慢性鎘暴露下食管鱗狀細胞癌細胞的lncRNAmRNA共表達網(wǎng)絡分析

彭 琳，曾明欽，陳炯玉，張廈蓉，朱 芮，黃裔騰

（1．汕頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院健康管理中心，廣東 汕頭 515041）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，位列全球惡性腫瘤發(fā)病率第7位和死亡率第6位[1]。鱗狀細胞癌和腺癌是食管癌的兩種主要組織學類型，其中食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）主要高發(fā)于東亞男性，尤其在中國約占食管癌病例的90%[2-3]。ESCC 具有的明顯地域、性別差異的流行病學特征[4]，高度提示其病因?qū)W的特殊性，環(huán)境因素被認為是ESCC發(fā)生的重要危險因素[5]。鎘是環(huán)境中廣泛存在的重金屬污染物，職業(yè)人群鎘暴露主要通過呼吸道吸入和皮膚暴露，一般人群主要通過空氣、吸煙、食物和水等途徑，其中，膳食攝入是日常暴露的主要來源，如稻谷、水產(chǎn)品、馬鈴薯、蔬菜、肉類和海產(chǎn)品等[6-7]。調(diào)查顯示，中國男性和女性成年人平均每周飲食鎘攝入量分別為3.9和4.1 μg/kg[8]，約為歐洲國家人均每周飲食鎘暴露水平（2.04 μg/kg）的2 倍[9]。近年來，已有若干基于中國人群的流行病學證據(jù)指出鎘暴露與食管癌的關(guān)聯(lián)[10-12]。本課題組前期在我國食管癌高發(fā)唯一沿海地區(qū)——潮汕地區(qū)開展的人群研究也表明，血鎘負荷是ESCC 發(fā)生和不良預后的危險因素之一，且通過構(gòu)建持續(xù)低劑量鎘暴露人ESCC 細胞株（CCT-EC109和CCT-EC9706）的系列體內(nèi)外實驗證明慢性低濃度鎘暴露促進ESCC 細胞生長、侵襲、遷移能力，增強腫瘤干細胞特性和對放化療耐受性[13]，但具體機制有待深入解析。

鎘是非直接遺傳毒性致癌物，表觀遺傳途徑是其主要致癌機制[14]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 nt 的無蛋白編碼功能的RNA。新近研究指出，鎘的毒性效應存在組織器官特異性，可能與其調(diào)控不同lncRNA 激活相應的信號通路或分子事件有關(guān)[15]。然而，lncRNA 在鎘促ESCC 中的調(diào)控機制尚無報道。本文擬基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，利用課題組前期建立的慢性鎘暴露ESCC 細胞模型之一CCT-EC109細胞系，通過比較其與親本細胞EC109 在lncRNA 和mRNA 水平的表達差異，運用生物信息學方法構(gòu)建lncRNA-mRNA 共表達網(wǎng)絡，為探討慢性鎘暴露促進ESCC 演進相關(guān)機制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞模型構(gòu)建

EC109 細胞由汕頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室細胞庫提供，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清和含青-鏈霉素的RPIM-1640 培養(yǎng)基中。EC109 細胞經(jīng)含5 μmol/L 氯化鎘的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)12周，建立慢性鎘暴露細胞模型CCT-EC109。

1.2 主要試劑

氯化鎘（純度99%）購自美國Sigma 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基和10%胎牛血清均購自美國Gibco，青霉素/鏈霉素、0.25% EDTA 胰蛋白酶均購于北京索萊寶科技有限公司，RNA later 購自美國Invitrogen。細胞總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；實時熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qPCR）試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.3 總RNA提取及細胞轉(zhuǎn)錄組測序

EC109 和CCT-EC109 兩株細胞各收集3 個樣本，使用miRNeasy Mini 試劑盒（德國Qiagen）抽提總RNA，使用Qubit?3.0 Fluorometer 和NanoDrop One 分光光度計定量，并利用Agilent Bioanalyzer 2100 選擇RNA 完整性指數(shù)值大于7.0的樣品用于測序建庫，1 μg RNA用于后續(xù)RNA樣品制備。建庫測序委托上海鯨舟基因科技有限公司完成，lncRNA 和mRNA 測序采用Illumina NovaSeq 6000 測序儀，質(zhì)控標準: 每個樣本數(shù)據(jù)量約10 G，所有類型堿基質(zhì)量大于20 的比例不小于90%。

1.4 差異表達lncRNA和mRNA的篩選

使用Hisat 2.0.5 將測序后的原始數(shù)據(jù)匹配到參考基因組，將輸出的序列比對/圖文件轉(zhuǎn)換為二進制比對/圖文件，并使用SAMtools 1.3.1 進行排序。使用R軟件包進行分位數(shù)歸一化以及后續(xù)數(shù)據(jù)處理，以每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)表示基因豐度，利用Stringtie 軟件對每個基因中的片段進行計數(shù)，并根據(jù)TMM算法進行歸一化。使用R包edgeR進行mRNA和lncRNA的差異表達分析，篩選條件為:P＜0.05，|log2（fold change）|≥1。

1.5 差異lncRNA相關(guān)靶基因篩選

應用ENCORI（http://starbase.sysu.edu.cn） 對DElncRNA 進行順式與反式靶基因預測，繼而利用RNAplex 軟件計算lncRNA-mRNA 互補配對熱動力學參數(shù)值，根據(jù)軟件閾值進一步篩選靶基因。最后，將DE-lncRNA 預測的靶基因集與DE-mRNA 基因集取交集，獲得DE-lncRNA調(diào)控的鎘暴露相關(guān)基因。

1.6 功能預測

為進一步了解DE-lncRNA調(diào)控的靶基因功能，利用R包Enrich進行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋，同時采用京都基因與基因組大百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.ad.jp/kegg），進行通路富集分析。

1.7 LncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡構(gòu)建

根據(jù)1.5 篩選的lncRNA 相關(guān)靶基因結(jié)果，采用Pearson's 相關(guān)分析篩選相關(guān)系數(shù)≥0.9（P＜0.05）的結(jié)果，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建lncRNA-mRNA關(guān)系對。

1.8 qPCR 驗證共表達網(wǎng)絡關(guān)鍵lncRNA 和mRNA 的表達

提取EC109、CCT-EC109 細胞總RNA，利用HiScript?III cDNA 第1 鏈合成試劑盒和HiScript?III RT SuperMix for qPCR 試劑盒（諾唯贊，中國）分別將lncRNA和mRNA逆轉(zhuǎn)錄成模板cDNA后，以β-actin為內(nèi)參，qPCR 測定目的lncRNA 和mRNA。PCR 引物序列見表1，引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。反應體系: cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master 混合物10 μL，雙 蒸 水8.2 μL。使 用Bio-Rad CFX96 Deep Well PCR 儀進行擴增，條件: 預變性95 ℃、30 s；循環(huán)反應95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。記錄各孔CT值，目的基因的相對表達水平為2-ΔΔCT。每組實驗重復3次。

表1 目的lncRNA和mRNA的引物序列

1.9 統(tǒng)計分析

采用R4.0.5 軟件和SPSS 24.0 進行統(tǒng)計學分析。組間差異比較采用Student'st檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 暴露株與親本的差異lncRNA和mRNA表達譜

層次聚類分析表明，lncRNA和mRNA表達譜可較明顯區(qū)分暴露株和親本株（圖1）。散點圖可視化顯示，2 794個DE-lncRNA包含1 248個上調(diào)lncRNA和1 546個下調(diào)lncRNA；4 267 個DE-mRNA 則包括2 766 個上調(diào)基因和2 947個下調(diào)基因（圖2）。

圖1 EC-109與CCT-EC109細胞lncRNA和mRNA差異表達譜

圖2 差異lncRNA相關(guān)的靶mRNA

2.2 差異表達lncRNA相關(guān)的靶mRNA

如圖2 所示，將DE-lncRNA 預測的7 216 個靶基因與4 267個DE-mRNA取交集，篩選得到1 546個與lncRNA相關(guān)的靶基因，其中上調(diào)基因737個，下調(diào)基因810個。

2.3 鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因生物學功能分析

將上述篩選的1 546 個交集基因進行GO 聚類分析，結(jié)果顯示靶基因富含57 個功能項，包括28 個生物學過程項、12個分子功能項和17個細胞成分項。涉及的生物學過程主要包括代謝、生物調(diào)節(jié)、刺激應答、免疫系統(tǒng)、細胞增殖等；細胞組分方面主要為膜、膜性腔、含蛋白質(zhì)的復合物等；分子功能項主要與催化活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)節(jié)等密切相關(guān)（圖3）。KEGG 分析1 546 個靶基因富集信號通路包含324 種途徑，癌癥和信號轉(zhuǎn)導是最主要的條目，其中，最顯著的富集項為Hippo 信號通路（富集基因數(shù)23，P=0.003）和病毒致癌作用（富集基因數(shù)29，P=0.002），其他重要信號通路包括癌癥信號通路（富集基因數(shù)54，P=0.044）、溶酶體（富集基因數(shù)137，P=0.051）等。KEGG顯示鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因通路富集分析的前30個信號通路見圖4。

圖3 鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因GO功能富集分析

圖4 鎘暴露相關(guān)lncRNA的靶基因通路富集分析

2.4 鎘暴露相關(guān)lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡

根據(jù)Pearson's 相關(guān)系數(shù)篩選出的前1 000 個lncRNA-mRNA 共表達基因?qū)Π?31 個DE-lncRNA和347 個DE-mRNA，Cytoscape 軟件構(gòu)建的共表達網(wǎng)絡如圖5 所示。將差異表達最顯著的前10 個lncRNA（NONHSAT244320.1、NONHSAT071835.2、NONHSAT 225909.1、NONHSAT107780.2、NONHSAT256799.1、NONHSAT097388.2、NONHSAT188800.1、 NONHSAT 211602.1、 NONHSAT217261.1、 NONHSAT054462.2）的38個共表達mRNA進一步構(gòu)建關(guān)系對網(wǎng)絡（圖6），與mRNA 關(guān)聯(lián)最多的lncRNA 為NONHSAT097388.2，其在暴露株表達顯著下調(diào)。共13個DE-mRNA 被預測為該lncRNA 的靶基因，分別是EMP2、ORAI2、ECE1、ZNF713、 HGSNAT、 CA5B、 ARPIN、 ANKRD9、PGF、MFAP5、PGM2L1、GNE和FUT8，其中FUT8、MFAP5、PGF顯示為上調(diào)基因，與NONHSAT097388.2均呈負相關(guān)關(guān)系。

圖5 鎘暴露相關(guān)前1 000個lncRNA-mRNA共表達關(guān)系對

圖6 前10個差異表達lncRNA的lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡

2.5 共表達網(wǎng)絡相關(guān)基因的表達驗證

為進一步驗證構(gòu)建的共表達網(wǎng)絡中關(guān)鍵lncRNA和mRNA 的表達情況，選取mRNA 關(guān)聯(lián)最多的lncRNA NONHSAT097388.2 及其負相關(guān)基因FUT8、PGF、MFAP5和 正 相 關(guān) 前4 位 基 因EMP2、ECE1、ORAI1、ZNF713，qPCR 測定結(jié)果顯示，除FUT8外，其他基因在親本株EC109與暴露株CCT-EC109的表達差異與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，即MFAP5和PGF在暴露株中表達升 高（P＜0.05）， 而NONHSAT097388.2、ECE1、EMP2、ORAT1和ZNF713表 達 均 下 降（P＜0.01），如圖7。

圖7 qPCR驗證鎘暴露相關(guān)lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡關(guān)鍵基因在EC109和CCT-EC109細胞中的表達

3 討 論

鎘致癌機制復雜，可引起包括DNA鏈斷裂、染色體畸變和基因突變在內(nèi)的遺傳毒性作用，但表觀遺傳改變被認為是比直接DNA損傷更為主要的致癌分子事件[16]。近年來，lncRNA作為新興表觀遺傳調(diào)控分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究熱點。lncRNA不僅參與mRNA 穩(wěn)定性、衰變調(diào)控，還參與基因翻譯及翻譯后修飾調(diào)節(jié)等諸多生物學過程[17]。新近研究證據(jù)揭示了lncRNA 參與鎘的毒性作用，包括多器官損傷、生殖毒性、DNA 損傷修復異常、惡性轉(zhuǎn)化等過程[15，18]。例如，持續(xù)鎘暴露可誘導前列腺癌細胞lncRNA OIP5-AS1 表達升高，通過miR-128-3p/SLC7A11 軸抑制鐵死亡參與前列腺癌進展[19]。lncRNA DUXAP10 通過調(diào)控Hedgehog通路參與鎘暴露誘導人支氣管上皮細胞干細胞特性增加[20]。此外，lncRNA MALAT1也被認為是鎘毒性的潛在標志物，它介導鎘暴露誘導的人支氣管上皮細胞16HBE細胞增殖、侵襲和遷移能力的增強，但具體機制不明[21]。迄今為止，尚無鎘暴露對食管癌細胞lncRNA表達譜影響的研究報道。

通常認為，共表達基因集參與同一通路，或者受到同樣的調(diào)控，具有相似的生物學功能。因此，lncRNA-mRNA 互相作用關(guān)聯(lián)分析方法常被應用于lncRNA在疾病尤其是在腫瘤中的功能和調(diào)控機制的研究[22]。本研究首先通過功能及通路富集分析發(fā)現(xiàn)，鎘暴露ESCC 細胞株發(fā)生變化的基因在生物學功能上主要涉及細胞代謝、刺激應答、免疫系統(tǒng)、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等方面，這些也與既往報道闡述的鎘毒性作用及相關(guān)機制相符[23-24]。盡管關(guān)于鎘免疫毒性對腫瘤演進影響的直接研究不多，但大量研究表明，鎘暴露可影響血液或組織中免疫細胞穩(wěn)態(tài)如Th1/Th2 的失衡和許多免疫相關(guān)分子，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1β等的表達發(fā)生變化[25-26]，這些均可能影響腫瘤免疫微環(huán)境。值得一提的是，在鎘影響的信號轉(zhuǎn)導通路中，Hippo 通路最顯著，而該通路被證實參與食管癌的惡性進展和化療抵抗機制[27]。可見，Hippo信號通路可能是慢性鎘暴露促進ESCC 細胞惡性生物學行為及放化療抵抗的重要分子機制。此外，通路富集分析還顯示，病毒致癌作用也是顯著富集項，這與Liang等[28]在鎘暴露乳腺癌細胞株富集到HPV感染相關(guān)通路的結(jié)果相近，提示鎘可能與病毒具有協(xié)同致癌作用。

對共表達網(wǎng)絡關(guān)系對分析發(fā)現(xiàn)，與mRNA 關(guān)聯(lián)最多的lncRNA NONHSAT097388.2 在暴露細胞株CCT-EC109中顯示表達降低，提示鎘暴露可能通過抑制該lncRNA 的表達調(diào)控相關(guān)基因及相應分子事件。NONCODE 網(wǎng)站查詢顯示，NONHSAT097388.2 基因位于4號染色體，長度14 407 bp，包含6個外顯子，目前對NONHSAT097388.2 的功能知之甚少，搜索與其關(guān)聯(lián)的2 個上調(diào)基因MFAP5、PGF相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)盡管MFAP5在食管癌中的作用未見報道，但在頭頸部鱗癌和乳腺癌的研究中，MFAP5被證實分別通過AKT通路和ERK/MMP 通路促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、增 殖 和 轉(zhuǎn)移[29-31]；阻斷MFAP5 的抗腫瘤免疫治療則可增加卵巢癌和胰腺癌對紫杉醇化療的敏感性[32]。PGF基因即胎盤生長因子（placenta growth factor，PGF/PIGF）基因，是血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族重要成員之一。新近研究表明，PGF 在肝內(nèi)膽管細胞癌細胞和患者血漿中表達增加，且與疾病進展相關(guān)，而阻斷PGF可抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和化療抵抗[33]；PGF 還被發(fā)現(xiàn)在惡性程度最高的三陰性乳腺癌組織中的表達水平高于其他亞型，而且，在乳腺癌、黑色素瘤患者的血液中均能檢測到高豐度的循環(huán)PGF表達；高度提示PGF是促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因素之一[34-35]。EMP2基因是與NONHSAT097388.2 共表達的正相關(guān)基因之一，EMP2 mRNA 被證實在食管癌組織中顯著低表達，且在淋巴結(jié)陽性和中低分化組中表達水平更低[36]。上述結(jié)果提示， 鎘暴露可能通過NONHSAT097388.2 介導MFAP5、PGF、EMP2等基因的表達調(diào)控參與ESCC 的演進和放化療抵抗機制。

綜上所述，慢性低濃度鎘暴露可誘導ESCC 細胞相關(guān)lncRNA 和mRNA 的表達譜發(fā)生改變，其可能通過復雜的lncRNA-mRNA 網(wǎng)絡引起系列生物學過程、細胞組分、代謝與免疫、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導的變化，從而構(gòu)成鎘促ESCC 發(fā)生發(fā)展和放化療抵抗的復雜分子機制。本研究結(jié)果亦充分支持了本課題組前期研究工作揭示的鎘暴露食管癌細胞株較親本細胞具有更強的侵襲遷移能力、EMT和干細胞特性以及對放化療的耐受性[13]。此外，本研究鑒定的若干關(guān)鍵lncRNA和mRNA 有望成為鎘暴露ESCC 患者預后判斷的潛在生物標志物和治療靶點。