m6A去甲基化酶FTO在甲狀腺癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究

田 潤，溫思妮，劉翰元，韓 菲，2，朱小年，2，譚盛葵，2，張慧霞，2，

（1．桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541199；2．廣西環(huán)境暴露與全生命周期健康科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541199）

2020年，新發(fā)甲狀腺癌病例數(shù)居全球新增癌癥病例數(shù)第11 位[1]，且甲狀腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[2]。由于甲狀腺癌具有隱蔽性強(qiáng)、進(jìn)展緩慢的特點(diǎn)，一些患者在初診時(shí)就已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[3]，且晚期甲狀腺癌患者5 年生存率較低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甲狀腺癌的發(fā)生與癌基因的激活和抑制調(diào)控有關(guān)，因此揭示甲狀腺癌相關(guān)基因及其調(diào)控機(jī)制對于甲狀腺癌的早期診斷和治療具有重要意義[4]。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是真核細(xì)胞生物包括人類中最豐富的表觀遺傳修飾[5]。m6A甲基化也作為最常見的RNA 修飾形式，通過影響RNA 的選擇性剪接、穩(wěn)定性核輸出、mRNA 降解和翻譯來調(diào)節(jié)靶RNA的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[6-8]。其調(diào)控作用由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase-like protein 3，METTL3）和威爾姆斯瘤相關(guān)蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）、去甲基化酶脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein， FTO）、ALKB 同源 物5（AlkB homolog 5，ALKBH5）、RNA 結(jié)合蛋白YTH N6-甲基腺苷RNA 結(jié)合蛋白1（YTH domain-containing protein 1，YTHDF1）和YTH N6-甲基腺苷RNA 結(jié)合蛋白2（YTH domain-containing protein 2，YTHDF2）等介導(dǎo)[9-11]。越來越多的研究表明，m6A 修飾在多種人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[12]、胰腺癌[13]和口腔鱗狀細(xì)胞癌[14]等。然而，m6A RNA修飾調(diào)控因子FTO與甲狀腺癌的關(guān)系尚不清楚。另外，MAPK-JNK 作為絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族的成員，其在癌癥中是一個(gè)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]。研究發(fā)現(xiàn)，JNK 的表達(dá)水平在甲狀腺癌組織中普遍升高，并與甲狀腺癌的病理特征、惡性程度和預(yù)后相關(guān)[16]。因此，MAPK-JNK 途徑的研究不僅可以深入了解甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制，還可以為甲狀腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

因此，本研究將通過FTO敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染甲狀腺癌細(xì)胞后，經(jīng)m6A 甲基化定量檢測試劑盒檢測甲狀腺癌細(xì)胞m6A 甲基化修飾水平，采用平板集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell 實(shí)驗(yàn)分析m6A 去甲基化酶FTO對甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力的影響，通過Western blot 實(shí)驗(yàn)分析FTO 對MAPK通路的調(diào)控機(jī)制，旨為甲狀腺癌的早期篩查與防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505C，均購自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；Lipo 3000、PageRulerTMPlus 預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自美國Thermo Forma 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自日本Dojindo公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot 溶液套裝、SDSPAGE 凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；FTO敲低質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因公司；m6A RNA甲基化定量檢測試劑盒購自美國Epigentek 集團(tuán)公司；Transwell 遷移/侵襲小室購自美國Corning公司；RIPA裂解液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）抗體試劑盒購自美國Epigentek 集團(tuán)公司；兔抗人FTO 抗體（bs-7056R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人C-Jun 抗體（GTX134395）購自美國GeneTex公司；兔抗人MLK3抗體（11996-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器超凈操作臺(tái)購自天津市泰斯特儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Forma 公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo Forma 公 司；伯 樂Western blot 裝 置/ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%的青鏈霉素混合液（100 ×）的DMEM 混合液中，并置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色及顯微鏡下密度，及時(shí)換液和傳代。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FTO敲低程度不同的兩種質(zhì)粒設(shè)為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組（分別命名為實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2），另設(shè)1個(gè)空載陰性對照質(zhì)粒組，參考Lipofectamine 3000使用說明，將質(zhì)粒和脂質(zhì)復(fù)合物加入細(xì)胞中培養(yǎng)。質(zhì)粒混合液及脂質(zhì)混合液比例如下：質(zhì)?；旌弦?25 mL，含4 mL Lipo 3000、2 mL 質(zhì)粒和119 mL Opti-MEM；脂質(zhì)混合液125 mL，含3.75 mL Lipo 3000 和121.25 mL Opti-MEM。轉(zhuǎn)染后8 h 換回普通培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，并進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 m6A甲基化水平檢測用TRIzol 法提取轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞總RNA，使用Nanodrop 2000測定RNA濃度。使用RNA甲基化定量試劑盒檢測m6A甲基化水平，并用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光度值D（450）。m6A甲基化水平計(jì)算公式如下。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染的甲狀腺癌細(xì)胞重懸后按每孔1×105個(gè)接種于96孔板中，每孔含100 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，每組3 個(gè)復(fù)孔。分別于接種后12、24、48、72 、96 h每孔加入10 mL的CCK-8試劑，37 ℃孵育3.5 h，酶標(biāo)儀450 nm 波長檢測每孔吸光度D（450），隨后分別于第1～4 天的相同時(shí)間測定D（450），并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 平板集落形成實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以2 000個(gè)/皿細(xì)胞將每組細(xì)胞分別接種到含有2.5 mL完全培養(yǎng)基的6孔板中，置37 ℃、CO2體積為5%及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，并用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，使用結(jié)晶紫染液染色，待干燥后將6孔板置于顯微鏡（低倍鏡）下拍照記錄全平板細(xì)胞生長情況，并通過ImageJ軟件計(jì)算實(shí)際集落數(shù)。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞種植在經(jīng)Marker筆劃橫線定位的孔板中。當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)90%～95%時(shí)，用200 mL槍頭垂直劃痕，保持200倍鏡下劃痕寬度均勻且占據(jù)整個(gè)視野1/3。使用PBS清洗脫落細(xì)胞，并加入2%的FBS 培養(yǎng)基2 mL。于0、12、24 h 時(shí)，將細(xì)胞置于200 倍鏡下于同一視野拍照記錄劃痕愈合狀況，通過ImageJ 軟件計(jì)算不同時(shí)間段的劃痕處面積，并根據(jù)公式計(jì)算劃痕閉合率。

1.2.7 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入無血清培養(yǎng)基稀釋為2×105個(gè)/mL，取200 mL 細(xì)胞懸液加Transwell 遷移小室，外室中加入600 mL 完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。并于48 h 后終止培養(yǎng)，使用4%多聚甲醛固定，并使用1%結(jié)晶紫染色，用棉簽輕擦內(nèi)室未穿過細(xì)胞。在200 倍鏡下上下左右中各選取一個(gè)視野拍照并使用ImageJ軟件計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell 侵襲小室從-20 ℃冰箱取出放置于4 ℃解凍，加入無血清培養(yǎng)基，37 ℃活化過夜使其凝固，其余剩下的步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 Western blot 實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按RIPA裂解法裂解，使用BCA法測定蛋白濃度。將細(xì)胞按比例加入5×電泳上樣緩沖液中，于100 ℃加熱蛋白8 min。按Bio-Rad說明書組裝凝膠模具，按說明書配制不同比例的濃縮膠，各凝膠孔加入20 μg 蛋白樣品；電泳設(shè)置恒壓80 V、40 min 左右，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓至120 V，溴酚蘭到達(dá)分離膠的底部位置時(shí)結(jié)束電泳；轉(zhuǎn)膜設(shè)置電流300 mA、60 min，于冰水浴的狀態(tài)下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；在室溫中用封閉液封閉條帶2 h；在4 ℃中分別使用FTO、GAPDH、Ecadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、MLK3 和C-JUN對應(yīng)的一抗工作液孵育條帶24 h；在室溫中分別使用對應(yīng)的二抗工作液孵育條帶1 h；在室溫中將條帶放入ECL工作液中孵育10 s，使用凝膠成像系統(tǒng)獲得蛋白條帶圖。重復(fù)3 次，所得蛋白條帶圖用ImageJ 進(jìn)行定量分析，以GAPDH 蛋白條帶灰度值作為內(nèi)部參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 FTO對甲狀腺癌細(xì)胞m6A甲基化水平的影響

將FTO 敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505C 后，經(jīng)比色法檢測細(xì)胞m6A 甲基化水平。結(jié)果如圖1 所示，與空載質(zhì)粒陰性對照相比，F(xiàn)TO 敲低后甲狀腺癌細(xì)胞的m6A 甲基化水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 FTO對甲狀腺癌細(xì)胞m6A甲基化水平的影響

2.2 FTO對甲狀腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

通過FTO 敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505C后，經(jīng)CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果如圖2 所示：在48 h 以后，與空載質(zhì)粒相比，F(xiàn)TO敲低TPC-1細(xì)胞、SW-579和8505C細(xì)胞增殖活性明顯升高（均為P＜0.01）。經(jīng)平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力，在種板后10 d左右，與空載質(zhì)粒相比，F(xiàn)TO敲低TPC-1細(xì)胞、SW-579和8505C細(xì)胞增殖能力均有不同程度的升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05），結(jié)果如圖3所示。

圖2 CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖能力

圖3 平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測FTO敲低后甲狀腺癌細(xì)胞增殖能力的變化

2.3 FTO對甲狀腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

通過FTO 敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505C 后，經(jīng)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。如圖4 所示，從劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出與陰性對照相比，F(xiàn)TO敲低后TPC-1細(xì)胞、SW-579和8505C細(xì)胞的劃痕閉合率明顯升高（P＜0.05或0.01）。

進(jìn)一步采用Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)TO敲低后實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2的TPC-1 細(xì)胞、SW-579 和8505C 細(xì)胞遷移數(shù)目均高于陰性對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測FTO對甲狀腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 FTO對甲狀腺癌細(xì)胞侵襲能力影響

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果如圖6所示，F(xiàn)TO敲低后實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2的TPC-1細(xì)胞、SW-579 和8505C 細(xì)胞侵襲數(shù)目均高于陰性對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 Western blot法檢測FTO敲低后甲狀腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及MAPK信號通路蛋白的表達(dá)

2.5 FTO 對甲狀腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及MAPK信號通路相關(guān)蛋白的影響

通過FTO 敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505C后，經(jīng)Western blot實(shí)驗(yàn)分析上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及MAPK 信號通路蛋白水平變化。結(jié)果如圖6 和圖7 所示，與陰性對照相比，F(xiàn)TO 敲低后的TPC-1 細(xì)胞、SW-579 細(xì)胞和8505C 細(xì)胞FTO 蛋白水平表達(dá)顯著下調(diào)，E-cadherin 和β-catenin 的表達(dá)相對降低，N-cadherin 和vimentin 的表達(dá)相對升高、MLK3 和C-JUN蛋白的表達(dá)明顯增加（均為P＜0.05）。

圖7 Western blot檢測FTO敲低后甲狀腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及MAPK信號通路蛋白表達(dá)的半定量分析結(jié)果

3 討 論

甲狀腺癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率不斷上升。盡管已經(jīng)取得了一定的治療進(jìn)展，但甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。甲狀腺癌可分為4 種類型：間變性癌、濾泡性癌、髓樣癌和乳頭狀癌[17]。大多數(shù)甲狀腺癌患者被診斷為分化型甲狀腺癌，惡性程度較低。其中，甲狀腺未分化癌的患者，由于甲狀腺細(xì)胞高度異型化、失去甲狀腺細(xì)胞特征，并呈現(xiàn)出髓樣式，易于發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[18]。另外，由于甲狀腺癌具有隱蔽性強(qiáng)、進(jìn)展緩慢的特點(diǎn)，一些患者在初診時(shí)也會(huì)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移[3]，對患者健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

m6A 甲基化也在甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌細(xì)胞中m6A 甲基化的水平通常比正常甲狀腺組織高，且m6A 甲基化酶的表達(dá)異常也與甲狀腺癌的發(fā)生相關(guān)[19]。m6A 甲基化的異?？赡苡绊懠谞钕侔┘?xì)胞的基因表達(dá)和信號通路，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[20]。其中FTO 作為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的m6A 家族基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)過程的作用，如脂肪生成、mRNA 剪接等過程，在甲狀腺癌中可能扮演著重要的角色。因此，本研究選擇了不同類型了甲狀腺癌細(xì)胞（人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1、人甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW-579、人甲狀腺未分化癌細(xì)胞8505C），通過FTO 蛋白的敲低實(shí)驗(yàn)，探索其在甲狀腺癌細(xì)胞中對侵襲、遷移和增殖能力的影響，以深入了解FTO在甲狀腺癌發(fā)展中的作用機(jī)制。

研究結(jié)果表明，在TPC-1、SW-579和8505C甲狀腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)TO 蛋白的敲低可以導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力增強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)間接支持了FTO在甲狀腺癌中作為一個(gè)促癌基因的假設(shè)。具體來說，F(xiàn)TO蛋白的敲低導(dǎo)致了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的改變，即Ecadherin和β-catenin的降低以及N-cadherin 和vimentin的升高。這些結(jié)果表明FTO蛋白在調(diào)控細(xì)胞間質(zhì)連接和細(xì)胞形態(tài)的過程中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)TO 與結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展也存在一定的相關(guān)性[21-24]。

另外，本研究還觀察到FTO 敲低后MLK3 和C-JUN蛋白的表達(dá)明顯增加。這表明FTO蛋白可能通過影響MAPK 信號通路的活化來調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，與文獻(xiàn)[25-27]報(bào)道一致。MAPK 信號通路在許多癌癥類型中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。因此，我們推測FTO通過調(diào)控MAPK信號通路參與了甲狀腺癌的發(fā)展和惡化。

盡管本研究揭示了FTO在甲狀腺癌細(xì)胞中的重要作用，但仍存在一些問題需要進(jìn)一步研究。首先，我們需要深入了解FTO 蛋白與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MAPK 信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，包括與其他調(diào)控因子的相互作用和下游效應(yīng)的探究。此外，對于FTO在甲狀腺癌發(fā)展的臨床意義和潛在的治療靶點(diǎn)也需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過FTO 蛋白的敲低實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌細(xì)胞中FTO 的降低導(dǎo)致了細(xì)胞侵襲、遷移和增殖能力的增強(qiáng)。這為進(jìn)一步理解甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。然而，對于FTO在甲狀腺癌中的詳細(xì)作用機(jī)制和臨床意義仍需要進(jìn)一步的研究。我們相信這些研究結(jié)果將為甲狀腺癌的治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)和策略。