兩株GI.1型和GI.2型兔出血癥病毒RdRp基因的克隆與分析

龐雪晴,唐 詩,曾紅梅,趙 位,王 印,羅 燕,姚學萍,任梅滲,任永軍,楊澤曉,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,四川 成都 611130; 2.四川省畜牧科學研究院,四川 成都 610066)

兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)是引起兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease,RHD)的主要病原,屬于杯狀病毒科兔病毒屬的未折疊單股正鏈RNA病毒[1],35 nm的病毒粒子包含7.4 kb的基因組RNA和額外的2.1 kb的亞基因組RNA片段,基因組和亞基因組RNA均在3′端進行多聚腺苷化,并在5′端與基因組結合蛋白(genome-linked protein)共價連接[2]?；蚪MRNA包含兩個狹窄重疊的開放閱讀框(ORF),即 ORF1(10～7 044 bp)和ORF2(7 025～7 378 bp)。其中 ORF1翻譯為一個大的多聚蛋白,該蛋白被切割成幾個非結構蛋白(螺旋酶、VPg和RdRp等)和主要結構蛋白——衣殼蛋白VP60,ORF2編碼一種次要結構蛋白VP10[3-4]。

1984年我國首次報道RHD,由于RHD具有高度傳染性,在疾病暴發(fā)的一年時間里迅速在亞洲、歐洲和非洲蔓延[5]。1998年在意大利檢測到RHDV的第一株抗原變異[6],被命名為RHDVa,隨著變異毒株的不斷發(fā)現(xiàn),RHDV最初根據(jù)其在系統(tǒng)發(fā)育樹的位置和抗原特性,分為G1、G2、G3、G4、G5和G6/RHDVa等幾種不同亞型[7]。直到2010年,法國一家已免疫了RHD疫苗的兔場暴發(fā)了非典型RHD,即RHDV2,分離得到的新毒株基因序列及抗原性與經(jīng)典株有較大差異,兩者之間交叉免疫較弱[8],該病毒在西班牙、英國(蘇格蘭)、意大利、澳大利亞等國家廣泛傳播。隨后,Le Pendu等[9]基于系統(tǒng)發(fā)育和遺傳距離提出了新的命名法,即將經(jīng)典RHDV和RHDV2分別歸類于LagovirusEuropaeus, GI.1、GI.2。

研究表明,RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)參與RHDV RNA的復制[2]。RdRp已被證明能催化VPg尿苷化,從而使得VPg作為蛋白質(zhì)引物啟動基因組RNA和亞基因組RNA的復制,而RHDV RdRp前體比成熟酶更有效地催化VPg尿苷化[10]。RdRp的形狀類似右手,分為手指結構域,手掌結構域和拇指結構域,酶的活性位點位于手掌結構域中,其結構是高度保守的。到目前為止,已經(jīng)鑒定出7個高度保守的氨基酸序列基序：4個在手掌域的基序(基序A、B、C和D),1個在拇指域的基序(基序E),2個在手指域的基序(基序F和G)[11]。這些短功能基序具有高度保守的氨基酸序列,基序B、D、E和F參與核苷酸識別和配位,基序B和G協(xié)調(diào)模板和引物結合,基序A和C執(zhí)行核苷酸結合的催化作用[12]。RHDV RdRp不只發(fā)揮復制酶的作用,還具有能與細胞內(nèi)膜相互作用從而改變高爾基體結構的能力[13],因此RdRp可能在復制復合物的建立過程中發(fā)揮關鍵作用。RHDV主要由RdRp復制自身遺傳物質(zhì),這種酶沒有修復復制過程中產(chǎn)生的錯配的能力[14],對病毒適應環(huán)境甚至適應新宿主的能力和病毒演變方面有著重要影響。

VP60作為RHDV的主要結構蛋白和抗原蛋白,其核苷酸序列一直被用于新毒株的系統(tǒng)發(fā)育、免疫和診斷研究[15-16]。相對于VP60,RdRp在RHDV的生物合成與遺傳變異研究方面更具有參考意義,然而國內(nèi)外關于RdRp在此方面的研究相對較少。為了解RHDV RdRp基因的遺傳穩(wěn)定性及其在RHDV演變中的變異情況。本研究克隆了RHDV SCH04株和RHDV2 SCCN03株RdRp基因,并對其進行序列對比分析和編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜區(qū)域、二級結構、磷酸化和糖基化修飾位點的預測等生物信息學分析,為RHDV病原學研究以及感染的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

pMD19-T克隆載體、DH5α感受態(tài)細胞、2×TaqMaster Mix、DNA Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司。RNA提取試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司。兔出血癥病毒分離株SCH04與SCCN03由四川農(nóng)業(yè)大學動物檢疫實驗室保存。

1.2 引物的設計與合成

參照GenBank中RHDV和RHDV2基因序列(登錄號：KY171748和MN901451)分別設計RdRp擴增引物。P1：5′-ACATCAAACTTCTTCTGTGGCG-3′;P2：5′-CTCCATAACATTCACAAATTCGTCGT-3′;P3：5′-ACATCAAACTTTTTCTGTGGTGAACC-3′;P4：5′-CTCCATAACATTCACAAACTCGTCG-3′。

1.3 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

將病料組織在研缽中充分研磨并加入生理鹽水制成組織懸液,參考RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA,置于-70 ℃超低溫冰箱保存。測定總RNA濃度,取500 ng總RNA,加入5×反轉(zhuǎn)錄試劑Mix 2 μL,隨后加入RNase free water至10 μL。將混合物混勻瞬時離心后,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃循環(huán),獲得cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RdRp基因的擴增

以獲得的cDNA作為模板,使用高保真酶(Pfu),用設計的特異性引物擴增RdRp基因片段。PCR體系為：2×PfuPCR Mix 25 μL,cDNA 4 μL,上下游引物各2 μL,加ddH2O至50 μL。擴增產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進行回收,隨后按照pMD19-T克隆載體試劑盒使用說明將目的片段與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中,培養(yǎng)并經(jīng)過抗性篩選后,挑取陽性克隆菌落進行測序。

1.5 RdRp的生物信息學分析

利用DNAstar和DNAMAN軟件對SCH04株和SCCN03株RdRp基因進行序列比對分析;利用MEGA 7.0軟件基于RdRp基因核苷酸序列對于下載的RHDV各毒株進行遺傳距離分析和系統(tǒng)進化樹的構建;利用ExPASy在線軟件(https：//web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì);利用TMHMM-2.0在線軟件(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預測編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域;利用SignalP-5.0在線軟件(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)分析編碼蛋白的信號肽;分別利用NetPhos-3.1(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)和NetNGlyc-1.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)在線軟件對編碼蛋白的磷酸化位點和糖基化位點進行預測分析;利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線軟件預測編碼蛋白質(zhì)的二級結構;利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)在線軟件預測編碼蛋白質(zhì)的三級結構。

2 結果與分析

2.1 RdRp基因的克隆結果

以從病料中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得產(chǎn)物大小為1 548 bp(圖1),與預期片段大小相符。測序結果與GenBank已公布的對應序列一致性分別為99.94%和99.48%,并上傳GenBank獲得序列號分別為KX844830,MW178245。

M,DNA分子量標準;1,SCH04株 RdRp基因擴增產(chǎn)物;2,SCCN03株 RdRp基因擴增產(chǎn)物。M, DNA marker; 1： Amplification product of RdRp gene of SCH04 strain; 2, Amplification product of RdRp gene of SCCN03 strain.圖1 RdRp基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of RdRp gene

2.2 基于RdRp基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹

從NCBI下載45株GI.1型和14株GI.2型RHDVRdRp基因序列,并選擇2株兔杯狀病毒(RCV)的RdRp基因序列作為對照序列(表1)。使用MEGA7.0軟件進行比對分析,計算遺傳距離,構建基于RdRp基因核苷酸序列的NJ樹(圖2)。

表1 RHDV、RCV各毒株的序列信息

圖中星號標注的分別為SCH04株與SCCN03株的序列號。The asterisks in the figure indicate the sequence numbers of SCH04 and SCCN03 strains.圖2 基于RdRp基因核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on RdRp gene nucleotide sequence

結果顯示,基于RdRp基因序列,GI.1a型RHDV各毒株間變異性為0.1%～5.7%;GI.1b型RHDV各毒株間變異性為1.6%～3.4%;GI.1c型RHDV各毒株間變異性為0.5%～2.2%;GI.1d型RHDV各毒株間變異性為0.5%～4.7%,GI.1所有亞型RHDV毒株間序列相似性為86.9%～99.9%,變異范圍為0.1%～13.1%。GI.2型RHDV毒株間序列相似性為91.3%～99.9%,變異范圍為0.1%～8.7%;GI.1型和GI.2型RHDV毒株間序列相似性為84.3%～88.3%,變異范圍為11.7%～15.7%。

從系統(tǒng)進化樹可以看出,SCH04株屬于GI.1中的GI.1a亞型,在該亞型中與其RdRp基因遺傳距離最近的是2007年分離的Sch07株(0.1%),遺傳距離最遠的是2005年分離的WHNRH株(5.9%),SCCN03株屬于GI.2型,與其RdRp基因遺傳距離最近的是2016年分離的RHDV2-NL2016株(1.5%),遺傳距離最遠的是2016年分離的16PLM1株(8.1%)。與1987年分離的參考毒株V-351的RdRp基因序列相比,SCH04株的核苷酸變異率為12.0%,SCCN03株的核苷酸變異率為13.4%。

2.3 RdRp基因序列分析

對SCH04株和SCCN03株的RdRp的核苷酸序列和氨基酸序列用DNAMAN進行比較分析顯示,SCH04株RdRp基因編碼區(qū)長1 548 bp,其中A、G、C、T含量分別為25%、26.74%、24.03%、24.22%,A+T含量(49.22%)略小于G+C含量(50.78%);SCCN03株RdRp基因編碼區(qū)長1548 bp,其中A、G、C、T含量分別為24.74%、27.67%、24.74%、23.45%,A+T含量(48.19%)略小于G+C含量(51.81%)。兩株RdRp的核苷酸序列相似性為84.95%。推導的氨基酸序列相似性為96.71%,分別在第45、71、109、366、373、385、390、395、397、430、442、447、469、472、476、480和485位氨基酸存在差異(圖3)。

圖3 RdRp氨基酸序列比對結果Fig.3 RdRp amino acid sequence alignment results

2.4 RHDV RdRp蛋白理化性質(zhì)分析

使用ProtParam在線軟件分析顯示,SCH04株和SCCN03株RdRp基因序列均編碼516個氨基酸,由20種氨基酸組成,其中占比最大的是亮氨酸(Leu),為9.5%;占比最小的是色氨酸(Trp),為1.4%。SCH04株分子量略小于SCCN03株,蛋白質(zhì)等電點、脂溶系數(shù)、平均親水系數(shù)和不穩(wěn)定系數(shù)均略高于SCCN03株(表2)。

表2 RdRp蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

2.5 RHDV RdRp蛋白信號肽和跨膜區(qū)域分析

經(jīng)SignalP-5.0和TMHMM2.0在線軟件預測結果顯示,SCH04株和SCCN03株RdRp蛋白均不存在信號肽和跨膜結構。

2.6 RHDV RdRp蛋白二級結構分析

經(jīng)SOPMA數(shù)據(jù)庫分析,SCH04株二級結構包含216個α螺旋(占比41.86%),57個延伸鏈(占比11.05%),22個β轉(zhuǎn)角(占比4.26%)和221個無規(guī)則卷曲(占比42.83%)。 SCCN03株二級結構則包含208個α螺旋(占比40.31%),66個延伸鏈(占比12.79%),18個β轉(zhuǎn)角(占比3.49%)和224個無規(guī)則卷曲(占比43.41%)(圖4)。相比SCH04株RdRp,SCCN03株RdRp的延伸鏈和無規(guī)則卷曲比例增加,而α螺旋和β轉(zhuǎn)角的比例則有所降低。

c,無規(guī)卷曲區(qū)域; h,α螺旋區(qū)域; e,延伸鏈區(qū)域; t,β轉(zhuǎn)角區(qū)域。c,Random coil; h,α helix; e,Extended chain; t,β turn.圖4 SCH04株RdRp(A)和SCCN03株RdRp(B)二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of RdRp of strain SCH04 (A) and RdRp of strain SCCN03 (B)

2.7 RHDV RdRp蛋白磷酸化位點和糖基化位點分析

經(jīng)NetPhos-3.1在線軟件分析顯示,SCH04株含有22個絲氨酸(Ser) 磷酸化位點,11個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和9個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。SCCN03株含有23個絲氨酸(Ser) 磷酸化位點,13個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和9個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(圖5)?？傮wSCCN03株的RdRp蛋白比SCH04株多4個磷酸化修飾位點。

圖5 SCH04株RdRp(A)和SCCN03株RdRp(B)磷酸化修飾位點預測Fig.5 Prediction of phosphorylation modification sites of RdRp of SCH04 strain (A) and RdRp of SCCN03 strain (B)

經(jīng)NetNGlyc-1.0在線軟件分析顯示,SCH04株含有1個潛在的N-糖基化修飾位點(第238位氨基酸),SCCN03株含有2個潛在的N-糖基化修飾位點(第238位和第420位氨基酸)(圖6)?？傮wSCCN03株的RdRp蛋白比SCH04株多1個N-糖基化修飾位點。

圖6 SCH04株RdRp(A)和SCCN03株RdRp(B)糖基化修飾位點預測Fig.6 Prediction of glycosylation modification sites of RdRp of SCH04 strain (A) and RdRp of SCCN03 strain (B)

2.8 RHDV RdRp蛋白三級結構預測

使用SWISS-MODEL在線軟件對SCH04株和SCCN03株RdRp進行同源建模,結果顯示,SCH04株RdRp與SCCN03株RdRp模型GMQE值均為0.96、QMEANDisCo Global分值分別為0.92±0.05和0.91±0.05,模型置信度高(圖7)。兩種RdRp的結構相似性極高,無明顯結構差異。

圖7 SCH04株RdRp(A)和SCCN03株RdRp(B)三級結構預測Fig.7 Tertiary structure prediction of RdRp of SCH04 strain(A)and RdRp of SCCN03 strain (B)

3 討論

RdRp作為RHDV的復制酶,在基因組復制過程中不能對突變的堿基進行校正,還有研究表明,RHDV RdRp還具有誘導高爾基體結構發(fā)生重排的獨特能力,因此RdRp不僅是RHDV合成的關鍵酶,還可能與RHDV的毒力也有一定關系。2020年,Hukowska-Szematowicz[17]基于RHDV RdRp的基因序列對105株GI.1型和GI.2型毒株進行了系統(tǒng)發(fā)育分析,結果發(fā)現(xiàn),這些毒株遺傳距離在時間尺度和地理尺度上均有所增加,GI.2基因型毒株的RdRp基因具有比GI.1型毒株更高的突變潛力。本研究克隆了兩株GI.1型和GI.2型RHDVRdRp序列,并將其與另外59株GI.1型和GI.2型毒株RdRp基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析,結果顯示：本研究中GI.1 RHDV各亞型毒株和GI.2型RHDV各毒株之間變異范圍均處于Hukowska-Szematowicz[17]研究所得的變異范圍內(nèi)。SCH04株RdRp和SCCN03株RdRp的核苷酸變異性位于GI.1與GI.2的變異范圍內(nèi),符合遺傳變異規(guī)律。GI.2各毒株RdRp之間同源性高于GI.1,而與原始毒株相比,GI.2各毒株則比GI.1具有更高的變異性,與Hukowska-Szematowicz等[17]的研究結果相一致。隨著時間的推移,GI.2型RHDV是否會產(chǎn)生更多變異株應引起更多的關注。

據(jù)報道,重組諾如病毒GII.P16-GII.2毒株比之前的GII.P16-GII.2毒株的差別在于5個位于RdRp的氨基酸發(fā)生突變,從而導致了重組毒株在糞便中的載量更高,傳播速率也顯著增加[18-19],這表明RdRp中氨基酸的突變可能影響酶的活性或者復制時的保真度。目前,相關研究已鑒定了杯狀病毒的RdRp具有7個高度保守的氨基酸序列基序——基序A(250～259)、基序B(308～318)、基序C(353～355)、基序D(373～376)、基序E(400～404)、基序F(173～191)和基序G(123～134),RdRp功能的發(fā)揮都是由各基序相互配合實現(xiàn)的?；駾和酶與核苷酸識別和配位的效率以及與復制的保真度密切相關[20]。Smertina等[21]對RdRp進行分析,認為澳大利亞的RHDV2是獲得了一種相對快速的聚合酶從而具有較高的毒力和進化特征。Neimanis等[22]對成年及幼齡家兔進行RHDV2攻毒實驗,結果顯示與經(jīng)典RHDV一樣,RHDV2最先攻擊肝臟并以肝臟病變最為明顯,不同的是幼齡家兔還會發(fā)生急性腎炎且在腎臟中亦可檢測出病毒。將兩株RdRp的序列進行對比后發(fā)現(xiàn),兩株RdRp的氨基酸序列在17個位置存在差異。A、B、C、E、F、G基序所在氨基酸的位置高度保守,唯獨位于基序D的第一位氨基酸存在差異,SCH04株的第373位氨基酸為Glu,而SCCN03株的第373位氨基酸則是Asp。SCCN03株RdRp的第373位氨基酸的變化能否導致其基序D與核苷酸配位的效率發(fā)生變化進而影響病毒生物合成有待進一步研究。

磷酸化和糖基化等是蛋白質(zhì)重要的翻譯后修飾過程,對蛋白質(zhì)的生物學活性有顯著影響[23]。糖基化修飾對蛋白的折疊尤為重要,例如不同亞型RHDV的VP60可能因發(fā)生不同的N-糖基化修飾從而引起致病性的不同,有研究學者對非致病性RCV的潛在N-糖基化修飾位點進行預測,發(fā)現(xiàn)其相對于致病性RHDV缺失多個潛在N-糖基化修飾位點,證明N-糖基化修飾可能影響RHDV的致病性[24]。而RHDV2是一個可以跨物種感染的兔病毒屬成員[25],宿主范圍廣,本研究通過比較分析發(fā)現(xiàn),SCCN03株RdRp比SCH04株多4個磷酸化位點和1個潛在N-糖基化位點,這也可能與其蛋白質(zhì)的結構和與宿主的相互作用相關。

綜上所述,SCH04株與SCCN03株RdRp的核苷酸序列差異性較大,而氨基酸序列同源性卻高達96.71%,大部分的堿基差異為同義變異,并且通過二級結構和三級結構預測的結果表明二者的空間結構相似度極高,綜合生物信息學分析結果,推測二者功能差異不顯著。這為基于RdRp進行RHDV分子病原學研究提供了科學參考與理論依據(jù)。