濃度的增加，明膠層結(jié)構(gòu)的疏松度隨之增加，從而增加了膜厚[29]。

抗拉強度由大到小排列順序為20%＞30%＞10%＞0%＞40%?？估瓘姸入S著復(fù)配精油濃度的增大，先升高后降低，濃度為20%時，達到最大值72.93 MPa。添加適量復(fù)配精油，抗拉強度增加，主要是因為明膠與復(fù)配精油相互作用，減小了其自由體積和分子鏈的流動性，而過量的復(fù)配精油會導(dǎo)致不連續(xù)的異質(zhì)膜結(jié)構(gòu)形成，減弱了膜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此抗拉強度降低[30]。雙層膜的斷裂伸長率隨著復(fù)配精油濃度增加而逐漸降低，可能是復(fù)配精油的添加使分子間的相互作用力增強，雙層膜強度增加，斷裂伸長率從而降低[31]。在應(yīng)用中，包裝膜需抵抗相當大的應(yīng)力而不斷裂。

水蒸氣透過率是薄膜對水分阻隔效果的反映。由表5 可知，不同濃度的復(fù)配精油雙層膜水蒸氣透過率差異性并不顯著，且都有較好的阻濕性能，這與OPP層結(jié)構(gòu)的緊實度有關(guān)。

隨著復(fù)配精油濃度的增加，雙層膜的透氧系數(shù)減小，即薄膜有更好的氣體阻隔性，一方面是由于復(fù)配精油與明膠結(jié)合后氣體通過薄膜的路徑更加彎曲復(fù)雜，減少了氣體的通過，另一方面是由于膜厚的增加，阻氧性得到了提升。

2.5 復(fù)配精油濃度對雙層膜顏色的影響

添加不同濃度復(fù)配精油雙層膜的顏色變化見表6。

表6 不同濃度復(fù)配精油雙層膜的顏色Table 6 Color difference of OPP/gelatin bilayers with different concentrations of compound essential oils

由表6 可知，添加復(fù)配精油的雙層膜L*值均顯著低于未添加復(fù)配精油的雙層膜，且隨著復(fù)配精油濃度的增加，L*值整體呈減小趨勢；a*值在20%時顯著減?。≒＜0.05）；b*值在20%時顯著增加（P＜0.05）。說明加入復(fù)配精油后，雙層膜的透明度降低，紅色變淺，黃色加深，這是由于芥末精油為黃綠色，牛至精油為黃色，雙層膜的顏色受到復(fù)配精油顏色的影響，而雙層膜的顏色也會影響消費者對肉顏色的判斷。

2.6 復(fù)配精油濃度對雙層膜阻光性能的影響

添加不同濃度復(fù)配精油雙層膜的透光率見圖2。

圖2 不同濃度復(fù)配精油OPP/明膠雙層膜的透光率Fig.2 Optical transmittance of OPP/gelatin bilayers with different concentrations of compound essential oils

由圖2 可知，不同濃度復(fù)配精油雙層膜的透光率隨著波長的增加而增加。雙層膜對于200～280 nm的紫外輻射具有更好的阻隔性，這是由于明膠等蛋白類的膜中吸收紫外光的酪氨酸和色氨酸的含量豐富[32]。加入復(fù)配精油的雙層膜透光率變低，且隨著復(fù)配精油濃度的增加，雙層膜的透光率整體上呈下降趨勢，這是由于復(fù)配精油的散色作用降低了雙層膜的透光率，阻光性增加，而復(fù)配精油濃度越大，散光性作用越強，雙層膜的阻光性越強[33]。在加入復(fù)配精油之后雙層膜的紫外阻隔性能增強，而紫外線會引起冷鮮肉的營養(yǎng)物質(zhì)和風味物質(zhì)變化，加速其脂質(zhì)氧化，從而加速冷鮮肉的腐敗變質(zhì)，因此雙層膜對紫外光吸收越多，透光率越低，肉脂質(zhì)氧化速率越慢，冷鮮肉貯藏期品質(zhì)越好[17]。在實際應(yīng)用中應(yīng)結(jié)合所包裝食品的色澤以及雙層膜顏色的可接受度等選擇合適的復(fù)配精油濃度。

2.7 復(fù)配精油濃度對雙層膜感官接受度的影響

添加不同濃度復(fù)配精油雙層膜的感官評分見圖3。

圖3 不同濃度復(fù)方精油對OPP/明膠雙分子層的感官評價結(jié)果Fig.3 Sensory evaluation results of OPP/gelatin bilayers with different concentrations of compound essential oils

由圖3 可知，復(fù)配精油的添加對雙層膜的柔軟度、光滑度、透明度、氣味和顏色都有影響，且隨著濃度的增加，影響越大。雖然高濃度的復(fù)配精油對真空冷鮮羊肉中腐敗菌的抑制效果更好，但必須考慮復(fù)配精油氣味對冷鮮羊肉的影響。根據(jù)前期的研究得知，6 分是雙層膜顏色、氣味、光滑度、柔軟度、透明度等指標的接受下限，通過感官評價結(jié)果可知，隨著復(fù)配精油濃度的增加，感官評分逐漸降低，0%～20%時雙層膜的5 項感官指標測試者都表示可以接受，當濃度為30%～40%時，膜的5 項感官指標評分開始低于6，測試者表示不能接受。綜合比較抑菌性、機械性能、阻隔性能和感官評價等指標，添加20%復(fù)配精油的OPP/明膠雙層膜最適合于冷鮮羊肉的真空包裝。

3 結(jié)論

柑橘、葡萄柚等蕓香科植物精油對真空冷鮮羊肉中腐敗菌的抑菌效果有限，百里香精油、肉桂精油、牛至精油都有較好的抑菌性，而芥末精油抑菌效果最好。與未添加復(fù)配精油的空白對照組相比，芥末精油與牛至精油復(fù)配添加后的OPP/明膠雙層膜有顯著的抑菌效果，且隨著復(fù)配精油濃度的增加抑菌效果增強。復(fù)配精油濃度30%或40%的雙層膜機械性能較差，顏色偏黃，感官評分不在測試者的接受范圍內(nèi)；復(fù)配精油濃度為10%的雙層膜機械性能一般，阻隔性能較差；復(fù)配精油濃度為20%的雙層膜機械性能最佳，顏色透明，阻隔性較好，具有一定的抑菌效果，感官評分在測試者的接受閾值內(nèi)。綜合判斷，復(fù)配精油濃度為20%的OPP/明膠雙層膜適合真空冷鮮羊肉保鮮。研究結(jié)果為真空冷鮮羊肉活性包裝的開發(fā)提供了支撐。