不同采摘時期桃金娘葉三萜的動態(tài)變化研究

◎ 趙 武，覃思明，銀慧慧，顏國慶，曾雪顏，劉 偉

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國（廣西）-東盟跨境動物疫病防控重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.南寧市隆安縣古潭鄉(xiāng)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 南寧 532708）

三萜類化合物（Triterpenoids）是一類由異戊二烯單元為基礎(chǔ)組成的天然產(chǎn)物，其特征是以多種方式修飾的基本骨架形成的天然三萜類化合物，呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)的多樣性和高度的多功能性[1]。常見的三萜類有機化合物為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜，其中五環(huán)三萜化合物是由5個碳原子組成的環(huán)和3個相鄰的異構(gòu)烷基側(cè)鏈構(gòu)成，呈現(xiàn)廣泛的藥理作用，具有多種生物學(xué)活性[2-3]。目前已從天然植物中發(fā)現(xiàn)并提取到多種五環(huán)三萜類化合物，如熊果酸、齊墩果酸、白樺酯酸、白樺脂醇和羽扇豆醇等，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗腫瘤、抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等特性[4-5]。

桃金娘是一種潛在的藥用植物，該植物的葉、根、芽和果實均可藥用。目前已發(fā)現(xiàn)桃金娘葉提取物在收斂止瀉、止血方面具有一定作用功效，不僅能促進傷口愈合，還常用于治療急性胃腸炎、腹瀉、消化不良、痢疾及嘔吐等消化道疾病[6-7]。此外，桃金娘葉提取物對細胞和內(nèi)孢子具有顯著的活性，可作為一種替代的食品添加劑控制蠟樣芽孢桿菌[8]。目前已在桃金娘葉中發(fā)現(xiàn)多種三萜類化合物，其具有較好的抗氧化性[9-11]。本研究以桃金娘葉為研究對象，采摘不同時期的桃金娘葉經(jīng)干燥處理后提取，探討不同采摘時期桃金娘葉三萜含量的動態(tài)變化，為開發(fā)桃金娘作為功能性食品提供理論參考依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃金娘葉，產(chǎn)地為廣西玉林（東經(jīng)109°39′至110°18′，北緯22°19′至23°01′），采摘時間分別為2019年的3月27日、4月22日、5月14日、6月20日、7月24日、8月20日和9月22日，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獸藥新技術(shù)研究開發(fā)中心劉偉正高級獸醫(yī)師鑒定為桃金娘植物葉。將不同采摘時期的桃金娘葉置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后過40目篩，備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、L-抗壞血酸（維生素C），美國Sigma-Aldrich公司；熊果酸對照品，中國食品藥品檢定研究所；乙酸乙酯、冰醋酸、甲醇、高氯酸和香草醛（均為分析純），成都科隆化學(xué)品有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TECAN model Infinite M200酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；HH-S4型恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；SK7200HP型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，密理博中國有限公司；F160型粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桃金娘葉三萜提取

準確稱取過篩后的桃金娘葉細粉1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶內(nèi)，吸取乙酸乙酯溶液50 mL與桃金娘葉細粉輕輕搖勻混合，稱定得到的懸浮液錐形瓶重量，在功率294 W、頻率53 kHz、溫度30 ℃的條件下超聲提取90 min，超聲結(jié)束后室溫放冷，用乙酸乙酯補足重量，離心過濾，收集上清液置于50 mL棕色容量瓶中，并用乙酸乙酯溶液定容至刻度，充分搖勻后得到樣品待測液[11]。

1.3.2 標(biāo)準曲線制備

不同采摘時期桃金娘葉三萜含量的變化采用香草醛-高氯酸顯色法進行測定[12]。精密稱取熊果酸對照品5.3 mg，加入少量甲醇溶液輕搖至溶解，用甲醇定容至50 mL，制成濃度為106.0 μg·mL-1的熊果酸對照品溶液備用。分別精密移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL的熊果酸對照品溶液，置于容量為10 mL的具塞試管中，在80 ℃下水浴，待試管中溶液蒸干后，按照順序依次加入0.2 mL濃度為5%的香草醛冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，迅速搖勻，將試管置于溫度為70 ℃的水浴鍋中，水浴處理樣品15 min后放冷至室溫，吸取冰醋酸溶液5 mL于錐形瓶內(nèi)混合搖勻，制成熊果酸濃度分別為0 μg·mL-1、3.53 μg·mL-1、7.07 μg·mL-1、10.60 μg·mL-1、14.13 μg·mL-1、17.67 μg·mL-1和21.20 μg·mL-1的系列對照品溶液。分別精密吸取系列對照品溶液200 μL于96孔板中，設(shè)置酶標(biāo)儀波長參數(shù)為545 nm，測定96孔板中樣品的吸光度。

1.3.3 桃金娘葉三萜含量測定

將1.3.1提取到的樣品待測液按1.3.2標(biāo)準曲線的制作步驟順序進行處理，一式三份，酶標(biāo)儀波長參數(shù)設(shè)置為545 nm，在此波長下對桃金娘葉樣品待測溶液的吸光度進行測定，并根據(jù)1.3.2測定得到的標(biāo)準曲線回歸方程計算樣品待測液濃度。桃金娘葉三萜含量計算公式為

其中：W為桃金娘葉待測樣品中三萜含量，mg·g-1；C為根據(jù)標(biāo)準曲線計算得到的桃金娘葉提取樣品溶液的三萜濃度，μg·mL-1；V為桃金娘葉樣品提取液體積，mL；m為準確稱取的桃金娘葉粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準曲線

標(biāo)準曲線的建立是以熊果酸對照品溶液的濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X軸），對應(yīng)濃度的對照品溶液吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)（Y軸），繪制的標(biāo)準曲線見圖1?；貧w方程為A=0.016 1C+0.053 9，R2=0.990 7，熊果酸濃度在0～21.20 μg·mL-1呈良好線性關(guān)系，可用于桃金娘葉中三萜含量的測定。

圖1 標(biāo)準曲線圖

2.2 不同采摘時期桃金娘葉三萜含量變化

取2019年3月27日、4月22日、5月14日、6月20日、7月24日、8月20日、9月22日采摘的桃金娘葉樣品7份，測定桃金娘葉三萜含量，結(jié)果見圖2。3—6月采摘的桃金娘葉中三萜含量呈上升趨勢，6月以后采摘的桃金娘葉三萜含量逐漸下降，其中5月14日至7月24日采摘的桃金娘葉三萜含量較高，6月20日采摘的桃金娘葉中三萜含量最高，為22.54 mg·g-1。

圖2 2019年不同采摘時期桃金娘葉三萜含量變化規(guī)律圖

3 討論

桃金娘葉中含有大量三萜類化合物，在不同的采摘時期桃金娘葉三萜的含量不同。研究結(jié)果顯示，5月14日至7月24日采摘的桃金娘葉中三萜類物質(zhì)含量相對較高。因此，為了從桃金娘葉中獲得更多的三萜類物質(zhì)，適宜在6月左右對其進行采摘。桃金娘為桃金娘科桃金娘屬灌木植物，喜高溫、高濕的環(huán)境，花期為4—5月，果實成熟在8—10月。桃金娘葉中三萜類物質(zhì)在其花期開始呈現(xiàn)上升趨勢，在果實成熟期呈現(xiàn)下降趨勢，可能是隨著季節(jié)變化，光照、氣候改變，桃金娘葉中活性成分也會發(fā)生改變。桃金娘的生長旺季是在春、夏、秋3個季節(jié)，冬季生長緩慢。春季到夏季是桃金娘生長旺盛的時期，此時三萜類化合物順勢蓄積，到盛夏時節(jié)氣溫升高，三萜類化合物含量達到最高，秋季溫度開始降低、氣候干燥，三萜類化合物的蓄積能力逐漸減弱。

桃金娘具有藥用價值，其富含有多種植物化學(xué)成分，包括萜類、酚類和脂類等，該植物已被用于治療腹瀉和傷口愈合等。目前，已從桃金娘的葉、根和果實中鑒定出大量酚類和萜類化合物，并證明了其在抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤等方面的生物活性，有研究顯示，桃金娘葉提取物能作為天然抗葡萄球菌添加劑應(yīng)用到食品中[13]。還有研究顯示，桃金娘葉的甲醇提取物可作為抗氧化劑和抗糖尿病藥物的潛在來源[14]。

三萜類化合物廣泛存在于植物界。目前從桃金娘葉片中已鑒定出多種三萜類化合物，已分離出24個三萜類化合物，包括齊墩果酸、β-香樹酯醇，α-香樹酯醇、羽扇豆醇、白樺脂醇、β-香樹脂酮醇和肉毒素等[15-17]。齊墩果酸是一種α-羥基酸，具有護肝降酶、促進肝細胞再生、抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及增強免疫力的作用[18]；白樺脂醇是一種天然的植物次生代謝產(chǎn)物，有研究顯示，將白樺脂醇作用于多種腫瘤細胞時，發(fā)現(xiàn)均有明顯的抑制作用[19]，此外，還發(fā)現(xiàn)白樺脂醇具有抗人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）、抗乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[20]；羽扇豆醇是一種活躍的五環(huán)三萜化合物，具有很強的抗炎與抗腫瘤活性[21]。但目前對桃金娘葉中三萜的具體生物活性的研究相對較少。

4 結(jié)論

本研究通過對不同采摘時期桃金娘葉中三萜含量進行測定，結(jié)果顯示5月14日至7月24日采摘的桃金娘葉中三萜類物質(zhì)含量相對較高。研究結(jié)果為桃金娘作為功能性食品的研究開發(fā)提供參考。在今后的研究中，有必要對桃金娘活性化合物及其生物活性進行深入研究，為開發(fā)新的保健功效桃金娘產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。