保和消積方體外對胃癌細胞增殖和遷移的影響及其機制研究

徐春麗 張曉陽 顧宏偉 高建忠

(1 南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院,南京,210014; 2 山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院,太原,030013)

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一,我國是胃癌高發(fā)國家,發(fā)病率和死亡率均約占全球的50%[1]。目前胃癌的治療主要以手術聯(lián)合化療為主,根治性手術可以切除原發(fā)病灶,但在術后有較高的復發(fā)轉移率,且大多數(shù)患者確診時已屬晚期,失去手術機會;術后輔助放化療,可控制微轉移病灶,但會出現(xiàn)嚴重的不良反應和耐藥性,而中醫(yī)藥在抑制胃癌、減輕化療不良反應方面具有一定的優(yōu)勢[2],因此,尋求有效的中醫(yī)藥治療成為目前研究的熱點。

基于此,在當代醫(yī)家主張的病因病機的基礎上,高建忠教授以保和消積方治療胃癌,經(jīng)多年臨床實踐驗證,療效良好。保和消積方能取得良好的臨床療效得益于該方以保和丸為底方,所加藥物(三棱、莪術、白花蛇舌草)更能消癌散結。該方重用焦山楂消食化積;二陳湯主治痰濕;白花蛇舌草清熱解毒,消癰散結[3];三棱、莪術相須而用,破血行氣,消積止痛,增強破血消瘤止痛之功[4]。但目前關于保和消積方對胃癌細胞增殖、遷移的影響及其可能的作用機制研究較少。

微血管形成與胃癌細胞生長與轉移存在密切關系,血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)為促血管生長因子,能誘導新生血管形成[5],還有磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)信號通路與惡性腫瘤的相關性成為研究熱點,PI3K-AKT-mTOR信號通路與胃癌密切相關[6],該信號通路激活可維持細胞存活,是腫瘤細胞抵抗凋亡的重要機制之一[7],但關于其在保和消積方治療胃癌中的作用少見報道。本研究將通過觀察保和消積方對體外胃癌SGC-7901細胞株生長增殖、凋亡及轉移能力的影響,并通過觀察保和消積方對胃癌SGC-7901細胞微管生成和血管內皮生長因子的影響,探討保和消積方抑制胃癌細胞的效果,并基于PI3K-AKT-mTOR信號轉導通路分析其作用機制,為胃癌的治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 胃癌SGC-7901細胞株購自璟源生物科技有限公司(批號：C6795),培養(yǎng)于添加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS,Thermo Fisher Scientifc公司,美國,批號：SH30084.02)、100 U/mL青霉素(河南仟德藥業(yè)有限公司,批號：130437-201707)和鏈霉素(深圳市貝爾醫(yī)藥科技有限公司,批號：130308-201514)的RPMI-1640培養(yǎng)液中,并置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),用含乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化傳代種板,放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.1.2 藥物 保和消積方中藥購自南京中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房(批號：684339),保和消積方的配方為：焦山楂30 g、姜半夏9 g、陳皮9 g、茯苓9 g、三棱9 g、莪術9 g、白花蛇舌草30 g。加水浸泡30 min,煎成60 mg/L的濃縮浸膏,濾網(wǎng)過濾除菌后,分裝放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液(Corning公司,美國,批號：WH0021F221),p-PI3K(貨號：20583-1-AP)、p-AKT(貨號：60203-2-lg)、p-mTOR(貨號：20657-1-AP)抗體購自美國Proteintech公司,噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide,MTT]細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,批號：BJ-S963550),膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號：C1062M),PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(Takara公司,日本,批號：RR037Q),ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,批號：Q311-02)。CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司,美國,批號：320),倒置光學顯微鏡多功能酶標儀(Molecular Devices公司,美國型號：Molecular Devices SpectraMax M3),全自動高速流式細胞儀(BD公司,美國,型號：BD FACSCalibur),高速離心機(Hettich公司,德國,型號：MIKRO220R),生物安全柜(AIRTECH公司,型號：BSC-1004IIA2),細胞計數(shù)儀(Inno-Alliance Biotech公司,美國,型號：Countstar IC 1000)。

1.2 方法

1.2.1 分組 根據(jù)保和消積方的關鍵成分三棱、莪術實驗計量濃度[8],設置不同質量濃度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消積方稀釋液組作為觀察組,同時另設空白對照組不做藥物處理。

1.2.2 給藥方法 收集處于對數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細胞,經(jīng)胰酶消化后進行細胞計數(shù),根據(jù)不同實驗內容調整細胞濃度,種板至相應孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日,向各孔中加入不同質量濃度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消積方稀釋液,另設空白對照組,根據(jù)下述實驗需要分別孵育24 h,48 h及72 h。孵育完成后,根據(jù)后續(xù)試驗要求進行檢測。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 細胞MTT試驗 收集處于對數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細胞,細胞計數(shù),調整細胞濃度,使用96孔板進行實驗,每孔加入100 μL細胞懸液,細胞濃度約為2 000個/孔。于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育,過夜培養(yǎng),待細胞貼壁后,根據(jù)健脾養(yǎng)胃方的關鍵成分三棱、莪術實驗計量濃度[8],設置加入不同質量濃度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消積方稀釋液,另設空白對照組,孵育后,在倒置顯微鏡下觀察。然后,每孔加入10 μL MTT溶液(質量濃度為5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄掉上清液,加入150 μL二甲基亞砜(Methyl Sulfoxide,DMSO),置于搖床上振蕩10 min,使結晶物充分溶解。分別在24 h、48 h、72 h在酶聯(lián)免疫檢測儀上于570 nm處測量各孔的吸光度。

細胞生長抑制率=(1-觀察組吸光度/空白對照組吸光度)×100%。

1.2.3.2 細胞Transwell遷移試驗 實驗前至少2 h,用培養(yǎng)液完全浸泡Transwell上下室。提前饑餓細胞12 h,去除血清影響;消化細胞,中止消化后離心棄去培養(yǎng)液;磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗2次,以充分去除血清;用含牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)的無血清培養(yǎng)基重懸細胞,調整細胞密度至5×105個/mL。取細胞懸液100 μL加入Transwell小室。24孔板下室加入500 μL含20%FBS的培養(yǎng)基,注意：下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進培養(yǎng)板,培養(yǎng)12～24 h,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,PBS洗2次,甲醇固定30 min,將小室適當風干,0.1%結晶紫染色20 min,PBS洗3次,倒置顯微鏡下隨機4個視野觀察細胞、記數(shù)和拍照。

1.2.3.3 細胞凋亡的流式細胞術檢測 取對數(shù)生長期的胃癌SGC-7901細胞,接種到6孔板(5×105個/孔),每孔2 mL培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,加入不同質量濃度的保和消積方稀釋液處理細胞,培養(yǎng)48 h后收集各組細胞,把細胞培養(yǎng)液吸出至1個合適的離心管內,PBS洗滌貼壁細胞1次,加入適量胰酶細胞消化液(無EDTA)消化細胞。1 000×g,離心5 min,棄上清液,收集細胞,用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù),1 000×g,離心5 min,棄上清液,調整細胞濃度至1×106個/mL,加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,加入10 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻,室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min,孵育過程中重懸細胞2～3次以增強染色效果,隨后置于冰浴中,使用鋁箔進行避光。立即上機用流式細胞儀檢測,Annexin V-FITC為綠色熒光,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色為紅色熒光。

1.2.3.4 定量PCR檢測AKT、mTOR、PI3K、VEGF的mRNA表達 各組細胞處理24 h,TRIzol法提取總mRNA,用焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate,DEPC)水溶解總mRNA。然后按照逆轉錄試劑盒說明書操作,依次經(jīng)過去除基因組DNA反應、逆轉錄反應和實時熒光定量PCR,擴增程序為預變性：95 ℃、10 min。擴增：95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。用2-△△Ct法計算目的基因AKT、mTOR、PI3K、VEGF的mRNA含量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3.5 微管形成試驗 實驗前將無菌槍頭、無菌EP管提前放入4 ℃冰箱預冷;從-20 ℃冰箱中取出Matragel基質膠提前4 ℃解凍,與無血清培養(yǎng)基按照1∶1比例稀釋;在冰上鋪膠,每孔加入200 μL Matragel基質膠,避免產(chǎn)生氣泡;鋪膠后將48孔板在4 ℃冰箱內放置10 min,在培養(yǎng)箱中孵育30 min,使之成為小管形成培養(yǎng)基,將SGC-7901細胞消化、離心后,取SGC-7901細胞上清重懸細胞;然后每孔加入200 μL細胞懸液,在恒溫CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后,在倒置顯微鏡下觀察微管形成結果。每組設3個副孔,實驗重復3次;在100倍顯微鏡下隨機選取5個視野拍照,并計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.3.6 蛋白質免疫印跡法檢測蛋白表達水平 提取經(jīng)含有不同濃度(0、0.5、1、2、4、8、12、16 mg/L)保和消積方處理的SGC-7901細胞,24 h后收集SGC-7901細胞并用放射免疫沉淀(Radio-Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液冰上裂解30 min,離心30 min(8 000×g,4 ℃),取上清液獲得蛋白樣品,用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)定量試劑盒定量并計算蛋白的含量。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質,用半干轉膜儀進行轉膜。轉膜結束后,使用一抗快速封閉液封閉30 min,一抗的比例分別為p-PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000),用聚對苯二甲酸丁二酯(Poly Butylene Terephthalate,PBT)洗膜3次,放置4 ℃孵育過夜,PBT洗膜3次,放入二抗中室溫下孵育1 h,用PBT洗膜3次,加入超敏化學發(fā)光(Efficient Chemiluminescence,ECL)發(fā)光顯色,浸潤聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)為內參。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有實驗重復3次,組間兩兩比較采用Duncan法比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 保和消積方對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響 細胞MTT法分析結果表明,隨著保和消積方質量濃度的增加,SGC-7901細胞的增殖抑制率呈現(xiàn)線性增加,當保和消積方質量濃度為16 mg/mL時,藥物對SGC-7901細胞的抑制率接近100%,達到閾值。在同一濃度下,隨著藥物處理時間的延長,保和消積方對SGC-7901細胞的增殖抑制率增加。與空白對照組比較,保和消積方分別在同一時間下各觀察組的SGC-7901細胞增殖抑制率均呈現(xiàn)極顯著升高(均P<0.01)。見圖1。

圖1 不同保和消積方對SGC-7901細胞增殖的抑制作用

2.2 保和消積方對胃癌細胞SGC-7901遷移的影響 細胞Transwell遷移試驗結果顯示,與空白對照組比較,隨著保和消積方質量濃度的增加,SGC-7901細胞遷移的細胞數(shù)量顯著減少(均P<0.05)。見圖2～3。

圖2 不同濃度保和消積方對胃癌SGC-7901細胞遷移的抑制作用

圖3 各組胃癌SGC-7901細胞穿膜細胞數(shù)

2.3 保和消積方對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響 流式細胞術檢測SGC-7901細胞凋亡結果顯示,與空白對照組比較,保和消積方處理組的SGC-7901細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均有所增加,且隨著保和消積方質量濃度的增加而增加,當保和消積方質量濃度為12 mg/mL時,早期的凋亡率最高,達到23.66%;當保和消積方質量濃度為16 mg/mL時,晚期的凋亡率最高,達到54.74%。見圖4。

2.4 保和消積方對胃癌細胞SGC-7901的AKT、mTOR、PI3K、VEGFmRNA表達的影響 與空白對照組比較,隨著保和消積方濃度的增加,SGC-7901細胞中mTOR、PI3K、VEGFmRNA含量均呈現(xiàn)下降趨勢,AKT mRNA含量先降后升,整體呈現(xiàn)下降趨勢,當保和消積方質量濃度≥1 mg/mL時AKT含量顯著下降(P<0.05),其中4 mg/mL組的AKT mRNA表達量最低;當保和消積方質量濃度≥0.5 mg/mL時mTOR含量顯著下降(P<0.05),其中16 mg/mL組的mTOR mRNA表達量最低;當保和消積方質量濃度≥2 mg/mL時PI3K含量顯著下降(P<0.05),其中16 mg/mL組的PI3K mRNA表達量最低;當保和消積方質量濃度≥1 mg/mL時VEGF含量顯著下降(P<0.05),其中16 mg/mL組的VEGF mRNA表達量最低。見圖5。

圖5 保和消積方對SGC-7901細胞AKT、mTOR、PI3K、VEGF的qPCR表達

2.5 不同濃度保和消積方對SGC7901細胞PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路的影響 與空白對照組比較,不同濃度保和消積方(1～16 mg/mL)的胃癌SGC-7901細胞p-AKT、p-mTOR、p-PI3K和VEGF蛋白表達水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),并呈現(xiàn)濃度相關性。見表2。

表2 不同濃度保和消積方對SGC7901細胞PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路的影響

2.6 保和消積方對胃癌SGC-7901細胞微管形成的影響 空白對照組的SGC-7901細胞在Matrigel膠上已形成良好的管樣結構,添加不同濃度的保和消積方后,SGC-7901細胞管樣結構均受到破壞,隨著保和消積方濃度的增加,SGC-7901細胞管樣結構越來越少。見圖6。與空白對照組比較,保和消積方質量濃度1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL、16 mg/mL管樣結構數(shù)目均顯著減少(均P<0.01),當保和消積方質量濃度為16 mg/mL時,細胞管樣結構數(shù)目下降最多,下降85.71%。見圖7。

圖6 不同濃度保和消積方對胃癌SGC-7901細胞微管形成的抑制作用(多聚甲醛固定,×200)

圖7 不同濃度保和消積方對胃癌細胞SGC-7901微管生成數(shù)量的影響

3 討論

中醫(yī)治療胃癌,當代醫(yī)家多從脾胃虛等致病因素著手,為腫瘤的中醫(yī)藥防治作出了巨大的貢獻。劉沈林教授多年來致力于消化道腫瘤的臨床研究與科研工作,他治療胃癌的經(jīng)驗方組成為：炙黃芪、黨參、炒白術、當歸、白芍、半夏、陳皮、三棱、莪術、白花蛇舌草、炙甘草[9]。保和消積方即為該治法指導下的臨床常用處方,功用健脾益氣,理氣和胃,臨床可顯著改善胃癌患者的生命質量,降低腫瘤標志物水平,延緩胃癌的復發(fā)和轉移[10-11]。

有研究表明中藥可以從抗血管生成方面發(fā)揮獨特的防治胃癌的作用[8]。自從Folkman提出假說,腫瘤生長和轉移依賴血管生成,阻斷血管生成是腫瘤的治療策略,到如今,這個觀點已得到廣泛認可并持續(xù)成為腫瘤研究的熱點。在胃癌組織中PI3K/AKT/mTOR信號轉導通路上關鍵基因存在異常表達,同時該信號通路異常激活與腫瘤分化、淋巴結轉移及預后密切相關,但從阻斷血管生成和PI3K/AKT/mTOR信號通路兩方面來研究胃癌的報道較少。本研究采用保和消積方體外培養(yǎng)的胃癌SGC7901細胞,觀察到保和消積方不僅可通過阻斷血管生成,也可以通過PI3K-AKT-mTOR通路影響胃癌SGC7901細胞的增殖、凋亡。

胃癌細胞具有很強的增殖、侵襲和遷移能力[12]。研究報道,保和消積方中多個單味中藥均有抗腫瘤的功效,陳皮的現(xiàn)代藥理學研究表明陳皮中的陳皮多甲氧基黃酮、川陳皮素具有顯著的抗腫瘤效果,半夏提取物對肉瘤、宮頸癌、肝癌等體外實驗均有抑制作用,臨床報道半夏在胃癌中也可取得比較好的療效[13-14]。張瑩等[15]發(fā)現(xiàn),三棱-莪術組方通過降低SGC-7901細胞移植瘤裸鼠血清環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、VEGF和重組人堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的水平從而達到抑制SGC-7901移植瘤生長的作用。HAO等[16]證實茯苓可以有效地抑制AKT的磷酸化(Thr308),并通過AKT介導的信號轉導通路抑制胃癌SGC-7901細胞增殖侵襲和促進其凋亡;另有研究報道,白花蛇舌草在腫瘤治療中具有更好的效果,可降低患者的血清腫瘤標志物水平[17]。本研究結果顯示,保和消積方可以抑制胃癌細胞系體外的增殖,且對細胞的抑制作用呈現(xiàn)時間相關性和濃度相關性,進一步利用流式細胞儀檢測胃癌SGC-7901細胞的凋亡率,結果表明不同濃度保和消積方的胃癌細胞凋亡率均顯著高于空白對照組,揭示保和消積方抑制細胞分裂,促進其凋亡,并且其可能通過誘導細胞凋亡從而抑制細胞增殖。

PI3K-AKT-mTOR信號通路參與調控胃癌細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學功能[18],為了進一步探討保和消積方對胃癌細胞增殖、凋亡的作用機制,本研究觀察了PI3K-AKT-mTOR信號通路在其中的作用。機體在失調的狀態(tài)下,PI3K會集中到細胞膜,促進AKT蛋白磷酸化而活化,進一步激活下游mTOR,激活的AKT和mTOR通過多種途徑促進癌細胞生存,抑制凋亡的發(fā)生[19]。相關研究也報道了PI3K-AKT-mTOR通路可促進前列腺癌細胞增殖、轉移,并誘導癌細胞凋亡[6,20]。另外,通過靶向治療可抑制癌細胞中PI3K-AKT-mTOR信號通路及癌細胞增殖[21]。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度保和消積方均顯著降低了PI3K-AKT-mTOR的mRNA和蛋白表達水平,濃度越高表達量越低,揭示保和消積方通過抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化表達,抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路,從而誘導SGC-7901細胞凋亡,進而抑制細胞增殖。

另有研究已被證實VEGF是胃癌細胞中重要的促血管生成因子[22],它能誘導內皮細胞的增殖與遷移,誘導細胞脈管形成。陳海姣等[23]發(fā)現(xiàn)巴佛洛霉素A1能夠通過抑制空泡型ATP酶(Vacuolar-type ATPase,V-ATPase)的活性來抑制胃癌SGC-7901細胞VEGF的表達和新生血管的形成,進而抑制腫瘤細胞的增殖與遷移。研究證實,健脾養(yǎng)胃方能夠下調VEGF mRNA水平及蛋白表達,從而抑制胃癌細胞的血管生成,進而抑制胃癌細胞的增殖與遷移[24]。本研究中保和消積方能夠抑制胃癌細胞SGC-7901細胞微管的形成，不僅細胞管樣結構的數(shù)量顯著降低，其血管生成相關基因VEGF表達水平也有顯著降低，進一步檢測細胞的Transwell遷移能力，發(fā)現(xiàn)細胞的遷移能力明顯降低，提示了保和消積方可以通過降低胃癌細胞SGC-7901細胞VEGFmRNA的表達量，進而抑制胃癌細胞血管生成和遷移。

綜上所述,保和消積方通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路激活,進而抑制了細胞SGC7901增殖,從而誘導胃癌細胞的凋亡,同時下調了VEGFmRNA的表達,降低胃癌細胞血管生成,進而抑制了、胃癌細胞的增殖與遷移。本研究只是初步探索了保和消積方對胃癌細胞SGC7901細胞有明顯的抑制增殖、遷移、血管生成作用,但其具體的調控機制有待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明,不存在與工作責任相沖突的任何經(jīng)濟和非經(jīng)濟利益,保證該研究的獨立性和科學性。