上皮性卵巢癌組織中FoxM1的表達及其臨床意義

覃熙媛，朱 瑩，李偉滔，鄭曉玲，梁遠秋

（南方醫(yī)科大學第十附屬醫(yī)院/東莞市人民醫(yī)院病理科，廣東 東莞 523058）

上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌類型，因極容易發(fā)生盆腔及腹腔內廣泛播散轉移，上皮性卵巢癌死亡率一直處于惡性婦科腫瘤前列[1]。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）已被證實在上皮源性惡性腫瘤細胞侵襲和轉移中具有重要作用，上皮細胞EMT 過程受到多種基因轉錄和翻譯水平的調節(jié)[2]。叉頭框轉錄因子M1（forkhead box M1，F(xiàn)oxM1）是叉頭框轉錄因子家族成員之一，在細胞周期調控和維持染色體穩(wěn)定中具有重要作用，是調控細胞增殖、凋亡的重要因子。已有研究發(fā)現(xiàn)FoxM1 在多種惡性腫瘤發(fā)生、進展以及侵襲和轉移中具有明顯的促進作用[3]，F(xiàn)oxM1 高表達能夠明顯促進鼻咽癌[4]、非小細胞肺癌[5]細胞增殖和EMT。但FoxM1 在上皮性卵巢癌EMT過程中的作用尚無相關報道，故本研究以上皮性卵巢癌、卵巢交界性腫瘤患者作為研究對象，探討了卵巢腫瘤組織中FoxM1的表達與患者病理指標和EMT兩個關鍵標志物——E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2018年1月—2020年12月東莞市人民醫(yī)院收治并手術切除的上皮性卵巢癌石蠟存檔標本41例，其中，高級別漿液性癌22例、低級別漿液性癌5例、透明細胞癌7 例、黏液性癌5 例、內膜樣癌2 例；年齡23～78 歲，中位年齡51 歲；臨床分期：采用FIGO 分期，I～II 期23 例、III～IV 期18 例；有脈管瘤栓6 例；淋巴結轉移9 例。納入標準：①經(jīng)手術切除組織病理學診斷為上皮性卵巢癌；②術前未接受放療、化療、免疫治療等相關治療；③臨床資料完整。排除合并其他惡性腫瘤者。并收集同期卵巢交界性腫瘤石蠟存檔標本17 例，其中交界性漿液性腫瘤12 例、交界性黏液性腫瘤5 例；年齡24～58 歲，中位年齡43 歲。選擇同期行子宮肌瘤手術患者的正常卵巢組織20例作為對照，年齡54～79歲，中位年齡62.5歲。

1.2 試劑與儀器

鼠抗人FoxM1 單克隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗人E-cadherin、鼠抗人vimentin 單克隆抗體、免疫組織化學試劑盒及DAB染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BX41型光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方 法

1.3.1 資料收集收集患者年齡、腫瘤組織大小、病理分期、組織學分型、有無脈管瘤栓、有無淋巴結轉移等資料。本研究經(jīng)東莞市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過（KYKT2020-052）。

1.3.2 免疫組化檢測組織中FoxM1、E-cadherin、vimentin 蛋白表達將手術切除組織進行石蠟包埋后切成3 μm厚度薄片，采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶免疫組化染色法（S-P）檢測相應組織中FoxM1、Ecadherin和vimentin蛋白表達，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。分別以已知FoxM1、E-cadherin和vimentin 陽性的卵巢癌樣本作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.3 免疫組化結果判讀將細胞特定位置呈淺黃色至棕黃色的細小顆粒視為陽性，其中FoxM1定位于細胞核中，E-cadherin 蛋白主要表達在細胞膜和細胞質中，vimentin 蛋白主要表達在細胞質中。陽性表達的分級采用兼顧陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比的判斷標準，選取5 個400 倍視野，當陽性細胞比例≤10%者評定為0分，＞10%～25%者評定1分，＞25%～50%者評定為2分，＞50%～75%者評定為3分，＞75%者評定為4 分；不顯色或顯色模糊者評定為0 分，淺黃色者評定為1 分，棕黃色者評定為2 分，棕褐色者評定為3 分。陽性細胞數(shù)結果與染色強度結果相乘即得最終的染色總分。FoxM1 與E-cadherin 的染色總分≥4分時為高表達，＜4分時為低表達[6-8]。vimentin的染色總分≥2分時為高表達，＜2分為低表達[9]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件對本研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理和分析。計數(shù)資料表示為例數(shù)（百分比），組間比較進行卡方檢驗；等級資料多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗進行比較，兩組間采用Mann-Whitney 檢驗進行比較，采用Spearman 分析FOXM1、E-cadherin 和vimentin 蛋白表達水平的相關性，并采用四格表關聯(lián)分析計算Phi 系數(shù)（φ）進行檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 上皮性卵巢癌組織、卵巢交界性腫瘤及正常卵巢組織中FoxM1蛋白表達情況

上皮性卵巢癌組織中FoxM1 蛋白陽性表達率為95.12%，其中高表達的有21例，占全部卵巢癌組織的51.22%；卵巢交界性腫瘤中FoxM1蛋白陽性表達率為58.82%，其中高表達的有1 例，占全部卵巢交界性腫瘤組織的5.88%；FoxM1 蛋白在正常卵巢組織中無陽性表達，統(tǒng)計結果見表1。

表1 上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織中FoxM1蛋白表達情況[例數(shù)（百分率）]

卵巢癌組織中FoxM1蛋白陽性表達率和高表達率均顯著高于卵巢交界性腫瘤組織和正常卵巢組織（P＜0.05），卵巢交界性腫瘤組織中FoxM1蛋白的陽性表達率顯著高于正常卵巢組織（P＜0.05），分析結果見表2。

表2 上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織中FoxM1蛋白表達情況比較

2.2 上皮性卵巢癌組織、卵巢交界性腫瘤及正常卵巢組織中E-cadherin和vimentin蛋白表達情況

上皮性卵巢癌組織中E-cadherin 和vimentin 蛋白陽性表達率分別為82.93%和70.73%，其中高表達分別有22 例和19 例，分別占全部卵巢癌組織53.66%和46.34%。卵巢交界性腫瘤組織中E-cadherin 和vimentin 蛋白陽性表達率分別為100.00%和41.18%，其中高表達分別有13例和4例，分別占全部卵巢交界性腫瘤組織的76.47%和23.53%。正常卵巢組織除少許易脫落的表面上皮外，其余大部分為間質細胞，E-cadherin 和vimentin 在間質中陽性表達率分別為25.00%和80.00%，統(tǒng)計結果見表3。FoxM1、Ecadherin、vimentin 蛋白在多種卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織中的表達情況見圖1。

圖1 FoxM1、E-cadherin、vimentin蛋白在多種卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織中的表達（×200）

表3 上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織中E-cadherin和vimentin蛋白表達情況[例數(shù)（百分率）]

2.3 FoxM1蛋白在上皮性卵巢癌組織中表達的特征

本研究發(fā)現(xiàn)FoxM1蛋白在卵巢透明細胞癌組織中表達具有明顯的異質性。在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)低表達，在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)高表達。免疫組化染色結果見圖2。

圖2 FoxM1蛋白在透明細胞癌中表達存在瘤內異質性

2.4 卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin 和vimentin蛋白表達情況與患者臨床病理指標的關系

卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin和vimentin蛋白表達情況與患者臨床分期（χ2=4.630，P=0.031）、有無淋巴結轉移（χ2=6.549，P=0.01）有關，而與年齡（χ2=1.205，P=0.272）、腫瘤大?。é?=1.101，P=0.294）、有無 脈 管 瘤 栓（χ2=0.176，P=0.675）、組 織 學 分 型（χ2=4.847，P=0.183）、兩級分級（χ2=1.093，P=0.296）無明顯相關。臨床分期III～IV 期、有淋巴結轉移患者卵巢癌組織中FoxM1、vimentin 蛋白高表達率分別顯著高于I～II 期、無淋巴結轉移患者，而E-cadherin 高表達率則顯著低于I～II 期、無淋巴結轉移患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。分析結果見表4。

表4 上皮性卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin和vimentin蛋白表達情況與臨床病理指標的關系

2.5 上皮性卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin 和vimentin表達水平的相關性

Spearman 相關性分析結果如表5 所示，上皮性卵巢癌組織中FOXM1、vimentin 蛋白表達水平間存在正相關關系（φ=0.562，P＜0.05），但二者與E-cadherin蛋白表達水平間均存在負相關關系（φ值分別為-0.440和-0.366，均為P＜0.05）。

表5 上皮性卵巢癌組織中FoxM1與E-cadherin 和vimentin 蛋白表達水平的相關性

3 討 論

上皮性卵巢癌約占全部卵巢癌病例的90%，多數(shù)患者在確診時已經(jīng)發(fā)生盆腹腔廣泛散播，造成多數(shù)患者預后極差，死亡率極高[10]。通過探究上皮性卵巢癌發(fā)生、轉移和侵襲的分子機制對于新型藥物研發(fā)以及制定新的治療策略至關重要。

FoxM1是一種重要的細胞周期調控蛋白，在G0期細胞中幾乎不表達，在G2/M 期呈高水平表達，并參與了多個細胞周期相關基因轉錄水平的調控。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1是一種原癌基因，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，并與患者預后密切相關[11]。但FoxM1具體的致癌機制及其在腫瘤細胞侵襲轉移中的作用機制尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中FoxM1蛋白陽性表達率為97.56%，高表達率為68.29%，顯著高于正常卵巢組織，提示FoxM1可能參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生。

本次研究進一步分析了上皮性卵巢癌組織FoxM1與患者病理指標的相關性，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中FoxM1蛋白表達情況與患者臨床分期、有無淋巴結轉移、兩級分級有關，臨床分期III～IV 期、有淋巴結轉移、HGSC 患者卵巢癌組織中FoxM1 蛋白高表達率分別顯著高于I～II 期、無淋巴結轉移、LGSC 患者，提示FoxM1 與上皮性卵巢癌進展、轉移有關，也再次說明FoxM1是上皮性卵巢癌的促癌因子。

本研究發(fā)現(xiàn)FoxM1蛋白在卵巢透明細胞癌組織中表達具有明顯的異質性。在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)低表達，在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)高表達，此結果尚無文獻報道。

EMT是上皮性卵巢癌發(fā)生淋巴結轉移、盆腹腔廣泛散播的生物學基礎之一，EMT能夠使上皮細胞失去正常的上皮表型、極性，從而獲得間質表型和功能，EMT化后的癌細胞能夠發(fā)生遷移，并和基質細胞相互作用進而發(fā)生鄰近組織浸潤，轉移至淋巴系統(tǒng)、血液循環(huán)和定植，形成轉移病灶[12]。E-cadherin 和vimentin是EMT常用的兩個生物標志物，前者屬于黏附分子鈣依賴性黏附素家族，其表達水平下調能夠造成細胞形態(tài)改變、細胞間黏附減少，細胞活動能力增強，在癌癥中表現(xiàn)為癌細胞遷移和浸潤能力增強[13]；vimentin是間質細胞中的中間絲蛋白，在細胞骨架維持中具有重要作用，上皮來源腫瘤細胞中vimentin 蛋白多呈陰性表達，間質來源腫瘤細胞則呈陽性表達，因此vimentin 蛋白在評估腫瘤EMT 化中具有重要的指示價值[14]。

本研究中，E-cadherin 和vimentin 蛋白在上皮性卵巢癌組織中的高表達率分別為53.66%和46.34%，有別于文獻數(shù)據(jù)，可能是由于文中樣本量過少，且所選的41例上皮性卵巢癌病例中，發(fā)生淋巴結轉移的僅有9 例，占全部上皮性卵巢癌病例數(shù)的21.95%，有78.05%的病例并未發(fā)生淋巴結轉移，因此E-cadherin蛋白顯示出較高的表達率。

多項研究證實，F(xiàn)oxM1 與腫瘤侵襲、轉移密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1 過表達不僅會促進肝細胞癌的EMT及轉移[15]，還可通過靶向細胞代謝和Snial基因促進人胰腺癌細胞的EMT，從而促進人胰腺癌的轉移和進展[16]。本研究中上皮性卵巢癌組織E-cadherin 蛋白陽性率和高表達率低于正常卵巢組織，vimentin 蛋白陽性率和高表達率高于正常卵巢組織，進一步研究則發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中E-cadherin 和vimentin 蛋白表達情況與患者臨床分期、有無淋巴結轉移、兩級分級有關，臨床分期III～IV 期、有淋巴結轉移、HGSC 患者卵巢癌組織中E-cadherin 蛋白高表達率分別顯著低于I～II 期、無淋巴結轉移、LGSC 患者。vimentin 蛋白則表現(xiàn)相反情況，而FoxM1 與E-cadherin 蛋白表達水平存在顯著負相關，與vimentin 蛋白表達水平之間均存在顯著正相關性，說明分期較高、腫瘤細胞轉移患者存在EMT，且FoxM1可能通過參與上皮性卵巢癌細胞的EMT，從而促進上皮性卵巢癌的侵襲轉移。Balli等[17]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1 是肺纖維化EMT 所必需的。FoxM1 能夠結合并增加Snail1基因的啟動子活性，Snail1基因是EMT 的關鍵轉錄調節(jié)因子。結合本文結果，F(xiàn)oxM1 可能通過增強Snail1基因的啟動子活性，從而促進腫瘤的EMT過程。此外，Kong等[18]通過多種體外實驗表明，F(xiàn)oxM1 的過表達或敲低可通過激活或抑制AKT/p70S6K 信號傳導途徑，從而改變EMT。本文的實驗結果及文獻提示，F(xiàn)oxM1 蛋白的高表達，可通過激活一系列信號通路，促進EMT過程，進而促進腫瘤淋巴結轉移及臨床進展，其中具體的分子機制，仍需要進一步研究。

綜上，F(xiàn)oxM1 蛋白在上皮性卵巢癌組織表達明顯上調，與臨床分期、淋巴結轉移和兩級分級相關，F(xiàn)oxM1 蛋白促進上皮性卵巢癌發(fā)生、進展和轉移可能與其促進了EMT過程有關。