大負荷運動后骨骼肌核心時鐘基因Bmal1/Clock、Cry1/Per1的節(jié)律性振蕩變化趨勢

丁海麗，傅澤鋌，夏雨

生命的各種行為、生理和代謝功能都具有生物節(jié)律。生物節(jié)律是指生命活動按一定時間順序、周而復始地發(fā)生變化的節(jié)律，主要由生物鐘和外界環(huán)境信號共同調控（Dibner et al.， 2010）。生物鐘本質上是一組構成自主節(jié)律振蕩的時鐘基因，其周期性特異表達形成的“轉錄—翻譯—反饋”環(huán)路（transcriptional-translational feedback loop，TTFL）是生物節(jié)律核心分子機制（Harfmann et al.， 2015；Takahashi， 2017）。系列研究表明，哺乳動物時鐘基因變異與腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡、腎功能異常、呼吸道過敏性疾病、骨代謝疾病等密切相關（程馮麗 等，2021；劉程程 等，2021；熊勇紅 等，2020；余明芳 等，2020；Thaiss et al.， 2014；Voigt et al.， 2016）。人體的生物節(jié)律尤其是晝夜節(jié)律能夠影響運動能力及運動表現(xiàn)，運動也能對生物節(jié)律產生反作用。骨骼肌作為運動的動力結構和直接效應器官，可受到時鐘基因調節(jié)參與各項生理功能與活動（Mayeuf-Louchart et al.， 2015）。而運動作為一種授時因子（zeitgeber）能夠影響骨骼肌節(jié)律變化，同時也受到骨骼肌固有時鐘的調控。因此，明確運動訓練后骨骼肌時鐘基因的變化趨勢、在觀測競技體育及運動促進健康的時間生物學效應、探討擇時訓練的內在機制、改善生物鐘失調導致的節(jié)律紊亂等方面具有重要意義。

在生物體內，生物鐘通過時鐘基因反饋回路自主產生晝夜節(jié)律。研究發(fā)現(xiàn)，大腦/肌肉芳香經受體核轉位因子樣蛋白1（brain and muscle ARNT-like1， Bmal1）、晝夜運動輸出周期蛋白（circadian locomoter output cycles protein kaput， Clock）、Period（Per）及Cryptochrome（Cry）等基因對哺乳類動物的生物鐘調控起著重要的作用（Keleher et al.， 2014）。哺乳動物體內的生物時鐘主要由2個轉錄翻譯反饋環(huán)路組成，包括核心環(huán)路和穩(wěn)定環(huán)路。核心環(huán)路的關鍵結構是轉錄因子Bmal1和Clock產物形成的異二聚體（Crnko et al.， 2019），Bmal1/Clock在TTFL中起正向調控作用，能夠與Per和Cry等其他時鐘基因的啟動子序列結合，激活其特異性表達并形成Per/Cry復合物，經蛋白質定向轉運返回細胞核，可反抑制Bmal1/Clock活性，從而以負反饋方式調控自身基因的轉錄（Curtis et al.，2014）。

運動表現(xiàn)能力與時間生物學因素密切相關，時鐘基因是導致運動表現(xiàn)差異的原因之一，Cry1/2作為過氧化物酶體增殖物激活受體δ（peroxisome proliferator-activator receptor，PPARδ）共抑制因子可調控運動能力（Jordan et al.，2017）；Per1/2雙敲除小鼠在擇時運動中并未顯示出運動持續(xù)時間和血糖水平的差異（Ezagouri et al.， 2019）；肌肉特異性Bmal1基因敲除可致小鼠肌纖維類型向I型轉變（Vitale et al.， 2019）。運動還可以調控骨骼肌分子時鐘。研究發(fā)現(xiàn)計劃性運動可影響骨骼肌自身節(jié)律表達，使時鐘基因相位前移2～3個小時，而不影響中樞節(jié)律變化（Harfmann et al.， 2015）；去除嚙齒類動物骨骼肌運動神經元會導致晝夜節(jié)律轉錄活性失調（Nakao et al.， 2015）；盡管這些研究初步驗證了運動與骨骼肌生物節(jié)律的相互關系，但運動訓練過程中骨骼肌時鐘基因分子機制尚未被完全認識?；诖耍狙芯坎捎靡淮蜗缕屡芙⒋筘摵蛇\動大鼠模型，檢測骨骼肌組織Bmal1、Clock 、Cry1、Per1表達，分析其節(jié)律振蕩變化趨勢，旨在探討大負荷運動訓練與時鐘基因以及晝夜節(jié)律的關系，為運動表現(xiàn)、運動能力的外周生物節(jié)律機制提供實驗依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠208只，體質量（283.17±4.06）g，由成都達碩生物科技有限公司提供，在成都體育學院SPF級動物實驗室分籠飼養(yǎng)，室內溫度為22～25 ℃，濕度為60%～70%，自由飲食、飲水。實驗室光照與黑暗時間12 h交替，光照起始時間（zeitgeber time， ZT）為8∶00，光照結束時間（ZT12）為20∶00。實驗中動物處置符合國家科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規(guī)定，獲得成都體育學院倫理委員會批準［（2021）34號］。

1.2 實驗分組

大鼠實驗前適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為空白對照（Control，C）組和運動（Exercise，E）組，根據運動72 h內不同取材時相（ZT0、ZT6、ZT12、ZT18、ZT24、ZT30、ZT36、ZT42、ZT48、ZT54、ZT60、ZT66、ZT72），C組分為C0、C6、C12、C18、C24、C30、C36、C42、C48、C54、C60、C66、C72共13個亞組；E組分為E0、E6、E12、E18、E24、E30、E36、E42、E48、E54、E60、E66、E72共13個亞組。

1.3 運動方案

通過一次性下坡跑建立大鼠大負荷運動模型。E組經3天適應性喂養(yǎng)后，先采取2天適應性運動，具體運動方案：第1天：跑臺坡度0°，運動速度16 m/min，運動時間5 min；第2天：跑臺坡度0°，運動速度16 m/min，運動時間10 min；第3天不運動。同時C組正常喂養(yǎng)。適應性訓練完成后第4天清晨于6∶30開始運動，坡度-16°，速度16 m/min，運動時間90 min，跑完即刻與ZT0（08∶00）時相相同。

1.4 取材與樣本采集

按照不同時間進行分批取材。實驗大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血。用有齒鑷夾起大鼠腹股溝處皮膚，剝離多余結締組織，暴露完整肌肉，并將皮膚分離至跟腱部位，用止血鉗夾住大鼠足部，將跟腱翻折暴露，手術刀劃斷跟腱并用齒鑷提起，用手術刀劃開外層腓腸肌暴露出深層比目魚肌，冰冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，剔除結締組織。所有時相取右側組織置于液氮迅速冷凍后-80 ℃冰箱保存，待測RT-PCR實驗；每24 h取左側2 mm×3 mm組織塊投入2.5%戊二醛固定液，制備電鏡樣品。

1.5 透射電鏡觀察肌纖維超微結構

采用透射電鏡（型號JEM-1400PLUS，日本電子JEOL生產）觀察比目魚肌的肌原纖維特征，包括肌小節(jié)排列順序、肌節(jié)明/暗帶分布情況、線粒體改變情況。將骨骼肌切段后進行樣品預固定（3%戊二醛），接著再固定（1%四氧化鋨），經丙酮逐級脫水，按比例設置脫水劑的濃度（在100%濃度中更換3次），處理后的骨骼肌樣品使用脫水劑，后通過環(huán)氧樹脂包埋，制備約50 nm切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網，分別通過醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色10～15 min和1～2 min，透射電鏡觀察采圖。

1.6 實時熒光定量PCR檢測核心時鐘基因mRNA表達

將100 mg組織在液氮中磨碎，加入1 mL已預冷的TRIzol，依次采用氯仿、異丙醇、75%乙醇經反復離心分離提純樣本總RNA，經超微量紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度后，將RNA逆轉錄合成cDNA。

采用PIKORed 96（ThermoFisher生產，美國）實時熒光定量PCR測定Bmal1、Clock、Cry1、Per1的mRNA表達水平，PCR反應體系與反應條件見表1、表2。所有引物均交由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以ULTRAPAGE純化，引物序列見表3。使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析PCR過程各檢測樣本的CT（Threshold cycle）值。通過2-△△CT計算X相對mRNA表達水平。

表1 PCR反應體系Table 1 PCR Reaction System

表2 PCR反應條件Table 2 PCR Reaction Conditions

表3 PCR引物序列Table 3 PCR Primer Sequence

1.7 數(shù)據統(tǒng)計與分析

所得數(shù)據以平均數(shù)±標準差（M±SD）表示。使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理。對所得數(shù)據進行正態(tài)性檢驗，比較符合正態(tài)分布的兩組獨立樣本時采用Student’st檢驗，方差齊性時采用LSD檢驗，方差不齊時用Welch’s校正檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性。

應用余弦分析軟件circacompare （R package） 獲取擬合余弦曲線參數(shù)，其擬合的余弦函數(shù)方程為Y=Mesor＋Amplitude*cos（time_Radians-φ），其中Mesor為基線/中值；Amplitude為節(jié)律震蕩的振幅；time_Radians為時間所對應的弧度值；φ為峰值相位。

2 研究結果

2.1 各組骨骼肌核心時鐘基因表達的節(jié)律分析

C組擬合余弦函數(shù)曲線顯示，Bmal1 mRNA于ZT0.25處于峰值，隨后下降到ZT12.25為谷值，然后回升至ZT24完成一個周期節(jié)律振蕩；Clock mRNA于ZT5.43處于峰值，隨后下降到ZT17.43為谷值，然后回升至ZT24完成一個周期節(jié)律振蕩；Cry1 mRNA于ZT1.20處于谷值，隨后上升到ZT13.20為峰值，然后回落至ZT24完成一個周期節(jié)律振蕩；Per1 mRNA于ZT0.42處于谷值，隨后上升到ZT12.42為峰值，然后回落至ZT24完成一個周期節(jié)律振蕩。在之后2天中， Bmal1、Clock、Cry1、Per1 mRNA的變化趨勢與0～24 h相似，72 h內共呈現(xiàn)3個完整近日節(jié)律（圖1～4，表4）。

圖1 Bmal1 mRNA 表達及擬合余弦函數(shù)節(jié)律性變化Figure 1. Bmal1 mRNA Expression and the Rhythmic Changes of the Fitted Cosine Function

圖2 Clock mRNA 表達及擬合余弦函數(shù)節(jié)律性變化Figure 2. Clock mRNA Expression and the Rhythmic Changes of the Fitted Cosine Function

圖3 Cry1 mRNA 表達及擬合余弦函數(shù)節(jié)律性變化Figure 3. Cry1 mRNA Expression and the Rrhythmic Changes of the Fitted Cosine Function

圖4 Per1 mRNA 表達及擬合余弦函數(shù)節(jié)律性變化Figure 4. Per1 mRNA Expression and the Rhythmic Changes of the Fitted Cosine Function

E組擬合余弦函數(shù)曲線顯示，Bmal1 mRNA在0～24 h近日節(jié)律消失，24～48 h與48～72 h恢復近日節(jié)律；Clock mRNA在0～72 h近日節(jié)律消失；Cry1 mRNA在0～24 h近日節(jié)律消失，24～48 h恢復近日節(jié)律；Per1 mRNA在0～24 h近日節(jié)律消失，24～48 h恢復近日節(jié)律（圖1～4，表4）。

2.2 各組對應時相骨骼肌核心時鐘基因表達的比較分析

統(tǒng)計結果顯示，E組Bmal1 mRNA呈現(xiàn)先升高，后趨于正常的狀態(tài)，在0、6、12和18 h顯著高于C組對應時相（P＜0.05）；Clock mRNA變化趨勢與Bmal1 mRNA相似，在0 h差異顯著（P＜0.05）；Cry1 mRNA在0、12 h顯著低于C組對應時相（P＜0.05）；Per1 mRNA變化趨勢與Cry1 mRNA基本相同，在0、12 h顯著低于C組對應時相（P＜0.05；表4，圖5）。

圖5 E組與C組同一時相Bmal1、Clock、Cry1、Per1 mRNA的相對表達變化Figure 5. Relative Expression Changes of Bmal1， Clock， Cry1 and Per1 mRNA in Group E and Group C at the Same Timepoint

2.3 各組骨骼肌纖維超微結構變化

透射電鏡下觀察肌纖維超微結構（圖6）發(fā)現(xiàn)，C組在0、24、48和72 h各時相肌原纖維分布均勻，A帶與I帶分界清楚、排列規(guī)則，Z線清晰，線粒體排列整齊、形態(tài)完整。E組0、24和48 h出現(xiàn)不同程度的Z線加寬、斷裂，A帶與I帶分界不清，線粒體腫脹并聚集在肌膜下，72 h雖有所緩解，但仍未完全恢復。

圖6 各組大鼠骨骼肌纖維超微結構Figure 6. Ultrastructure of Skeletal Muscle Fibers in Each Group of Rats

3 分析討論

晝夜時間（circadian time，CT）0時，Bmal1和Clock形成異二聚體，作用于Cry、Per等靶基因的 E 反應元件（Ebox，CACGTG）并啟動轉錄過程，Cry基因的表達產物和Per基因的表達產物可形成復合物，在細胞核中不斷積蓄并反饋抑制Bmall/Clock異二聚體驅動的E-box表達。CT12—CT24期間，Per和Cry的mRNA水平下降，現(xiàn)有Per/Cry復合物降解，以上過程進行約24 h周期循環(huán)，形成了生物鐘調控網絡的TTFL（黃增浩 等，2020）。本研究對未施加干預的對照組SD大鼠骨骼肌Bmal1和Clock、Per和Cry的mRNA進行檢測，并獲取擬合余弦曲線參數(shù)分析其變化趨勢，發(fā)現(xiàn)72 h內上述基因均呈現(xiàn)3個完整近日節(jié)律周期，即晝夜節(jié)律振蕩。進一步分析其振蕩曲線的峰值與谷值，發(fā)現(xiàn)Bmal1在CT0—CT12期間由波峰降至波谷，在CT12—CT24期間回升至波峰，Clock的表達趨勢與Bmal1基本一致，而Per1和Cry1的擬合曲線則與Bmal1和Clock呈現(xiàn)反向振蕩，以上4個基因周期性特異表達形成的振蕩規(guī)律與生物節(jié)律核心分子機制——TTFL相吻合。經轉錄組學研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌中3.4%～16.0%的基因是以節(jié)律性方式表達，其表達的Baml1、Rev-erbα、Clock等時鐘基因不僅可維持晝夜節(jié)律穩(wěn)定調節(jié)，而且通過激活相關信號轉導通路或其他作用途徑，參與調控骨骼肌機能（Perrin et al.， 2018）。本研究基于骨骼肌時鐘基因特異性節(jié)律表達，主要檢測和分析了Bmal1/Clock、Cry1/Per1 mRNA晝夜變化趨勢，實驗結果進一步佐證了骨骼肌組織作為外周時鐘的關鍵作用，表明骨骼肌表達的核心時鐘基因參與維持晝夜節(jié)律的穩(wěn)定輸出。

骨骼肌不僅作為外周組織表達時鐘基因維持生物節(jié)律，還受到時鐘基因調控參與各項生理活動。運動表現(xiàn)、運動能力與時間密切相關（黃華生 等， 2016； Faull et al.，2015），有研究發(fā)現(xiàn)跨時區(qū)產生的時差變化可影響運動表現(xiàn)能力，與向西跨經度旅行相比，向東跨經度旅行可使人體在間歇性短跑運動中表現(xiàn)下降、疲勞感更強（Fowler et al.，2017）。時鐘基因是運動表現(xiàn)差異的原因之一，人體實驗研究發(fā)現(xiàn)，以股四頭肌為測試對象，受試者在進行45 min抗阻訓練后6 h和18 h，Bmal1、Cry1和Per2的mRNA表達顯著升高（Zambon et al.， 2003）；70 min、70% V.O2max強度的自行車運動后4 h和8 h，股外側肌Bmal1 mRNA表達顯著升高，而Per1 mRNA表達顯著降低（Popov et al.， 2018）；15 min 80% V.O2max強度的自行車運動后60 min，股外側肌中Per1和Per2的表達增加1.5倍，而Bmal1和Cry1沒有變化（Small et al.， 2020）?？梢?，不同形式、不同強度以及不同時間的一次運動后，人體骨骼肌中核心生物鐘基因的表達變化并不一致（嚴露 等，2021）。深入了解運動與骨骼肌時鐘基因節(jié)律振蕩的關系，有利于深入探究肌肉運動能力的時間調節(jié)機制、擇時運動如何增強運動效果以及過度訓練如何影響機能狀態(tài)。本研究采用可誘發(fā)骨骼肌微損傷的一次離心運動經典模型，試圖明確大負荷運動能否影響骨骼肌時鐘基因固有節(jié)律表達。實驗結果發(fā)現(xiàn)，Bmal1、Cry1、Per1在運動后第1天（0～24 h）均出現(xiàn)近日節(jié)律消失，第2天（24～48 h）和第3天（48～72 h）基本恢復，相較而言，Clock最為敏感，72 h內的3個近日節(jié)律均受到破壞，表明一次大負荷離心運動可誘發(fā)骨骼肌核心時鐘基因節(jié)律振蕩紊亂，但因具體分子鐘的不同，其周期性變化呈現(xiàn)特有的振幅和相位表達。

晝夜節(jié)律時鐘基因大都存在亞型而顯示功能冗余，如Cry與Per家族中Cry1、Cry2、Per1、Per2，若敲除單個基因并不會出現(xiàn)明顯表型變化，而敲除Cry1/2、Per1/Per2雙重基因才能破壞相應基因功能（Aoyama et al.， 2017）。Bmal1作為一種非冗余時鐘基因，敲除后可導致生物鐘完全紊亂（Schiaffino et al.， 2016）。Bmal1/Clock異二聚體、Cry/Per復合物是TTEL核心環(huán)路的關鍵結構，因此，需要在整體分析其作用效應的同時，進一步分析各分子的具體變化。本研究中，一次大負荷運動后Bmal1在0～24 h近日節(jié)律消失，且無論是光照還是運動刺激后，均在CT0左右即出現(xiàn)顯著變化，而Clock在0～72 h內3個近日節(jié)律全部消失，推測Bmal1可能作為始動因子，首先影響B(tài)mal1/Clock異二聚體結構，進而調控Cry/Per復合物，形成核心環(huán)路4個分子鐘的周期性表達變異，在此過程中，Clock可能具有對運動更為敏感的特異性。然而，大負荷運動后時鐘基因出現(xiàn)上述節(jié)律振蕩紊亂的具體作用機制及其帶來的后續(xù)效應，仍需要進一步探究。

一次大負荷運動模型可誘發(fā)運動性骨骼肌損傷，有研究認為骨骼肌質量與肌纖維結構、功能受到時鐘基因調控。Clock-/-小鼠可致骨骼肌肌絲結構破壞，單個肌纖維肌力水平下降（Andrews et al.， 2010）；Bmal1-/-小鼠骨骼肌粗細肌絲超微結構破壞，線粒體腫脹、體積減小（Dyar et al.，2016），但具體途徑尚不明確，是否和生物節(jié)律中斷或時鐘基因振蕩紊亂相關，還是中樞或其他外周組織的繼發(fā)效應所致有待進一步探索。本研究在每個近日節(jié)律周期始末觀察肌纖維超微結構，同時分析比較E組與C組對應時相基因表達差異，結果發(fā)現(xiàn)，在近日節(jié)律表達均受到破壞的0～24 h，E組相較C組出現(xiàn)顯著變化，肌纖維超微結構損傷在0、24 h也較為明顯，24～48 h時Clock節(jié)律未恢復且Bmal1節(jié)律發(fā)生偏移，而48 h時相的肌纖維超微結構仍有損傷現(xiàn)象，在48～72 h，隨著大部分核心時鐘基因近日節(jié)律的恢復，肌纖維超微結構損傷也明顯減輕，表明時鐘基因以及骨骼肌生物節(jié)律可參與運動誘發(fā)的肌纖維結構改變，機體生物鐘與外界生物鐘失去同步性有可能加速運動性骨骼肌損傷的發(fā)展。綜上，本研究通過檢測Bmal1/Clock、Cry1/Per1的mRNA表達，分析時相變化及其與肌纖維結構損傷的關系，初步闡釋了大負荷運動后骨骼肌核心時鐘基因的節(jié)律性振蕩趨勢，為運動員對抗或減輕大運動量訓練后時鐘基因變化對機體的影響，科學合理安排訓練計劃并預防運動損傷，以及應對跨時區(qū)、洲際參賽引起的晝夜節(jié)律紊亂等問題提供了實驗依據與參考。

4 結論

大鼠骨骼肌核心時鐘基因Bmal1/Clock、Cry1/Per1呈現(xiàn)晝夜節(jié)律振蕩趨勢，一次大負荷運動可誘發(fā)上述時鐘基因節(jié)律紊亂，其時相變化與骨骼肌纖維超微結構損傷相一致。