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    酶聯(lián)免疫吸附試驗在獸藥殘留檢測應(yīng)用中的體會

    2023-08-08 18:52:09李漢中
    河北農(nóng)業(yè) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:移液器免疫吸附工作液

    □文/李漢中

    酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是當(dāng)前應(yīng)用廣泛的一項定性/半定量檢測抗體(抗原)的免疫酶檢測技術(shù)。其基本原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合,將待測物質(zhì)(違禁物或獸藥小分子)作為抗原與其特異性抗體反應(yīng),再利用酶的高效催化性將此反應(yīng)效果放大,用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),存在一定的線性相關(guān)關(guān)系,故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。目前,已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測、生物毒素檢測、農(nóng)藥殘留檢測、微生物檢測、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測等多個領(lǐng)域。

    ELISA 作為一種快速檢測方法由于其操作簡單,能得到定量檢測結(jié)果,廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域。與我們生活息息相關(guān)的肉、蛋、奶以及常見的水產(chǎn)品如魚,蝦中的違禁藥物,像大家熟知的“瘦肉精”“蘇丹紅”“三聚氰胺”“黃曲霉M1”以及常見的抗生素都有技術(shù)成熟的試劑盒。

    本人從事獸藥殘留檢測多年,發(fā)現(xiàn)關(guān)于ELISA 的科學(xué)研究方面的文章比較多,本文著重討論多年來使用ELISA 檢測試劑盒進行獸藥殘留檢測的經(jīng)驗和教訓(xùn),以期與各檢測單位一線工作者分享。

    一、酶聯(lián)免疫吸附試驗的地位

    酶聯(lián)免疫吸附試驗自20 世紀70 年代問世以來經(jīng)過了近幾十年的快速發(fā)展,已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。雖然其有假陽性率高、反應(yīng)過程對外界環(huán)境要求較高、反應(yīng)時間較長(相對于膠體金快檢卡而言)等缺點,但由于其費用低廉、前處理簡單、儀器設(shè)備便于操作、結(jié)果定量化、安全性好、污染小,在今后相當(dāng)長的一段時間內(nèi)仍會在相關(guān)企業(yè)、基層檢測機構(gòu)扮演重要角色。

    二、影響酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果的幾個方面

    (一)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的選擇

    由于酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理,因此不同企業(yè)生產(chǎn)的抗體的特異性,穩(wěn)定性的好壞對整個試劑盒的檢測結(jié)果影響較大。結(jié)合本人多年以來的工作經(jīng)驗而言,采購試劑盒時一定要慎重選擇其生產(chǎn)企業(yè),要購買那些技術(shù)研發(fā)實力雄厚的企業(yè)的產(chǎn)品,建議可參考農(nóng)業(yè)部備案的廠家目錄。因其技術(shù)水平相對較高,產(chǎn)品相對較穩(wěn)定。十幾年前本人使用過一些不知名企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒,在使用過程中出現(xiàn)了假陽性率過高,標準曲線不成線性等問題。

    (二)酶標儀的選擇

    酶聯(lián)免疫吸附試驗除了用到檢測試劑盒之外,在整個試驗過程中還有一個重要的儀器設(shè)備那就是酶標儀。其用來測量加完終止液后酶標孔中液體的吸光度。利用其中某種物質(zhì)含量與其吸光度之間的函數(shù)關(guān)系,來反推待測物濃度,因此不同廠家、不同型號之間的質(zhì)量也存在差異,在選購之前要認真考慮。

    (三)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用過程中需要注意的問題

    1.樣品的前處理

    一般來講酶聯(lián)免疫吸附試劑盒中待檢樣品的前處理需要經(jīng)過樣品稱量、目標物提取等步驟。具體操作就是在稱量好的樣品中加入某種試劑,振蕩混勻,然后離心,離心后有的直接取上清液若干量,再加上復(fù)溶工作液若干量,混勻后即可用于檢測;有的上清液需要再50~60℃氮氣吹干后,加入一定量的正己烷,混勻一定時間,再加入一定量的復(fù)溶工作液,混勻、振蕩、離心后取下層水相直接用于檢測。本人認為在這些環(huán)節(jié)中,樣品的稱量很關(guān)鍵,首先要根據(jù)稱量準確選擇精確度符合要求的天平。其次振蕩、離心這兩個環(huán)節(jié)對試驗結(jié)果也有影響,要認真規(guī)范操作,不可隨意縮短振蕩時間。

    2.點板過程

    酶聯(lián)免疫吸附試驗最主要的試驗操作就是點板,即使用單道移液器或多道移液器向試劑盒的96孔板的U 型孔中添加各種試劑。因此能否正確使用此器具對試驗結(jié)果是否準確至關(guān)重要。怎么保證其正確使用呢?首先,如果條件允許,最好定期找有資質(zhì)的機構(gòu)對其進行檢定或校準,保證其自身質(zhì)量沒問題。如果條件不允許可在使用前使用純水,電子天平,自檢一下使其風(fēng)險可控。其次要會正確使用。其常規(guī)的使用方法為“吸一打二”。其中的“一二”指的是移液器控制按鈕下壓的兩個檔位,下壓遇到阻力時為第1 檔,繼續(xù)加大力度壓至按不動為第2 檔,所謂的“吸一打二”就是指吸取液體的時候,用拇指按住頂端的控制按鈕至第1 檔,而向外釋放液體的時候用拇指按住頂端的控制按鈕至按不動為止。后來又有人提出了“吸二打一”的使用方法。要注意的是實際操作時,如果將移液器調(diào)至一固定量程,需要反復(fù)多吸幾次,只有在第一次吸取時是“吸二打一”,此后再吸再打時均是“吸一打一”。在這里還有一點需要注意,就是“吸二打一”的量程不能超過移液器的最大量程。舉例說明,如果移液器的量程為20~200 微升,如果采用“吸二打一”的吸取方式,最好吸取量不要超過100微升。因此洗板時不能采用“吸二打一”。個人認為無論是“吸一打二”還是“吸二打一”只要操作規(guī)范都可以準確量取。切忌使用過程中吸打動作太快,這樣容易引起吸取液體時,因為有氣泡可能導(dǎo)致液體接觸到移液器的頭部,污染液體,或釋放液體時太快,液體濺到目標U 型孔外面,影響試驗結(jié)果。當(dāng)吸取黏性較大,泡沫較多濃度較小的目標液時如酶標二抗工作液,抗體工作液、低濃度的標準品時可以考慮采用“吸二打一”的操作。當(dāng)吸取黏性較小的目標液體時,如底物A、底物B、動物尿液樣本,可以采用“吸一打二”的操作。因為整個試驗過程不可避免的要使用八道移液器,在此著重說一下八道移液器使用的注意事項。八道移液器使用過程中首先要確定每一個槍頭都安裝到位,擰緊了,其次要保證使用過程中槍頭要垂直懸空于目標微孔之上,盡量不要接觸微孔壁,再次一定要注意使用過程中觀察八個槍頭中的液面高度是否一致,如若差別太大,則證明吸量不準確,就會影響試驗結(jié)果,尤其是量取酶標二抗和抗體工作液以及洗板時要注意。

    3.其他可能影響試驗結(jié)果的方面

    整個檢測試劑盒內(nèi)的試劑,提前包被好抗原或抗體的96孔板,包括處理好的待檢樣品在點板之前一定要回復(fù)至室溫,實踐證明檢測過程中的環(huán)境溫度對結(jié)果影響較大,溫度不宜過低。所有試劑尤其是各個濃度的標準品、酶標二抗、抗體工作液、底物A、底物B 在使用前一定要混勻,混勻動作不可太粗暴,搖晃不可太劇烈,否則會產(chǎn)生大量氣泡,影響結(jié)果。

    整個實驗過程一定要認真按照說明書的要求操作,不能靠記憶去操作。因為雖然原理一樣,但由于不同檢測項目用到的ELISA 有直接ELISA、間接ELISA、競爭ELISA 等區(qū)別,所以在點板過程中會存在一些差異,如酶標二抗和抗體工作液的添加順序,酶標二抗工作液的配制,底物A、底物B 的添加順序添加量,洗板次數(shù),避光反應(yīng)時間長短等。

    三、實驗結(jié)果的計算

    很多酶標儀都帶有自己的計算軟件,但是96孔板的布板模式相對來說比較死板不夠靈活,就是說標準品和樣品的位置相對固定,不可以根據(jù)每一次實驗的實際情況靈活布板。因此,建議用酶標儀只進行吸光度的檢測,得到吸光度后,再利用專業(yè)的計算軟件去計算。

    以上就是我作為一個長期使用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進行獸藥殘留檢測工作的一些經(jīng)驗、教訓(xùn)和體會,以便給使用試劑盒的工作人員提供參考,使大家少走彎路,得到準確的實驗結(jié)果。

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