基于基因片段和形態(tài)特征分析的山西鬼筆屬物種多樣性分析

張澤乾 ，毛 寧 ，劉 虹

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

鬼筆屬Phallus是一類形態(tài)特征獨特、子實體質(zhì)地海綿狀、氣味濃郁的大型真菌，分類上隸屬于傘菌綱（Agaricomycetes）鬼筆亞綱（Phallomycetidas）鬼筆目（Phallales）鬼筆科（Phallaceae）。早期基于形態(tài)特征的分類學(xué)將鬼筆類真菌分為鬼筆屬（Phallus）和竹蓀屬（Dictyophora），區(qū)別在于竹蓀屬孢托組織下沿有一個網(wǎng)格狀裙子?，F(xiàn)在的DNA分子研究顯示，這2 個類群屬于一個系統(tǒng)演化譜系，因此，Dictyophora被認為是Phallus的異名，其中的物種全部轉(zhuǎn)移到鬼筆屬。鬼筆屬包括著名的商業(yè)食用菌品種竹蓀Dictyophoraindusiata(Vent.Pers.)Fisch.，因此受到了廣泛關(guān)注[1-4]。在分子系統(tǒng)研究出現(xiàn)之前，鬼筆屬另外一個常見物種是白鬼筆，廣布于世界各地，中國各地的白鬼筆幾乎全部被鑒定為歐洲的P.impudicusL.，并以此名稱出現(xiàn)在中國早期的所有菌類文獻中[1-4]。然而，最近一項分子數(shù)據(jù)分析研究顯示，中國分布的白鬼筆與歐洲的白鬼筆不是同一個物種，而是一個東亞地區(qū)特有的本土物種，并將其命名為冬蓀Phallus dongsunT.H.Li et al.[5]，以區(qū)別于歐洲本土物種白鬼筆。白鬼筆是一種子實體中大型的珍稀食用真菌，在我國南部常見且已有人工培育產(chǎn)品，商品名稱為白冬蓀，是一種受歡迎的食用菌品種，其營養(yǎng)價值和風(fēng)味口感與著名的竹蓀相同。

鬼筆類真菌多數(shù)可以藥用和食用，在世界范圍內(nèi)各大洲均廣泛分布，我國鬼筆類真菌資源豐富，目前已報道有27 個種，主要分布在西南和華南地區(qū)[2-3]，北方地區(qū)分布較少。自2017 年開始，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院野生菌團隊連續(xù)在山西各地采集調(diào)查大型食用真菌物種多樣性，在多地采到多份鬼筆類真菌樣本，其中一個重要的發(fā)現(xiàn)是在山西南部中條山脈中部和東部區(qū)域發(fā)現(xiàn)2 種大型鬼筆，一種為白色，一種為黃色。白色鬼筆屬于中國常見的白鬼筆（冬蓀鬼筆），黃色樣本顏色類似于黃脈鬼筆Phallus flavocostatusKreisel 和細鬼筆Phallus tenuis（E.Fisch.）Kuntz.[5-6]，但這2 種黃色的鬼筆子實體均為小型，除去顏色外，其他特征都明顯不同。

為明確這種黃色鬼筆以及山西其他鬼筆類樣本的準確分類學(xué)定位，本研究通過采用ITS 和LSU這2 個位點的基因片段進行建樹分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，共鑒定出鬼筆屬3 個物種，其中黃色樣本被鑒定為冬蓀鬼筆的黃色品種，這是黃色冬蓀鬼筆在世界上首次發(fā)現(xiàn)，它的存在和發(fā)現(xiàn)為冬蓀品種的人工馴化培育和育種提供了新的材料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究標本共8 份，其中黃色冬蓀樣本4 份，采集于我國北方山西省中條山脈和呂梁山脈中段關(guān)帝山。其中，中條山脈位于山西省南部，屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，年平均溫度12～14 °C，年降水量600～800 mm，最高點海拔為2 358 m，植被以油松（Pinus tabuliformisCarr.）、華山松（Pinus armandiiFranch.）、多種櫟樹（Quercusspp.）等為建群種的暖溫帶森林為主，局部有亞熱帶小環(huán)境區(qū)域，土壤類型自下而上依次為沖積土、山坡褐土、山地淋溶褐土和山地草甸土。呂梁山脈位于山西省西部大體呈南北走向，中段的關(guān)帝山屬大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫3.5 °C，年降水量830 mm，最高點海拔為2 831 m，土壤類型主要有山地棕壤、山地褐土、亞高山草甸土和洪泛平原草甸土，植被主要有華北落葉松（Larix principis-rupprechtiiMayr.）、云杉（Piceaspp.）、松樹（Pinusspp.）、楊樹（Populusspp.）、樺樹（Betulaspp.）純林或混交林等。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)特征鑒定 在野外采集標本并拍照記錄，然后在40～50 °C 的干燥機中干燥。干燥后的標本保存在首都師范大學(xué)植物標本室（BJTC）和山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院植物標本室（HSA）。從新鮮標本中記錄宏觀特征，標準顏色值依據(jù)ColorHexa（http://www.colorhexa.com/）；將干燥樣本手工切薄片放在含有3%氫氧化鉀、剛果紅、梅爾澤試劑[7]或乳酸棉藍的載玻片上，加蓋玻片在顯微鏡下觀察微觀特征。擔(dān)孢子的尺寸使用“（a-）b-c（-d）”形式的符號表示?！癰-c”范圍至少包含90%的測量值。括號中給出了極值“a”和“d”。Q 為側(cè)視圖中擔(dān)孢子的長寬比；Qav 是指所有擔(dān)孢子的平均值Q，包括樣品標準偏差。

1.2.2 DNA 提取、PCR 擴增和DNA 測序 本研究獲得了ITS 和LSU 區(qū)域的序列。使用NuClean Plant Genomic DNA Kit（中國CWBIO）從山西省新采集的樣本中提取基因組DNA。使用引物ITS1-F/ITS4 擴增ITS 區(qū)域（White et al.1990；Gardes &Bruns 1993）[8-9]，使用引物L(fēng)R0R/LR5（Vilgalys &Hester 1990）[10]擴增28S 大亞基nrDNA（LSU）區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系25 μL：2 μL DNA 模板，上、下引物各1 μL（10 μmol/L），12.5 μL 2×Master Mix，8.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：94 °C 變性5 min；94 °C 30 s，55 °C 45 s（ITS）/60 s（LSU），35 次循環(huán)；72 °C 1 min；72 ℃下延長10 min。將PCR 產(chǎn)物送至北京中科西林生物技術(shù)有限公司進行純化、測序和編輯。驗證合格的DNA 序列保存在GenBank數(shù)據(jù)庫中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），登錄號如表1 所示。

表1 本研究引證的樣本及其GenBank 登錄號Tab.1 Specimens and their GenBank accession numbers in this study

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 基于ITS-nrLSU 數(shù)據(jù)集進行系統(tǒng)發(fā)育分析。ITS 和LSU 序列數(shù)據(jù)包含：本研究從新標本提取測定的序列，一些重要文章先前使用的序列[5]，通過Blast 工具從GenBank 檢索下載的一些相關(guān)序列。編輯ITS 和LSU 序列用于鑒定和研究山西省黃色鬼筆類物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在默認參數(shù)下，每個序列分別在MAFFT v.7.110 中對齊[11]，使用默認參數(shù)的Gblocks v.0.91b 識別對齊不佳的位點[12]，然后將對齊的ITS 和LSU 序列連接起來以進行進一步的系統(tǒng)發(fā)育分析。在進行系統(tǒng)發(fā)育分析之前，排除了所有確定的模糊位點，任氏蛇頭菌Mutinus zenkeri被選作外類群。

使用參數(shù)未鏈接的GTRGAMMAI 替代模型（針對所有分區(qū)），使用RAxML 8.0.14[13-15]進行最大似然（ML）分析。使用快速引導(dǎo)分析搜索最簡約的ML樹，在RAxML 中計算ML 引導(dǎo)重復(fù)次數(shù)（1 000），ML 樹用TreeView 32 生成[16]。自舉值（BS）≥70%的進化分支被認為得到了大力支持[17]；貝葉斯法（BI）使用MrBayes v3.1.2[18]作為評估分支支持的附加方法。在BI 分析中，在選擇由MrModeltest v2.3[19]確定的最佳替代模型GTR+I+G（用于ITS和nrLSU）后，使用默認設(shè)置，對10000000 代馬爾可夫鏈蒙特卡羅（MCMC）進行了2 次四鏈獨立運行，每100 代采樣一次。溫度值降至0.20，老化設(shè)置為0.25，一旦分離頻率的平均標準偏差達到0.01 以下，運行就會自動停止。構(gòu)建70%多數(shù)規(guī)則共識樹，用TreeView 32 生成進化樹[16]，貝葉斯值（BPP）≥95%被認為得到了顯著支持[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子系統(tǒng)發(fā)育

本研究中，新標本自測產(chǎn)生11 條ITS 和LSU序列。ITS-nrLSU 組合數(shù)據(jù)集矩陣包括來自12個分類單元的56條序列（ITS 29條，nrLSU 27條），包含1 445 個堿基（ITS 562 個，LSU 883 個）。本研究引用的相關(guān)分類群中，從山西省采集的所有黃色鬼筆標本都與包含有模式序列的白色冬蓀鬼筆聚為同一個末端分支，并得到了強有力的支持（BS=99%，BPP=1.00）（圖1），Blast 顯示，該末端分支中每個標本的ITS 和LSU 序列的相似性都超過98.8%。結(jié)果表明，山西省采集的所有黃色鬼筆在系統(tǒng)發(fā)育上與白色的冬蓀鬼筆屬于同一個物種。

圖1 基于ITS-nrLSU 序列的鬼筆屬Phallus 系統(tǒng)發(fā)育樹（ML）Fig.1 Phylogenetic tree of Phallus based on ITS-nrLSU sequences（ML）

2.2 形態(tài)分類結(jié)果

2.2.1 冬蓀鬼筆Phallus dongsunT.H.Li，T.Li，Chun Y.Deng，W.Q.Deng &Zhu L.Yang，in Li，Li，Deng，Song，Deng &Yang，Phytotaxa443（1）：29（2020）

2.2.1.1 黃色品種形態(tài)特征 菌蛋近球形到卵圓形，50～70 mm×45～65 mm，灰白色頭淺灰色，表面光滑，基部有白色菌索與土壤相聯(lián)。外包被膜質(zhì)，內(nèi)包被膠質(zhì)，無色。成熟子實體高145～250 mm，直徑30～50 mm。孢托鐘形到近圓錐形，淡黃色、黃色到橙黃色，長45～65 mm，直徑30～48 mm，表面不規(guī)則深網(wǎng)格狀，網(wǎng)眼深4～7 mm，頂部鈍圓或平截，具一個3～5 mm 的橢圓或近圓形小孔，初期被綠色產(chǎn)孢組織完全覆蓋。產(chǎn)孢組織橄欖綠色，黏。假柄柱狀或棒狀，通常向頂部漸細、向基部變粗，長150～200 mm，粗40～60 mm，淡黃色或黃色，海綿質(zhì)，中空，壁厚5～8 mm，表面具直徑1～3 mm 的不規(guī)則小腔。菌托卵圓形，高40～55 mm，直徑30～40 mm，表面平滑或微皺，灰白色偶然淺灰色。菌索白色，直徑1～2 mm，長可達50 mm（圖2、3）。氣味惡臭，味道沒有記錄。

圖2 黃色冬蓀鬼筆的擔(dān)子果Fig.2 Basidiomata of yellow Phallus dongsun

圖3 山西黃色冬蓀鬼筆的顯微鏡特征Fig.3 Microscopic characteristics of yellow Phallus dongsun

擔(dān)孢子長橢圓形或稍呈圓柱狀，4.4～5.2 μm×1.9～2.5 μm，Q=1.92～2.27，Qm=2.12，無色，非淀粉質(zhì)，薄壁，光滑，內(nèi)含一個油滴。孢托組織由膨大的菌絲和間雜的球形或不規(guī)則球形的細胞組成，薄壁，無色，直徑5.0～7.5 μm。假柄擬薄壁組織型，細胞球形或近球形，直徑10～25 μm。菌托菌絲直徑3.0～7.5 μm，分隔，薄壁，具鎖狀聯(lián)合。菌索菌絲直徑3.0～11.0 μm，薄壁，分隔，含分枝，具鎖狀聯(lián)合。

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，松樹（Pinusspp.）、櫟樹（Quercussp.）或楊樹（Populussp.）純林或混交林下地上。已知分布于我國山西省。

標本：山西省方山縣麻地會鄉(xiāng)關(guān)帝山，楊樹Populussp.林地上，2018年8月31日，曹晉忠，LH329（HSA329）；翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2018 年9 月10 日，劉虹，LH511（HSA511）；翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2019 年8 月26 日，劉虹，LH1409（BJTC FM1546）；夏縣泗交鎮(zhèn)櫟樹Quercussp.林地上，2020 年10 月6 日，毛寧，MN083（FANM1607 BJTC）。

2.2.1.2 白色品種特征 菌蛋近球形到卵圓形，45～75 mm×42～68 mm，污白色、白色、灰白色頭淺灰色，表面光滑，基部有白色菌索與土壤相聯(lián)。外包被膜質(zhì)，內(nèi)包被膠質(zhì)，無色。成熟子實體高140～260 mm，直徑35～50 mm。孢托鐘形到近圓錐形，白色，長43～67 mm，直徑32～46 mm，表面不規(guī)則深網(wǎng)格狀，網(wǎng)眼深4～6 mm，頂部鈍圓或平截，具一個3～5 mm 的橢圓或近圓形小孔，初期被綠色產(chǎn)孢組織完全覆蓋。產(chǎn)孢組織橄欖綠色，黏。假柄柱狀或棒狀，通常向頂部漸細、向基部變粗，長150～220 mm，粗41～63 mm，白色，海綿質(zhì)，中空，壁厚5～8 mm，表面具直徑1～3 mm 的不規(guī)則小腔。菌托卵圓形，高41～55 mm，直徑32～41 mm，表面平滑或微皺，灰白色偶然淺灰色。菌索白色，直徑1～2 mm，長可達55 mm（圖4）。氣味惡臭，味道沒有記錄。

擔(dān)孢子長橢圓形或稍呈圓柱狀，4.0～5.5 μm×1.8～2.5 μm，無色，非淀粉質(zhì)，薄壁，光滑，內(nèi)含一個油滴。孢托組織由膨大的菌絲和間雜的球形或不規(guī)則球形的細胞組成，薄壁，無色，直徑5.0～7.5 μm。假柄擬薄壁組織型，細胞球形或近球形，直徑10～25 μm。菌托菌絲直徑3.0～7.5 μm，分隔，薄壁，具鎖狀聯(lián)合。菌索菌絲直徑3.0～10 μm，薄壁，分隔，含分枝，具鎖狀聯(lián)合。

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，多種針葉林或闊葉林純林或混交林下地上。已知分布于我國南北各地。冬蓀鬼筆白色品種形態(tài)特征和黃色品種區(qū)別為孢托和假柄為白色。

標本：山西省翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2018 年9 月10 日，劉虹，LH504（HSA504）；翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2019 年9 月10 日，劉虹，LH444（HSA444）。

2.2.2 紅鬼筆Phallus rugulosus（E.Fisch.）Lloyd，Mycol.Writ.（Cincinnati）2（Letter 31）∶402（1908）菌蛋卵圓形或蛋形，白色或灰白色，基部具白色或灰白色根狀菌索。成熟后菌蛋頂部破裂，孢托組織由假柄支撐伸出，總高100～210 mm，直徑20～30 mm。孢托鐘形或圓錐形，紅色，高15～39 mm，直徑10～20 mm，頂部有一小孔，表面被有橄欖色孢子黏液。假柄圓柱狀，海綿質(zhì)，長60～130 mm，直徑10～20 mm，上部淺紅色，向下漸成白色或灰白色，表面有蜂窩狀小孔。菌托包狀或袋狀。氣味惡臭。擔(dān)孢子橢圓形，無色，3.5～4.5 μm×1.5～2.0 μm（圖5）。

圖5 紅鬼筆的擔(dān)子果Fig.5 Basidiomata of Phallus rugulosus

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，多種林下地上。已知分布于我國南北各地。

標本：山西省沁水縣土沃鄉(xiāng)上沃泉村，楊樹Populussp.林地上，2018年9 月10 日，劉虹，LH1188（BJTC FANM1132）。

2.2.3 超短裙鬼筆Phallus ultraduplicatusX.D.Yu，W.Lv，S.X.Lv，Xu H.Chen &Qin Wang，in Adam?ík et al.，Cryptog.Mycol.36（2）：147（2015）菌蛋近球形，白色或灰白色，65～80 mm×70～80 mm，基部具白色或灰白色根狀菌索。成熟后菌蛋頂部破裂，孢托組織由假柄支撐伸出，總高150～230 mm。孢托鐘形或圓錐形，白色或黃白色，高35～50 mm，直徑20～30 mm，頂部有一小孔，深網(wǎng)格狀，表面被有橄欖色孢子黏液。菌裙白色，長20～40 mm，海綿質(zhì)，具多角形網(wǎng)眼。假柄圓柱狀，海綿質(zhì)，長100～190 mm，直徑20～35 mm，白色或淺黃白色，表面有蜂窩狀小孔。菌托包狀或袋狀。氣味惡臭。擔(dān)孢子橢圓形，無色，4.0～5.1 μm×1.5～2.0 μm（圖6）。

圖6 超短裙鬼筆的擔(dān)子果Fig.6 Basidiomata of Phallus ultraduplicatus

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，針葉林下地上。已知分布于山西和中國北部地區(qū)。

標本：山西省交城縣關(guān)帝山龐泉溝，云杉Piceasp.林地上，2018年8月31日，劉虹，LH314和LH315；興縣黑茶山，油松Pinus tabulifornis林地上，2018 年9 月6 日，李素玲，LH376。

3 結(jié)論與討論

冬蓀鬼筆在我國南部貴州、云南地區(qū)是一種常被當?shù)厝瞬杉秤?，并已被人工培育的食用蘑菇物種[5]。本研究基于ITS 和LSU 聯(lián)合分析證實，山西分布的大型黃色鬼筆在分類學(xué)上屬于冬蓀鬼筆Phallus dongsun，盡管它的子實體顏色與典型的冬蓀鬼筆有所不同。同一物種具有不同顏色的現(xiàn)象在大型菌類中并不罕見，如生長在落葉松林下的厚環(huán)乳牛肝Suillus grevillei（Klotzsch）Singer 典型的子實體顏色為紅褐色，但是黃色的類型并不罕見[21]，再如白灰乳菇Lactarius albidocinereus子實體有白色和灰色2 種類型[22]，作者在山西多年采集發(fā)現(xiàn)這個物種的2 種顏色個體在山西均有發(fā)生，其中灰色子實體的品種在山西南部更為多見。

本研究共發(fā)現(xiàn)有3個鬼筆屬Phallus物種在山西的分布得到了數(shù)據(jù)支持，即冬蓀鬼筆P.dongsun（包括白色和黃色2 個類型）、紅鬼筆P.rugulosus和超短裙鬼筆（超短裙竹蓀）P.ultraduplicatus。其中，冬蓀鬼筆的白色類型僅見于山西南部的中條山脈，黃色的類型除中條山外，還在呂梁山脈中北部的關(guān)帝山楊樹林下有分布。紅鬼筆見于中條山脈東段的歷山區(qū)域，而超短裙鬼筆分布于呂梁山脈的關(guān)帝山和黑茶山的云杉Piceasp.和油松林下。本研究是首次在自然界發(fā)現(xiàn)冬蓀鬼筆有野生黃色品種存在，這對冬蓀鬼筆的人工培育和育種增加了新的選擇。食用黃冬蓀野生馴化、生物學(xué)特性及其栽培條件是否與白色冬蓀一致，還有待于進一步探索研究。