改良腹主動脈瘤大鼠模型的制作方法

劉新農(nóng)，楊根歡，廖鵬志，汪 巖，賈玉龍，沈晨陽

首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院血管外科，北京 100070

腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）定義為腹主動脈直徑超過正常腹主動脈直徑的1.5倍及以上或≥3.0 cm[1-2]。破裂出血是AAA患者死亡的主要原因，美國流行病學研究表明AAA引起的死亡在65歲以上老年人死因中居第10位[3-5]。腹主動脈瘤的發(fā)病機制尚不明確，目前仍缺乏抑制腹主動脈瘤進展的有效藥物[6-7]。動物模型是研究疾病分子機制及治療方法的重要工具[8]。腹主動脈腔內(nèi)灌注豬胰蛋白酶（elastase from porcine pancreas，PPE）是制作AAA 動物模型的主要方法之一，但傳統(tǒng)的腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作AAA 模型的方法仍存在成瘤率低、實驗動物病死率高等不足[9-11]。本研究報道一種改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作AAA 大鼠模型的方法，該方法具有成瘤率高、成瘤時間短等優(yōu)點，可為研究者提供更加有效的AAA大鼠模型，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠20只，體重550～600 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)在SPF級標準動物房，24 h提供高壓滅菌水和固體棒狀飼料。按照美國國立衛(wèi)生研究院1996年修訂的《實驗動物護理和使用指南》[12]進行動物實驗。動物實驗于2021年1—8月進行。

1.1.2 主要試劑

Ⅰ型PPE購自美國Sigma公司；山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；抗CD68抗體購自美國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

采用隨機數(shù)字表法將20只SD大鼠隨機分為兩組，每組10只。改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組（改良法）：驗證目標段腹主動脈腔內(nèi)密閉性良好后，經(jīng)大鼠腹主動脈穿刺進行腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE。傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 組（傳統(tǒng)法）：經(jīng)大鼠左側(cè)髂總動脈穿刺進行腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE。PPE 的濃度為40 U/ml，灌注壓力為100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），灌注時間為30 min。

1.2.2 改良AAA模型的制作方法

麻醉與切口：大鼠麻醉后取平臥位，將其頭部及四肢固定于手術操作板，常規(guī)消毒鋪巾，于腹部正中做1個長度為4～5 cm的切口，逐層切開皮膚及皮下組織。關鍵手術步驟如下：（1）切開腹膜后組織，顯露腹主動脈，長度約為1.5 cm，為目標腹主動脈；（2）充分阻斷目標腹主動脈的近端、遠端及其間發(fā)出的分支動脈，保證目標腹主動脈腔內(nèi)形成良好的密閉性；（3）腹主動脈分支血管采用非接觸式阻斷，即連同分支血管周圍的組織一并結(jié)扎，避免引起分支血管損傷，防止PPE在灌注過程中外溢至腹腔內(nèi)；（4）采用4-0尼龍線臨時阻斷生殖動脈等較大的分支血管，采用6-0血管縫合線臨時縫扎腹主動脈后壁發(fā)出的腰動脈等細小分支及其周圍組織；（5）于目標腹主動脈遠端植入穿刺套管針并固定，采用生理鹽水檢測目標腹主動脈腔內(nèi)密閉性，證實其密閉性良好后可進行PPE灌注；（6）PPE 灌注結(jié)束后吸出腹主動脈腔內(nèi)殘余的PPE溶液，并使用生理鹽水反復沖洗3遍，解除所有分支血管的阻斷以恢復血流；（7）撤出穿刺針，采用7-0血管縫合線縫合腹主動脈穿刺點，逐層縫合手術切口，待大鼠麻醉蘇醒后置于動物房。

1.2.3 傳統(tǒng)AAA模型制作方法

傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作腹主動脈瘤模型的步驟參考既往研究[13]。簡要步驟如下：游離顯露目標段腹主動脈，結(jié)扎其近端、遠端及其分支血管，于一側(cè)髂動脈或股動脈處穿刺，將穿刺針植入目標段腹主動脈腔內(nèi)進行PPE灌注。灌注結(jié)束時，吸出腹主動脈腔內(nèi)的PPE 并用生理鹽水沖洗3遍，撤除套管針，采用7-0血管縫合線縫合穿刺點，恢復腹主動脈血流，檢查穿刺點無出血，使用生理鹽水沖洗腹腔后逐層關閉腹壁。

1.2.4 腹主動脈多普勒超聲檢查

于術后7、14 d分別對大鼠腹主動脈進行彩色多普勒超聲檢查，測量腹主動脈瘤直徑并計算腹主動脈擴張率，步驟如下：大鼠吸入異氟醚麻醉，使用脫毛劑去除其腹部皮毛并將其固定在超聲檢查的操作平臺。采用Vevo 2100成像系統(tǒng)進行腹主動脈超聲成像，使用MS-250超聲探頭（頻率為13～24 MHz）采集心臟收縮期末期左腎靜脈至腹主動脈分叉處的腹主動脈圖像，測量腹主動脈最大直徑。使用Vevo LAB 1.7.1軟件進行圖像分析。在造模前通過超聲測量獲得術前腹主動脈直徑。腹主動脈擴張率（%）=（AAA最大直徑/術前腹主動脈直徑）×100%，腹主動脈擴張率大于150%視為AAA，腹主動脈成瘤率（%）=腹主動脈擴張率大于150%的大鼠數(shù)量/接受造模手術的大鼠總數(shù)×100%。

1.2.5 彈性纖維染色

通過對AAA 組織進行彈性纖維染色來觀察AAA 組織中彈性纖維的降解情況。彈性纖維染色的關鍵步驟：（1）將酒精蘇木素、三氯化鐵和碘液以5∶2∶2的比例混合成彈性纖維染液，切片浸入彈性纖維染液30 min；（2）進行背景分化，即采用三氯化鐵分化液進行組織分化，至彈性纖維呈紫黑色；（3）將飽和苦味酸與酸性品紅以9∶1的比例混合成復染溶液，將切片浸入復染溶液1～3 min后以無水乙醇脫水；（4）使用干凈的二甲苯透明5 min，使用中性樹膠封片。采用全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)進行圖像采集。使用Image J軟件進行彈性纖維的定量分析。

1.2.6 免疫組織化學染色（immunohistochemical staining，IHC）

CD68是巨噬細胞的特異性標志物，使用抗CD68（1∶1000）抗體進行IHC染色，鑒定AAA 組織中巨噬細胞浸潤情況，實驗步驟參照抗體產(chǎn)品說明書。使用全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)進行圖像采集，每個切片隨機選取10個高倍鏡視野，使用Image J軟件進行炎癥細胞的定量分析。

1.3 觀察指標

比較兩組大鼠的手術相關指標，大鼠存活率，術后7、14 d的AAA成瘤率和腹主動脈擴張率。觀察腹主動脈彈性纖維情況和炎性細胞浸潤情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 手術相關指標及大鼠存活率

兩組大鼠均成功實施手術，手術過程中無大鼠死亡。改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組的手術時間為（53.63±6.46）min，明顯短于傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 組的（68.43±7.32）min，差異有統(tǒng)計學意義（t=-6.548，P＜0.01）。改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組每只大鼠PPE 用量為（2.68±0.57）U，明顯少于傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 組（7.86±1.14）U，差異有統(tǒng)計學意義（t=-24.596，P＜0.01）。術后14 d，傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組和改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組的大鼠存活率分別為80%（8/10）和100%（10/10），差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.222，P＞0.05）。改良AAA 模型制作的關鍵手術步驟及結(jié)果見圖1。

圖1 改良AAA模型的關鍵步驟與結(jié)果

2.2 AAA 成瘤率與腹主動脈擴張率

超聲檢查結(jié)果顯示，術后7 d，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組的腹主動脈擴張率、AAA 成瘤率均高于傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。術后14 d，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組的腹主動脈擴張率明顯高于傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組和傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組的AAA 成瘤率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1，圖2）

表1 兩組大鼠模型不同時間AAA成瘤率與腹主動脈擴張率的比較

圖2 兩組大鼠的AAA超聲影像圖

2.3 彈性纖維情況的比較

彈性纖維染色結(jié)果顯示，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組大鼠AAA內(nèi)彈性纖維降解明顯，僅殘留極少量的彈性纖維，血管內(nèi)膜、中膜、外膜之間的彈力層消失；傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組大鼠AAA內(nèi)彈性纖維部分降解，呈不連續(xù)狀，血管內(nèi)膜、中膜、外膜之間的彈力層部分可見（圖3）。彈性纖維定量分析結(jié)果顯示，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組大鼠AAA內(nèi)彈性纖維含量為（6.45±2.37）%，明顯低于傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組大鼠的（14.54±6.31）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=-5.599，P＜0.01）。

圖3 不同大鼠模型AAA內(nèi)彈性纖維染色圖（×10）

2.4 炎性細胞浸潤情況的比較

IHC結(jié)果顯示，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組大鼠AAA 內(nèi)的巨噬細胞浸潤明顯，主要聚集在血管外膜區(qū)域；傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 組大鼠AAA 內(nèi)存在明顯的巨噬細胞浸潤，集中在血管外膜和中膜交界區(qū)域（圖4）。每個高倍鏡視野下，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組與傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE組大鼠AAA 內(nèi)巨噬細胞數(shù)量分別為（32.44±15.72）個和（29.64±12.12）個，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.685，P＞0.05）。

圖4 不同大鼠模型腹主動脈組織的IHC圖

3 討論

理想的疾病動物模型不僅應表現(xiàn)出疾病的病理學特征，還應具有操作簡單可行、經(jīng)濟實用的特點[14-15]。根據(jù)本研究結(jié)果可得出以下結(jié)論：第一，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 大鼠模型具有彈性纖維降解及炎癥細胞浸潤等AAA 典型的病理特征。第二，與傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作的AAA 相比，改良AAA 大鼠模型的制作方法簡單可行，具有成瘤時間短、成瘤率高的優(yōu)點。第三，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型的手術時間和PPE用量更少，節(jié)省財力和人力成本。因此，改良AAA 大鼠模型可為研究者探索AAA 發(fā)病機制、相關治療方案等提供可靠的研究工具。

傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作AAA 模型的主要技術要點是需從大鼠一側(cè)髂動脈或股動脈穿刺，將穿刺針送至目標段腹主動脈腔內(nèi)并灌注PPE，分離髂動脈或股動脈需要更多的手術時間，實驗動物也需經(jīng)受更大的手術創(chuàng)傷[16]。本研究所述的改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作AAA 大鼠模型采用直接穿刺目標段腹主動脈的方式，減少了因分離髂動脈或股動脈而引起的創(chuàng)傷。本研究結(jié)果顯示，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作的AAA 大鼠模型的手術時間明顯短于傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作的AAA 大鼠模型，每只小鼠消耗的PPE 用量明顯少于傳統(tǒng)AAA 大鼠模型，這主要得益于目標段腹主動脈腔內(nèi)良好的密閉性進而減少了PPE 外溢[17]。

超聲檢查結(jié)果顯示，術后7 d，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型組的AAA 成瘤率為100%，而傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 大鼠模型組的AAA 成瘤率僅為40%。既往研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作的AAA 大鼠模型多于術后2周形成，本研究所述的改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作的AAA 大鼠模型能夠加速AAA的形成[18]。術后14 d，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型的腹主動脈擴張率均明顯高于與傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作AAA 大鼠模型，兩組腹主動脈瘤的成瘤率比較，差異無統(tǒng)計學意義，這可能與實驗動物樣本量少有關，仍待后續(xù)大樣本量研究進一步證實。

彈性纖維染色結(jié)果顯示，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型組腹主動脈壁內(nèi)彈性纖維降解程度較傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作AAA 模型組更嚴重，這可能與改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE 制作的AAA 模型在灌注過程中具有穩(wěn)定的灌注壓力及滲入腹主動脈壁內(nèi)的PPE 更多有關[19]。明顯的彈性纖維降解是改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型AAA 成瘤率和腹主動脈擴張率更高的潛在原因，但仍需更多的研究進一步證實[20]。IHC 結(jié)果顯示，兩種模型腹主動脈壁內(nèi)的炎癥細胞類型主要為巨噬細胞，且兩組的巨噬細胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義。

改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA的注意事項包括以下4個方面：第一，完全阻斷目標段腹主動脈的側(cè)支血管，其目的是保持腹主動脈的腔內(nèi)密閉性，避免PPE溶液在灌注過程中隨著側(cè)支血管進入體循環(huán)，這樣既有利于PPE灌注壓力的維持，也能避免PPE溶液進入體循環(huán)而引起實驗動物死亡[21]。第二，目標段腹主動脈的側(cè)支血管采用非接觸式血管阻斷，即側(cè)支血管連同其周圍組織一并阻斷，避免側(cè)支血管損傷導致PPE溶液滲漏至腹腔內(nèi)，這是降低實驗動物病死率的又一個關鍵環(huán)節(jié)。第三，目標段腹主動脈的側(cè)支血管阻斷均是暫時性操作，待PPE灌注結(jié)束以后均解除側(cè)支血管的阻斷并恢復血流。第四，在PPE灌注結(jié)束時，吸出腹主動脈腔內(nèi)的PPE并使用生理鹽水沖洗3遍，以減少殘余PPE進入血液循環(huán)而引起實驗動物死亡。

本研究存在一定的不足之處：（1）納入的實驗動物數(shù)量有限，未來的研究可納入更多的實驗對象進一步驗證改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型的有效性；（2）隨訪周期短，今后可通過延長隨訪時間來觀察改良AAA大鼠模型的遠期存活率。

綜上所述，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 大鼠模型具有典型AAA 病理特點，該模型制作方法具有成瘤率高、成瘤時間短、造模成本低的優(yōu)點。此外，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型的腹主動脈擴張率明顯高于傳統(tǒng)腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE制作AAA 模型，改良腹主動脈腔內(nèi)灌注PPE有望成為制作巨大AAA 模型的潛在方法，但仍需更多的研究證實。